三维支架材料与脂肪干细胞的生物相容性

背景：构建组织工程化气管需要适合的三维支架。目的：观察脂肪干细胞与聚乳酸-乙醇酸共聚物及聚三亚甲基碳酸酯共聚物支架的生物相容性。方法：采用组织块法原代分离培养SD大鼠脂肪干细胞,行流式细胞术及多向分化能力鉴定。将脂肪干细胞分别种植于聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乳酸-乙醇酸-三亚甲基碳酸酯共聚物支架中,扫描电镜观察细胞与支架的生物相容性。结果与结论：脂肪干细胞种植于两种支架材料后生长速度快,扫描电镜观察可见脂肪干细胞呈球型,并伸展形成伪足,贴附于支架材料,细胞间相互连接成团。说明聚乳酸-乙醇酸共聚物与聚三亚甲基碳酸酯共聚物支架均具有良好的生物相容性,无细胞毒性,其多孔的三维立体状结构适合脂肪干细胞黏附生长。     

三维支架材料与脂肪干细胞的生物相容性

背景:构建组织工程化气管需要适合的三维支架。目的:观察脂肪干细胞与聚乳酸-乙醇酸共聚物及聚三亚甲基碳酸酯共聚物支架的生物相容性。方法:采用组织块法原代分离培养SD大鼠脂肪干细胞,行流式细胞术及多向分化能力鉴定。将脂肪干细胞分别种植于聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乳酸-乙醇酸-三亚甲基碳酸酯共聚物支架中,扫描电镜观察细胞与支架的生物相容性。结果与结论:脂肪干细胞种植于两种支架材料后生长速度快,扫描电镜观察可见脂肪干细胞呈球型,并伸展形成伪足,贴附于支架材料,细胞间相互连接成团。说明聚乳酸-乙醇酸共聚物与聚三亚甲基碳酸酯共聚物支架均具有良好的生物相容性,无细胞毒性,其多孔的三维立体状结构适合脂肪干细胞黏附生长。     

适宜于构建组织工程化脂肪的蚕丝蛋白支架:最佳孔径筛选

背景:既往组织工程脂肪的研究中,支架材料的孔径往往被忽略.如孔径过大,细胞会顺着过大的孔隙流走,难以保留在支架中;孔径过小,细胞则主要分布于支架材料的表面,不易进入支架中,同时也不利于新生血管生长.目的:筛选用于构建组织工程脂肪的蚕丝蛋白支架的适宜孔径.方法:在保持蚕丝蛋白浓度不变条件下,通过改变冷冻干燥温度与时间,制备出6批次不同孔径的蚕丝蛋白支架;贴壁法分离脐带间充质干细胞,化学染色检测其体外诱导成骨和成脂的能力;电镜下测定6批次蚕丝蛋白支架的孔径;观察脐带间充质干细胞在不同孔径蚕丝蛋白支架上黏附、增殖的能力.结果与结论:6批次蚕丝蛋白支架的孔径分别为:(39.94±17.27),(53.51±16.18),(63.97±19.76),(71.08±18.07),(87.33+21.78),(121.97+44.10)μm.脐带间充质干细胞在2号支架材料上黏附良好,并充分伸展,而第1,3,4,5,6号支架材料,除第1,3号支架上偶见细胞外,其余支架材料上均未见细胞生长.由此说明人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪时,支架材料的最佳孔径为50 μm.     

组织工程化脂肪的构建与应用

背景:软组织缺损的修复是整形外科的重要难题,而目前用于临床治疗的各种方案都存在一定缺陷.目的:对脂肪组织工程的研究现状进行相应的探讨,分析目前所采用方案的缺陷,并对其将来可能的临床应用进行相应展望.方法:以adipose tissue engineering,mesenchymal stem cells,derived from adipose tissue为检索词,检索Medline数据库(1991-01/2009-05);以脂肪,组织工程,间充质干细胞为检索词,检索中国期刊全文数据库(1991-01/2009-05).文献检索语种限制为英文和中文.纳入与组织工程化脂肪组织构建相关的内容,排除重复研究.结果与结论:计算机初检得到342篇文献,根据纳入排除标准,对33篇进行分析.在探索软组织缺损治疗方法的过程中发现:组织工程技术能以少量种子细胞,经体外扩增后与生物材料复合,修复较大的组织或器官缺损,重建生理功能,为真正实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新的途径.当前已有多种成功构建脂肪组织的策略用于治疗软组织缺损,这将给填充脂肪组织修复软组织缺损开辟广阔的天空.     

