腭裂小鼠牙胚发育中β-连环蛋白的表达

背景:牙齿发育生物学中信号传导是热点问题,β-连环蛋白是Wnt信号传导通路中的关键效应因子,其在发育的牙胚中有普遍表达,并且在内釉上皮、釉结、星网状层、中间层的表达有时空变化。目的:通过苏木精-伊红染色和免疫组化技术,观察牙胚在维甲酸诱导腭裂发生中的形态学变化及β-连环蛋白的表达变化。方法:选取C57BL/6J近交系小鼠,按雌雄比2:1于晚8时合笼,次日8时检查雌鼠,发现阴栓视为妊娠,定为E0d。18只孕鼠随机分为3组:在E10d,实验组以维甲酸100mg/kg对孕鼠行一次性灌胃,制备腭裂动物模型;植物油对照组给予10mL/kg橄榄油灌胃;空白对照组不做任何处理。结果与结论:β-连环蛋白在空白对照组E13d牙胚蕾状期、E14d帽状期、E16d钟状期上皮内均有表达,且空白对照组的表达随着牙胚发育的成熟而逐渐增加,实验组的变化趋势与空白对照组相同。3个时期的实验组β-连环蛋白在牙胚中的表达水平均高于空白对照组,植物油对照组和空白对照组表达无明显差异。提示维甲酸在诱导腭裂发生过程中,可能通过干扰上皮-间充质间的相互作用,上调β-连环蛋白在牙胚中的表达,使牙胚发育受阻。     

小鼠腭裂相关基因的克隆及基因表达的意义

目的:筛选并克隆正常组小鼠腭突与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因,探讨它们在腭裂发生过程中表达的意义。方法:建立C57BL/6N小鼠腭裂模型,分别提取胚胎12d的正常组及维甲酸处理组小鼠腭突组织中的mRNA,利用PCR的改良消减杂交技术,筛选并克隆小鼠腭突正常发育时期与腭裂形成过程中差异表达的基因及测序。结果:共获得差异表达的基因40个,2个为新基因。结论:克隆的新基因及fau基因可能对腭突间充质细胞的生长、分化具有重要的调控作用。     

小鼠腭裂相关基因的克隆及基因表达的意义

目的：筛选外克隆正常组小鼠腭突与腭裂组小鼠腭突组织中差异表达的基因，探讨它们在腭裂发生过程中表达的意义。方法：建立C57BL／6N小吸腭裂模型，分别提取胚胎12d的正常组及维甲酸处理组小鼠腭突组织中的mRNA，利用PCR的改良消减杂交技术，筛选并克隆小鼠腭突正常发育时期与腭裂形成过程中差异表达的基因及测序。结果：共获得差异表达的基因40个，2个为新基因。结论：克隆的新基因及fau基因对能对腭突间充质细胞的生长、分化具有重要的调控作用。     

全反式维甲酸诱导神经干细胞向神经元的分化

背景:目前研究证实全反式维甲酸在调控多种组织和细胞的增殖、生长发育、代谢以及维持内环境稳定等方面具有广泛生物学作用.目的:探讨全反式维甲酸诱导神经干细胞分化为神经元过程中的作用及其分子机制.设计、时间及地点:对照观察,体外细胞学实验,于2006-07/2007-06在上海同济大学附属医院实验室完成.材料:普通级孕13～14 d雌性SD大鼠6只,取胎鼠用于制备神经干细胞.诱导剂全反式维甲酸为Sigma公司产品.方法:取第3代神经干细胞,以2×108 L-1密度接种,分为全反式维甲酸诱导1 d,3 d,7d,10d组和空白对照组,各诱导组均加入1 μ mol/L全反式维甲酸,空白对照组仅加入等量生理盐水.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定结果,计数分化为神经元的比例,应用半定量RT-PCR法检测维甲酸受体α mRNA的表达.结果:全反式维甲酸诱导后神经元特异性烯醇化酶染色呈阳性,细胞有多个细长突起,胞体呈绿色荧光,胞核呈蓝色荧光.与空白对照组比较,诱导3 d,7 d,10 d组神经元特异性烯醇化酶染色阳性细胞率均明显升高(P<0.05),且诱导7 d组达峰值.与空白对照组比较,各诱导组维甲酸受体α mRNA的表达量均明显升高(P<0.01).结论:全反式维甲酸能显著提高大鼠胚胎神经干细胞分化为神经元的比例,同时发现细胞维甲酸受体α mRNA的表达增加.     

