免抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

背景：凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白,它不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用。目的：制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定。设计、时间及地点：单一样本观察,于200609／200808在新乡医学院免疫学研究中一心完成。材料：新西兰大白兔雌性2只,体质量1．9-2．1kg;JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司。食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者。抗原肽KLH由上海华大天源生物科技公司合成。CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司。方法：利用美国过敏和感染疾病研究所（NIAID）主办的抗原袁位分析网站（http：／／beta．immuneepitope．org／home．php）的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽,制备多克隆抗体并纯化。主要观察指标：采用间接ELISA、Westernblot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定。结果：间接EUSA法检测显示,血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1：128000。Westernblot结果显示,存在Mr67000条带。免疫组织化学检测结果显示,在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在,说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色。结论：实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体。     

兔抗凋亡诱导因子多克隆抗体的制备、纯化与鉴定

背景:凋亡诱导因子是存在于线粒体膜间隙中的黄素蛋白,它不仅具有氧化还原和电子传递功能,还具有促细胞凋亡功能,从而在维持细胞正常生理活动中具有重要作用.目的:制备抗凋亡诱导因子多克隆抗体并进行特性鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2008-08在新乡医学院免疫学研究中心完成.材料:新两兰大白兔雌性2只.体质量1.9～2.1 kg;JurkatE6-1细胞系购自美国ATCC公司.食管癌组织取自新乡医学院普通外科手术患者.抗原肽-KLH由上海华大天源生物科技公司合成.CNBr活化的Sepharose4B购自美国Pharmacia公司.方法:利用美国过敏和感染疾病研究所(NIAID)主办的抗原表位分析网站(http://beta.immuneepitope.org/home.php)的在线软件对凋亡诱导因子蛋白的氨基酸序列进行分析设计凋亡诱导因子抗原肽,制备多克隆抗体并纯化.主要观察指标:采用间接ELISA、Western blot、免疫组织化学3种方法对获得的多克隆抗体进行特性鉴定.结果:间接ELISA法检测显示,血清抗凋亡诱导因子抗体的效价达到1:128000.Western blot结果显示,存在Mr67000条带.免疫组织化学检测结果显示,在食管癌细胞的胞质中有棕黄色的阳性颗粒存在,说明此抗体也可以用于免疫组织化学染色.结论:实验获得了高效价的特异性的抗凋亡诱导因子抗体.     

抗人重组可溶性组织因子单克隆抗体的制备及鉴定

组织因子 (ＴＦ)作为血液凝血因子Ⅶ (ＦⅦ )和活化的血液凝血因子Ⅶ (ＦⅦａ)的受体和辅助因子 ,是生理性和病理性凝血过程的始动因子。可溶性组织因子 (ｓＴＦ)为ＴＦ的胞外区(1～ 2 19氨基酸 ) ,具备ＴＦ连接ＦⅦａ及催化ＦⅦａ所必需的全部结构。ｓＴＦ作为抗原较全长ＴＦ具有相对分子质量小、针对性强的特点。我们以重组人可溶性组织因子 (ｒｈｓＴＦ)为抗原 ,制备了抗ｒｈｓＴＦ单克隆抗体 (ＭｃＡｂ) ,并对抗体进行了鉴定。材料和方法1　材料　细胞和实验动物 :ＳＰ2 / 0细胞由中南大学湘雅医学院肿瘤免疫室提供。ＢＡＬＢ/ｃ小鼠购…     

抗组织因子途径抑制物单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗组织因子途径抑制物（ＴＦＰＩ）单克隆抗体。方法：用微量ＴＦＰＩ脾内包埋免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞融合，建立了２株稳定分泌抗ＴＦＰＩ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，分别命名为４Ｆ４和４Ｆ８。对其中的一株４Ｆ８进行研究，其杂交瘤细胞染色体众数为９３，分泌的抗体为ＩｇＧ１。以简易正辛酸法从腹水纯化ＭｃＡｂ４Ｆ８，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测其纯度，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析显示其可特异性地识别分子量为３４８００的抗原分子。对纯化的抗体以改良过碘酸钠氧化法用辣根过氧化物酶标记后，采用双夹心ＥＬＩＳＡ法检测正常人血浆ＴＦＰＩ含量。结果：稀释的凝血酶原时间（ＰＴ）测定，ＭｃＡｂ４Ｆ８可缩短其凝固时间，且呈量效关系，ＭｃＡｂ４Ｆ８还可使乏因子Ⅸ血浆稀释的ＰＴ明显缩短。正常人血浆ＴＦＰＩ含量为１０３．２±１１．５μｇ／Ｌ，结果与美国Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ公司的ＴＦＰＩＥＬＩＳＡ试剂盒所测结果（９８．４±１０．３μｇ／Ｌ）相近（ｒ＝０．９２）。结论：ＭｃＡｂ４Ｆ８有潜在的药用价值，并可望为我国ＴＦＰＩ的研究提供精确的检测手段。     