脂肪干细胞三维生长骨组织工程复合体的构建

背景：组织工程支架是模仿细胞赖以生长代谢的细胞外基质而构建的支架和环境,其选择、制备以及种子细胞的选择是骨组织工程领域中的一项十分重要的课题.目的：利用几丁质凝胶/异种骨构建脂肪干细胞三维生长环境,并对其相容性进行研究.方法：从出生8d新西兰大白兔腹股沟获取脂肪组织,提取脂肪干细胞.脂肪干细胞经过体外成骨诱导分化后,种植于几丁质凝胶/异种骨,构建新型骨组织工程复合体,并将其设为细胞/几丁质凝胶/异种骨组;将脂肪干细胞直接种植于异种骨,构成脂肪干细胞/异种骨复合体作为细胞/异种骨组,单独异种骨为空白组.体外诱导2周后进行电镜扫描,观察细胞与支架的复合情况.结果与结论：镜扫描观察显示几丁质凝胶充分渗透于支架的空隙内,形成一个细胞的三维生长环境,使原本只能在材料上贴壁生长的脂肪干细胞能够在三维的环境中生长,为细胞外基质的再生提供足够的空间.几丁质凝胶/异种骨悬浮诱导后的脂肪干细胞,承载了更多的细胞,减少了细胞在载体中的流失,是一种较好的骨组织工程载体.     

间充质干细胞构建组织工程化气管的研究与应用

背景：间充质干细胞诸多特有的良好生物学特性使得其在组织工程化气管研究中成为理想的种子细胞来源。目的：总结间充质干细胞在构建组织工程化气管领域的研究现状、进展、存在的问题及展望。方法：由作者检索PubMed数据库及CNKI数据库1979至2012年,在英文标题和摘要中以＂mesenchymal stem cells,tissue-engineered trachea＂和＂tracheal chondrocytes,tracheal epithelial cells,tracheal vascular endothelial cells＂检索,中文文献检索中以＂间充质干细胞、组织工程化气管、气管软骨细胞、气管上皮细胞和气管血管内皮细胞＂为关键词,选择与组织工程化气管相关的文章,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志的文章,共纳入51篇。结果与结论：组织工程化气管种子细胞研究主要包括软骨细胞、上皮细胞和血管内皮细胞。实验已证实,间充质干细胞可定向分化为软骨细胞,细胞因子在诱导间充质干细胞分化为软骨过程中起着关键作用。目前尚未发现合适的诱导因子能特异性诱导间充质干细胞定向分化气管上皮细胞。有研究发现间充质干细胞具有向上皮细胞分化的潜能。间充质干细胞在体内或体外特殊条件下可诱导分化为血管内皮细胞,为间充质干细胞作为种子细胞分化血管内皮细胞应用于组织工程化气管起到借鉴作用。     

海绵状Ⅰ型胶原蛋白与免脂肪干细胞的生物相容性

背景:脂肪组织工程研究中,寻找一种优良的生物支架材料作为脂肪干细胞的载体极为重要.目的:评价兔脂肪干细胞与海绵状Ⅰ型胶原蛋白的生物相容性.设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2007-01/03在南方医科大学组织工程研究中心完成.材料:三四月龄雌性新西兰大白兔8只,由南方医科大学实验动物中心提供.海绵状Ⅰ型胶原蛋白为广州创尔公司产品.方法:兔麻醉后取颈部皮下脂肪,体外分离培养脂肪干细胞,选取生长良好的第3代细胞,调整密度为1×109L-1细胞悬液.将无菌的Ⅰ型胶原蛋白海绵裁成10mm×10mm×5mm放入96孔板内,培养液平衡后,每孔支架材料表面接种0.1 mL细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM培养液.主要观察指标:脂肪干细胞的形态及表面标志表达,细胞在支架材料上的黏附、增殖情况,光镜及电镜下观察细胞-支架复合物.结果:原代培养的脂肪干细胞形态主要呈宽大扁平短梭形,传代后细胞形态以长梭形为主,第3代脂肪干细胞CD29,CD44免疫荧光染色均呈阳性.细胞与支架混合培养后平均黏附率为92.38%,并保持正常的生长增殖速度.光镜下随培养时间延长,支架上的细胞逐渐增多,极少从支架材料上掉落,Dil荧光染色后可见细胞膜发出红色荧光.电镜下部分细胞呈团簇状生长,聚集性分布,黏附于胶原海绵表面或孔隙内,细胞周围有大量的基质.结论;海绵状Ⅰ型胶原蛋白与兔脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性,能够为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间,可作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料.     