人胚神经干细胞在大鼠脊髓内的分化研究

目的　人胚神经干细胞 (neuralstemcellsNSCs)经全反式维甲酸 (retinoicacid)预处理后移植入大鼠脊髓内 ,观察细胞的分化情况。方法　分离 10周左右流产人胚皮层组织中的神经干细胞 ,进行体外增殖 ,部分细胞在移植前 6d加入全反式维甲酸共培养。SD大鼠 3 0只 ,随机分为 2组 :实验组移植经维甲酸预处理后的NSCs ;对照组移植未经维甲酸预处理后的NSCs。移植后 5周取出脊髓 ,应用免疫组化技术检测Brd U标记的NSCs在大鼠脊髓内的生存和分化情况。结果　大鼠脊髓内可见大量Brd U阳性细胞 ,部分能够分裂增殖 ,向注射点远处迁移。实验组的NSCs能分化出NF、GFAP、Gal c阳性细胞 ;对照组的NSCs不能分化出NF阳性细胞。结论　人胚NSCs可在宿主脊髓内生存、分裂、迁移 ;经维甲酸预处理后的NSCs能分化成神经元和神经胶质细胞 ;人胚神经干细胞可作为 1种理想的移植材料 ,而具有重要临床应用价值     

骨髓间充质干细胞体外转化为神经细胞的环境特征

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养条件,体外定向诱导传代骨髓间充质干细胞向神经干细胞转化并进一步向神经细胞分化的环境,并对分化的神经元进行鉴定。方法:实验于2005-08/2007-03在南京大学医学院附属鼓楼医院科研部完成。①选用健康SD大鼠,分离纯化并培养大鼠骨髓间充质干细胞。②应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,通过免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞.③贴壁培养诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,分为对照组和诱导剂组,对照组中不加诱导剂,诱导剂组分两步诱导:首先加入含终浓度均为10μg/L的表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子诱导分化剂,连续培养12 d:然后应用20μg/L的脑源性神经营养因子和1μmol/L的全反式维甲酸继续诱导6 d,分别收集诱导1 d,6 d,12 d,18 d的细胞进行细胞免疫荧光鉴定。结果:①传代第3代骨髓间充质干细胞为梭形成纤维样细胞,均一稳定的表达与间充质干细胞相关的表面抗原标记物CD29,CD44,CD90、阳性率分别为98.88%,96.90%.95.86%,但极少表达造血细胞标志CD34。②经碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导12 d后诱导剂组巢蛋白阳性表达率为(89.24±2.12)%,而对照组细胞未表达巢蛋白。③经脑源性伸经营养因子和全反式维甲酸联合诱导6 d后,诱导剂组均可见微管相关蛋白2阳性细胞,大部分细胞转变为神经元样细胞形态;对照组微管相关蛋白2阴性.细胞形态仍为梭形成纤维样细胞。结论:实验采用并改良了全骨髓贴壁法,操作简单快速.细胞活性好,是一种较为理想的分离和纯化骨髓间充质干细胞的方法.骨髓间充质干细胞可分化成神经干细胞,进一步诱导分化为神经细胞。     