抗HCCR单克隆抗体的制备及其鉴定

目的制备抗人宫颈癌癌基因（HCCR）单克隆抗体（mAb）,并进行鉴定。方法以HCCR重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,常规筛选杂交瘤细胞。腹水诱导法制备抗人HCCR单克隆抗体,并经蛋白A亲合层析进行纯化。用Western blot和免疫荧光等方法检测HCCR mAb的特异性。用纯化HCCR蛋白进行包被,建立间接ELISA方法,检测系列稀释的HCCR mAb,确定其灵敏度。结果筛选出2株分泌抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果表明抗人HCCR抗体能与HCCR蛋白特异性结合,免疫荧光结果显示肝癌HepG2细胞中胞浆和胞膜均呈阳性染色。间接ELISA方法检测HCCR mAb的灵敏度可达到1μg/L。结论成功制备并鉴定了特异性抗人HCCR mAb的杂交瘤细胞株,为进一步深入研究HCCR的生物学特征和临床应用打下基础。     

稀有血型筛选用小鼠单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备血型单克隆抗体,用于筛选稀有血型。方法用人红细胞作为免疫原免疫6周龄Balb/c小鼠(雌),通过小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,用免疫原红细胞筛选阳性克隆,用已知表型的稀有血型红细胞筛选鉴定抗体特异性。用1 L培养袋扩大培养,以硫酸铵法粗提培养上清。以商品试剂盒检测抗体的免疫球蛋白亚类。检测抗体反应性,摸索在全自动血型仪上进行抗原筛选的使用条件。结果建立了3株单克隆抗体细胞株。抗-GPA/GPB(IgG1,κ)盐水法反应,抗体效价为102 400;抗-EnaTS(IgM,κ)盐水法反应,抗体效价为204 800;抗-K14(IgG1,κ)菠萝酶法反应,抗体效价为20 480。结论利用得到的单抗可在自动血型仪上实施快速高通量抗原筛选,可用于筛选MkMk型、En(a-)、Ko及K:-14型等稀有血型。     

抗重组人内皮抑素单克隆抗体的制备

目的用重组人内皮抑素融合蛋白作为抗原,制备鼠抗人内皮抑素单克隆抗体。方法采用麦芽糖结合蛋白重组内皮抑素（MBP—endostatin）免疫Balb／c小鼠,取其脾脏与同系骨髓瘤细胞（SP2/0）融合,通过酶联免疫吸附试验（EUSA）筛选阳性克隆。结果经2次亚克隆后获得一株阳性的杂交瘤细胞。结论抗人内皮抑素单克隆抗体的制备为肿瘤治疗的基础研究及检测奠定了基础。     

阿霉素增强抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导HL-60细胞凋亡的作用

目的观察抗死亡受体5（DR5）单克隆抗体（单抗）mDRA-6与阿霉素（Adr）对HL-60细胞的协同杀伤作用。方法用DR5蛋白免疫BALB／c小鼠，融合筛选抗DR5杂交瘤细胞，制备抗人DR5单抗mDRA-6；流式细胞术测定Adr对HL-60细胞表面DR5表达的影响；荧光显微镜下观察mDRA-6与Adr协同作用下HL-60细胞的形态变化；MTT法测定1μg／ml Adr与不同浓度的mDRA-6对HL-60细胞存活的影响；琼脂糖凝胶电泳检测mDRA-6与Adr联合对HL-60细胞DNA片断化的影响。结果Adr诱导HL-60细胞表面DR5表达，mDRA-6作用后HL-60细胞出现染色质浓缩、断裂，细胞出芽，凋亡小体形成，mDRA-6与Adr联用细胞形态变化更明显；mDRA-6与Adr对HL-60细胞具有明显的协同杀伤作用，20ng／ml的mDRA-6作用HL-60细胞10h，细胞死亡率为9．32％，1μg／mlAdr作用HL-60细胞10h，细胞死亡率为17.47％，20ng／ml mDRA-6联合1μg／mlAdr，可使HL-60细胞死亡率增至65．06％；20μg／ml mDRA-6与1μg／mlAdr联合作用于HL-60细胞3h，DNA琼脂糖凝胶电泳显示明显“梯形”条带。结论抗DR5单抗mDRA-6与Adr对HL-60细胞具有强大的协同杀伤作用。     