海绵状Ⅰ型胶原蛋白与兔脂肪干细胞的生物相容性

背景：脂肪组织工程研究中,寻找一种优良的生物支架材料作为脂肪干细胞的载体极为重要。目的：评价兔脂肪干细胞与海绵状Ⅰ型胶原蛋白的生物相容性。设计、时间及地点：细胞一支架学体外观察,于2007—01／03在南方医科大学组织工程研究中心完成。材料：三四月龄雌性新西兰大白兔8只,由南方医科大学实验动物中心提供。海绵状Ⅰ型胶原蛋白为广州创尔公司产品。方法：兔麻醉后取颈部皮下脂肪,体外分离培养脂肪干细胞,选取生长良好的第3代细胞,调整密度为1×10^9L^-1细胞悬液。将无菌的Ⅰ型胶原蛋白海绵裁成10mm×10mm×5mm放入96孔板内,培养液平衡后,每孔支架材料表面接种0．1mL细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM培养液。主要观察指标：脂肪干细胞的形态及表面标志表达,细胞在支架材料上的黏附、增殖情况,光镜及电镜下观察细胞-支架复合物。结果：原代培养的脂肪干细胞形态主要呈宽大扁平短梭形,传代后细胞形态以长梭形为主,第3代脂肪干细胞CD29,CD44免疫荧光染色均呈阳性。细胞与支架混合培养后平均黏附率为92．38％,并保持正常的生长增殖速度。光镜下随培养时间延长,支架上的细胞逐渐增多,极少从支架材料上掉落,Dil荧光染色后可见细胞膜发出红色荧光。电镜下部分细胞呈团簇状生长,聚集性分布,黏附于胶原海绵表面或孔隙内,细胞周围有大量的基质。结论：海绵状Ⅰ型胶原蛋白与兔脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性,能够为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间,可作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料。     

兔软骨基质支架与脂肪干细胞的生物相容性

背景:软骨基质主要为Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖,它是软骨细胞分化和发育的先天环境,能促进干细胞向软骨细胞分化。目的:观察兔软骨基质支架与同种异体脂肪干细胞在体外的生物相容性。设计、时间及地点:观察实验,于2007-12/2008-05在遵义医学院珠海校区中心实验室完成。材料:取兔新鲜耳郭软骨组织在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的保护下利用低渗透压和TritonX-100脱去细胞成分制备软骨基质。脂肪干细胞由新西兰大白兔颈部脂肪组织经剪碎、Ⅰ型胶原酶消化并离心后获得。方法:将2×l07L-1的脂肪干细胞悬液0.2mL滴在软骨基质支架表面,置于37℃、体积分数为0.05CO2饱和湿度的培养箱中静置4h后加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液培养。主要观察指标:采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附、生长及增殖情况,同时计算细胞黏附率,并采用二甲氧唑黄比色法检测细胞增殖趋势。结果:扫描电镜和倒置显微镜观察到脂肪干细胞在软骨基质支架上黏附和变形,其黏附率为93.7%;苏木精-伊红染色见细胞向支架深层生长;二甲氧唑黄比色法测定细胞生长曲线表明细胞在支架上有增殖的趋势。结论:兔软骨脱细胞基质与同种异体脂肪干细胞在体外具有良好的生物相容性。     

脂肪干细胞与自体富血小板血浆载体复合物体内构建血管化组织工程脂肪

背景：血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素。目的：观察脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法：从健康成年人吸脂术后的脂肪组织中分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,将第3代经BrdU标记的脂肪十细胞向脂肪细胞定向诱导2周后,制成浓度为5×10^10L^-1。细胞悬液。由0．5mL细胞悬液、100μL富血小板血浆工作液或DMEM培养基与0.5mL纤维蛋白胶组成实验组和对照组移植物,分别植入裸鼠背部皮下。结果与结论：植入后8周取材：①实验组可见血管明显增生并长入材料,呈轻度纤维包裹;列照组有少量血管长入材料中,也有轻度纤维包裹现象。实验组新生组织湿质量大予对照组（P〈0．01）。②苏木精一伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入;实验组微血管数多于对照组（P〈0．01）。⑧新生组织免疫荧光染色示,两组新生脂肪细胞的胞核及部分微血管内皮细胞的胞核呈现绿色荧光。说明脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内可构建血管化组织工程脂肪,脂肪于细胞与自体富血小板血浆共同参与新生脂肪组织的血管化过程,自体富血小板血浆能促进组织工程构建物的血运重建,保证更多种子细胞的成活。     

骨组织工程中脂肪间充质干细胞的作用

背景:目前常采用在骨缺损处充填自体骨、异体骨、人工合成骨替代品等方法进行骨缺损修复,但临床效果均不理想.研究表明脂肪间充质干细胞具有多种分化能力及很强的增殖潜力,可将其诱导分化成骨.目的:分析脂肪间充质干细胞在骨组织工程中的应用情况,以明确脂肪间充质干细胞是否可以作为骨组织工程中的种子细胞.方法:应用计算机检索Medline数据库(1999-01/2008-12),以adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,adipose mesenchymal stem cells,adipose stem cell;osteogenic induction,osteogenic inducement,bone induction,osteoblastic induced;chondroblast induction,cartilage induction;bone tissue engineering,tissue engineering bone,tissue engineering of bone为检索词;应用计算机检索清华同方数据库(2003-01/2008-12),以脂肪间充质干细胞、成骨诱导、成软骨诱导、骨组织工程为检索词.结果与结论:共收集361篇关于脂肪间充质干细胞与骨组织工程相关的文献,中文246篇,英文115篇.排除发表时间较早、重复及类似研究,纳入29篇符合标准的文献.脂肪间充质干细胞体外扩增和自我更新能力很强,传代培养易于获得大量有分化能力的细胞,是真正意义上的具有多向分化潜能的干细胞,脂肪间充质干细胞在一定的培养条件下,可定向分化为成骨细胞、软骨细胞及骨细胞和肌肉细胞,配合合适的支架后可以应用到骨组织工程中,可以作为骨组织工程中的种子细胞.     

天然可降解脱钙骨基质材料复合脂肪干细胞的三维培养

背景:脱钙骨基质是一种常用的组织工程支架材料,脂肪干细胞是近年来发现的一种成体干细胞,二者均可自体取材,二者复合培养的研究还未见报道.目的:观察脂肪干细胞与脱钙骨基质复合后三维培养的生长、增殖情况.方法:无菌切取兔腹股沟皮下脂肪垫,采用I型胶原酶搅拌消化法分离培养原代脂肪干细胞,系列传代传至第3代,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,免疫荧光细胞化学染色检测细胞表面抗原的表达.切取兔髂骨,制备脱钙骨基质.取第3代脂肪干细胞,与脱钙骨基质复合后共培养,1周后扫描电镜观察细胞黏附和生长情况,2周后石蜡包埋切片进行苏木精-伊红染色.结果与结论:自兔皮下脂肪分离培养获得的脂肪干细胞增殖迅速,第3代脂肪干细胞表面抗原CD44呈阳性表达,CD34为阴性;制备的脱钙骨基质为三维立体多孔结构,具有良好的可塑性,并有一定的机械强度.复合培养后电镜扫描、苏木精-伊红染色显示,细胞在脱钙骨基质表面和孔隙内黏附生长良好,并能继续增殖和分泌胞外基质.结果提示脂肪干细胞与脱钙骨基质复合共培养生长增殖良好,并能分泌细胞外基质.     