抗重组人内皮抑素单克隆抗体的制备

目的 用重组人内皮抑素融合蛋白作为抗原,制备鼠抗人内皮抑索单克隆抗体.方法 采用麦芽糖结合蛋白理组内皮抑素(MBP-endostatin)免疫Balb/c小鼠,取其脾脏与同系骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过酶联免疫吸附试验(EUSA)筛选阳性克隆.结果 经2次亚克隆后获得一株阳性的杂交瘤细胞.结论 抗人内皮抑素单克隆抗体的制备为肿瘤治疗的基础研究及检测奠定了基础.     

抗卵巢上皮癌单克隆抗体的制备和鉴定

以人的浆液性卵巢上皮癌细胞系ＨＯ－８９１０为抗原，制备分泌抗卵巢癌单克隆抗体的杂交瘤，经间接免疫荧光组化鉴定证实。制备的单克隆抗体ＯＣ１Ｃ３与ＨＯ－８９１０呈强阳性反应，与其他肿细胞系则无反应或反应极弱。在冰冻切片中，单克隆抗体ＯＣ１Ｃ３与卵巢恶性肿瘤呈强阳性反应（７／８），与绒癌有部分交叉反应（１／２），与正常卵巢和胚胎组织无反应。结果表明ＯＣ１Ｃ３是卵巢恶性肿瘤的一种特异性抗原的单克隆抗体。为     

抗人脑钠肽单克隆抗体的制备及其鉴定

目的:制备抗人脑钠肽单克隆抗体并对其进行初步鉴定。方法:实验于2004-12/2006-02在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所进行。利用碳化二亚胺法将合成的人脑钠肽与牛血清白蛋白偶联制备完全抗原,反复免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb/c小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)在PEG下融合,HAT选择性培养,间接酶联免疫吸附方法对细胞培养上清检测、筛选,选择筛选结果脑钠肽抗体阳性的细胞株连续进行3次亚克隆,建立稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株。扩大培养阳性单克隆细胞株后,腹腔注射小鼠,制备腹水。对腹水亲和层析纯化,所得的单克隆抗体行初步鉴定。结果:免疫小鼠血清呈脑钠肽抗体阳性,经筛选得到3株稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化的单克隆抗体经鉴定为IgG型,蛋白质印迹分析证实单克隆抗体可特异识别脑钠肽,具备较高的特异性及敏感性。结论:成功制备了3株抗脑钠肽特异性的单克隆抗体,可用于脑钠肽免疫检测方法的建立。     

抗人脑钠肽单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备抗人脑钠肽单克隆抗体并对其进行初步鉴定。 方法：实验于2004-12／2006-02在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所进行。利用碳化二亚胺法将合成的人脑钠肽与牛血清白蛋白偶联制备完全抗原，反复免疫Balb／c小鼠，应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与Balb／c小鼠骨髓瘤细胞（SP2／0）在PEG下融合，HAT选择性培养，间接酶联免疫吸附方法对细胞培养上清检测、筛选，选择筛选结果脑钠肽抗体阳性的细胞株连续进行3次亚克隆，建立稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株。扩大培养阳性单克隆细胞株后，腹腔注射小鼠，制备腹水。对腹水亲和层析纯化，所得的单克隆抗体行初步鉴定。 结果：免疫小鼠血清呈脑钠肽抗体阳性，经筛选得到3株稳定分泌脑钠肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化的单克隆抗体经鉴定为IgG型，蛋白质印迹分析证实单克隆抗体可特异识别脑钠肽，具备较高的特异性及敏感性。 结论：成功制备了3株抗脑钠肽特异性的单克隆抗体，可用于脑钠肽免疫检测方法的建立。     