体外三维支架诱导脂肪干细胞向髓核样细胞的分化

背景:髓核组织工程被认为是椎间盘退变修复的理想方法,种子细胞是髓核组织工程的关键因素,但髓核细胞来源有限.目的:探讨兔脂肪干细胞在体外三维支架诱导培养条件下能否向髓核样细胞分化.设计、时间及地点:细胞.支架学体外观察,于2008-07/12在解放军北京军区总医院全军骨科研究所完成.材料:清洁级3月龄日本大耳兔3只,由北京实验动物技术有限公司提供.医用级壳聚糖为浙江金壳生物化学公司产品.方法:无菌条件下切取兔皮下脂肪组织,胶原酶消化法分离培养兔脂肪干细胞.取传至第2代细胞制成细胞悬液50 μL(5×10~6个细胞),与150 μL壳聚糖-藻酸盐复合物混合,置入12孔板,室温下20 min左右形成凝胶状.设立3组,对照组仅添加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养液2 mL;低氧诱导组、正常氧气诱导组均加入含牛血清白蛋白、转化生长因子β1、地塞米松、维生素C、BMP-7、1%ITS-plus、体积分数为10%胎牛血清的DMEM液,然后分别通气体积分数为2%的O_2和20%的O_2.各组置入37℃、体积分数为5%的CO_2饱和湿度培养箱中培养21d.主要观察指标:组织形态学观察,蛋白多糖水平,Ⅱ型胶原水平.结果:扫描电镜显示细胞在支架内正常黏附,细胞绒毛清晰可见,生长状态良好,番红O染色与阿利辛蓝染色均呈阳性,产生较多的蛋白多糖.随时间延长,对照组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均无明显变化;低氧诱导组、正常氧气诱导组脂肪干细胞产生的蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均显著增加,与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.001,P＜0.05);且低氧诱导组产生蛋白多糖、Ⅱ型胶原水平均多于正常氧气诱导组(P＜0.05,P＜0.01).结论:在适当的诱导条件下,兔脂肪干细胞在壳聚糖-藻酸盐凝胶支架中可以向髓核样细胞分化,产生与髓核组织相同的细胞外基质,且低氧状态下诱导效果较好.     

多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体条件下生物学特性的影响

背景：多聚赖氨酸可促进软骨细胞、表皮细胞的黏附、生长及增殖.目的：观察多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体培养下生物学活性的影响.方法：采用流式细胞仪检测昆明小鼠脂肪来源干细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达,将脂肪来源干细胞分别与经多聚赖氨酸表面修饰的珊瑚羟基磷灰石或空白珊瑚羟基磷灰石体外复合培养.结果与结论：与空白珊瑚羟基磷灰石组比较,经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞较空白珊瑚羟基磷灰石组多,并分泌较多细胞基质,复合培养2,4,8 d的A值较明显增高（P 〈 0.05）;但经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞碱性磷酸酶活性值升高不明显（P 〉 0.05）.说明多聚赖氨酸能促进脂肪来源干细胞在珊瑚羟基磷灰石表面的黏附、生长和增殖,不影响脂肪来源干细胞向成骨细胞转化.     

多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体条件下生物学特性的影响

背景:多聚赖氨酸可促进软骨细胞、表皮细胞的黏附、生长及增殖。目的:观察多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体培养下生物学活性的影响。方法:采用流式细胞仪检测昆明小鼠脂肪来源干细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达,将脂肪来源干细胞分别与经多聚赖氨酸表面修饰的珊瑚羟基磷灰石或空白珊瑚羟基磷灰石体外复合培养。结果与结论:与空白珊瑚羟基磷灰石组比较,经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞较空白珊瑚羟基磷灰石组多,并分泌较多细胞基质,复合培养2,4,8d的A值较明显增高(P<0.05);但经多聚赖氨酸修饰的珊瑚羟基磷灰石上黏附的脂肪来源干细胞碱性磷酸酶活性值升高不明显(P>0.05)。说明多聚赖氨酸能促进脂肪来源干细胞在珊瑚羟基磷灰石表面的黏附、生长和增殖,不影响脂肪来源干细胞向成骨细胞转化。     

三维支架中骨髓间充质干细咆及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景:软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现.目的:考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性.方法:抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增.取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例(10%,20%,50%,80%,100%)的胶原,透明质酸支架中,在无血清培养液中三维培养.2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况.结果与结论:种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱.结果提示,在同样条件下骨髓问充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能.