抗人非小细胞肺癌单克隆抗体的制备及鉴定

摘要：目的：制备抗人非小细胞肺癌（NSCLC）的单克隆抗体(McAb),并对其生物学特性及特异性进行鉴定。 方法：以人肺腺癌细胞株SPC-A1为抗原,免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合,间接细胞ELISA法筛选阳性细胞克隆;多种细胞间接ELISA及间接免疫荧光法鉴定其特异性;western blot分析其特异性结合抗原的相对分子量;免疫组化染色分析单抗的组织特异性。 结果：得到1株高效价的、稳定分泌IgG1抗人NSCLC单抗的细胞株（NJ488-1）,纯化后效价为2×10⁶;间接细胞ELISA 及间接免疫荧光法证实NJ488-1能特异地识别肺癌细胞系,其识别抗原定位于SPC-A1细胞胞浆区;western blot显示NJ488-1特异性结合的抗原相对分子量(Mr)为70 000左右;免疫组化结果表明NJ488-1与NSCLC组织有强阳性反应。 结论:成功地制备并鉴定了抗人NSCLC单抗NJ488-1,为肺癌的进一步研究及NJ488-1的临床应用奠定了基础。     

抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的制备及生物学特性初步鉴定

目的 制备抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277）单克隆抗体（单抗），探讨其生物学特性。方法 以GST－TRF1^33-277融合蛋白为抗原，经细胞融合及ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞，对其进行染色体核型分析，将此单抗作为探针用于Western blot和免疫组化检测标本。结果 获得1个抗TRF1蛋白的杂交瘤细胞株。以抗TRF1^33-277单抗作Western blot检测正常人及急性白血病患者骨髓，大肠癌组织及近旁正常粘膜组织提取蛋白。在相对分子质量60000处有一特异性条带，与阳性对照纯化TRF1蛋白相一致，免疫组化显示该抗体在上皮细胞及骨髓造血细胞胞浆中阳性着色。结论 制备了具有高度特异性的抗TRF1^33-277单抗，建立了Western blot和免疫组化检测组织表达TRF1蛋白的方法。     

抗曲霉硫氧还蛋白还原酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)GliT单克隆抗体(单抗)并进行鉴定。方法取重组烟曲霉TR蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选分泌抗TR抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化。用ELISA法测定抗体效价,IsoStrip鉴定抗体类、型,用western blot、免疫荧光分析技术和免疫组化染色鉴定单抗的特异性。结果筛选到1株稳定分泌抗TR单抗(Anti-TR1)的杂交瘤细胞,抗体亚类为IgG1,轻链为κ型。ELISA法测定效价为5×105,能够与烟曲霉分泌蛋白及菌丝中天然TR特异性结合,还可与基因重组TR特异性结合。免疫荧光检测表明,该株单抗与烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉菌丝均发生反应,是曲霉属特异性的抗体。病理组织免疫组化染色结果显示,该抗体可与曲霉菌丝产生特异性反应。结论获得了1株持续分泌高效价抗曲霉属特异性抗TR单抗的交杂瘤细胞株,为进一步的研究奠定了基础。     

抗人红细胞血型糖蛋白A非多态性表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗人红细胞血型糖蛋白A(Glycophorin A,GPA)非多态性表位单克隆抗体并鉴定其特性。方法用小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术获得分泌单抗-GPA非多态性表位的杂交瘤细胞株;鉴定抗体特异性和亚型;通过和各种酶处理细胞的反应确定单抗结合抗原位点的特性。结果得到的2株抗-GPA非多态性表位的单克隆细胞株Q6D7和Q7C9,均属IgG1亚类、Kappa型轻链,所针对的抗原位点均抗胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶处理,对无花果酶、木瓜酶、唾液酸酶敏感。结论制备获得2株抗-GPA非多态性表位单克隆抗体。     

白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗白念珠菌果糖二磷酸醛缩酶(Fba1)单克隆抗体,用以研究胞壁蛋白Fba1在侵袭性念珠菌感染(IC)中的致病作用。方法取重组白念珠菌Fba1蛋白免疫BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,筛选分泌抗体的杂交瘤细胞,有限稀释法克隆化。用ELISA测定单克隆抗体的效价,western blot和免疫荧光技术鉴定其特异性,用IsoStrip鉴定其抗体类型。结果筛选到1株稳定分泌抗Fba1单克隆抗体的杂交瘤细胞,抗体类型为IgG2a,轻链为κ型。鉴定结果表明,ELISA效价为1×106,能与念珠菌裂解物中天然Fba1和基因重组Fba1特异性结合。免疫荧光检测表明,该株单克隆抗体与白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌均发生反应。结论建立了1株持续分泌高效价抗念珠菌属特异性Fba1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为研究Fba1在IC中的致病作用提供了实验材料。