人脐血间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的体外诱导

背景:细胞替代治疗帕金森病成为目前研究的一个热点,如何进行体外诱导获得足量的有效多巴胺能神经元是治疗该疾病的一种策略。目的:探讨人脐血间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的可行性。方法:将传至第5代人脐血间充质干细胞以5×106L-1接种,先用20μg/L表皮生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子预诱导24h后,分为4组:对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,不加任何诱导液;其余3组分别加入100μmol/L抗坏血酸,1μmol/L全反式维甲酸,50μg/L胶质细胞源性神经营养因子单独或联合进行诱导。结果与结论:各诱导组均表达酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体、多巴胺受体D2 mRNA。诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞特异性抗原。与对照组相比,各诱导组巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体、多巴胺受体D2阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且全反式维甲酸+胶质细胞源性神经营养因子组和3种物质联合诱导组升高幅度高于抗坏血酸组(P<0.05),3种物质联合诱导组升高幅度高于全反式维甲酸+胶质细胞源性神经营养因子组(P<0.05)。结果提示抗坏血酸,全反式维甲酸,胶质细胞源性神经营养因子单独或联合均能促进人脐血间充质干细胞向多巴胺能神经元分化,3种物质联合应用效果最高。     

人脐血间充质干细胞体外向神经元样细胞分化的实验研究

目的:探讨来源于人脐带血的间充质干细胞体外诱导分化成神经元样细胞的可行性。方法:采用密度梯度离心方法分离人脐带血单个核细胞,用MesenCult培养液体外扩增生长传代培养,于倒置显微镜下观察其生长特性。取第3代的脐血间充质干细胞,用10μg／L成纤维细胞生长因子和30μmol／L全反式维甲酸诱导培养的细胞向神经细胞分化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于诱导前、诱导后5 d和10 d分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色。结果:培养3代的脐血间充质干细胞经全反式维甲酸和成纤维细胞生长因子诱导后发生形态改变,呈双极或多极的神经元样形态,诱导5 d时神经元特异性烯醇化酶表达率为(30.3±5.2)％,而诱导10 d时达到(53．9±6.5)％,二者差异有统计学意义(P<0．05),不表达胶质纤维酸性蛋白。结论:脐血间充质干细胞经成纤维细胞生长因子和全反式维甲酸体外诱导,能够分化为神经元样细胞。     

哺乳动物颌突前体细胞的来源及其分化表型

背景:目前尚不能确定哺乳动物的外胚间充质干细胞是否也来源于迁移的神经嵴干细胞.目的:了解哺乳动物颌突前体细胞的表面标志及分化方向,探讨外胚间充质干细胞的来源及其分化表型.方法:采用免疫组织化学染色联合流式细胞仪分析,观察E9.5,E10.5,E11.5,E12.5d期间,SD大鼠颅面部外胚间充质细胞的分子表达谱及其变化.结果与结论:颌突的前体细胞表达多谱系标志,包括某些神经谱系的标志以及中胚层来源的标志,随着发育的进行,神经谱系标志下调,而中胚层谱系的标志出现或上调,提示该群细胞分化活跃,具有干细胞的特点;此外在该群细胞中检测到始终有3%～4%的细胞表达神经嵴干细胞特异性标志CD57和P75,提示哺乳动物外胚间充质干细胞来源于神经嵴,在定居后逐渐分化的同时,仍以某种机制维持自身数量的稳定.     

静脉移植CXCR-4基因转染骨髓间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移与分化

背景:研究发现,基质细胞衍生因子1/CXCR-4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用.目的:观察静脉移植CXCR-4基因转染间充质干细胞治疗脊髓损伤的可行性.方法:利用脊髓横切法构建C57BL/6小鼠T10脊髓损伤模型,造模后7 d抽签随机分成3组:实验组经尾静脉注射CXCR-4基因转染同种异体骨髓间充质干细胞悬液,对照组与空白对照组分别注射同种异体骨髓间充质干细胞悬液及无细胞培养基.移植后第7,14,21,28天利用激光共聚焦显微镜、免疫组织化学双标染色法检测脊髓损伤部位绿色荧光蛋白阳性细胞迁移存活及分化情况,并采用BBB评分评估小鼠神经运动功能恢复情况.结果与结论:实验组移植后各时相点损伤灶内绿色荧光蛋白阳性细胞集聚明显,数量不断增多,迁移率明显高于对照组与空白对照组,来源于骨髓间充质干细胞的神经细胞占移植细胞的比例亦高于对照组与空白对照组,小鼠神经运动功能恢复明显.说明静脉移植CXCR-4基因转染的骨髓间充质干细胞表现出对脊髓损伤灶更强的定向迁移能力,且能在损伤灶内存活、分化,发挥修复损伤脊髓作用.     

Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm With a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3−/− Mouse Embryos

Cleft palate is a developmental defect resulting from the failure of embryonic palatal shelves to fuse with each other at a critical time. Immediately before and during palatal fusion (E13–E15 in mice), transforming growth factor β3 (TGFβ3) is expressed in the palatal shelf medial edge epithelium (MEE) and plays a pivotal role in palatal fusion. Using Tgfβ3^−/− mice, which display complete penetrance of the cleft palate phenotype, we tested the hypothesis that intra-amniotic gene transfer could be used to prevent cleft palate formation by restoring palatal midline epithelial function. An adenoviral vector encoding Tgfβ3 was microinjected into the amniotic sacs of mouse embryos at successive developmental stages. Transduced Tgfβ3^−/− fetuses showed efficient recovery of palatal fusion with mesenchymal confluence following injection at E12.5 (100%), E13.5 (100%), E14.5 (82%), and E15.5 (75%). Viral vectors injected into the amniotic sac transduced the most superficial and transient peridermal cell layer but not underlying basal epithelial cells. TGFβ3 transduction of the peridermdal cell layer was sufficient to induce adhesion, fusion, and disappearance of the palatal shelf MEE in a cell nonautonomous manner. We propose that intra-amniotic gene transfer approaches have therapeutic potential to prevent cleft palate in utero, especially those resulting from palatal midline epithelial dysfunction.     

孕早期超声观察腭线筛查胎儿唇腭裂

目的 评价孕早期超声观察腭线筛查胎儿唇腭裂的价值。方法 回顾性分析14 360胎接受超声颈后透明层厚度（NT）检查的孕早期胎儿,观察胎儿腭线表现,记录胎儿转归,评价孕早期超声观察腭线筛查胎儿唇腭裂的效能。结果 孕早期超声提示14 327胎（14 327/14 360,99.77%）腭线正常,其中7胎经随访证实存在唇腭裂;33胎（33/14 360,0.23%）腭线异常,其中4胎腭线为小裂隙,随访证实无唇腭裂,29胎随访证实腭线异常,包括小裂隙8胎、大裂隙4胎、前部缺失11胎及腭线变细/变短6胎。孕中期超声提示36胎唇腭裂,并于出生后或经引产证实,包括4胎单纯唇裂、10胎单纯继发性腭裂、17胎单侧唇腭裂,5胎双侧唇腭裂。超声观察腭线预测胎儿唇腭裂的敏感度为80.56%（29/36）,特异度为99.97%（14 320/14 324）,阳性预测值为87.88%（29/33）,阴性预测值为99.95%（14 320/14 327）。结论 孕早期超声观察胎儿NT平面腭线可作为筛查胎儿唇腭裂的指标,值得推广。     

Disruption of Fgf10/Fgfr2b-coordinated epithelial-mesenchymal interactions causes cleft palate

Classical research has suggested that early palate formation develops via epithelial-mesenchymal interactions, and in this study we reveal which signals control this process. Using Fgf10-/-, FGF receptor 2b-/- (Fgfr2b-/-), and Sonic hedgehog (Shh) mutant mice, which all exhibit cleft palate, we show that Shh is a downstream target of Fgf10/Fgfr2b signaling. Our results demonstrate that mesenchymal Fgf10 regulates the epithelial expression of Shh, which in turn signals back to the mesenchyme. This was confirmed by demonstrating that cell proliferation is decreased not only in the palatal epithelium but also in the mesenchyme of Fgfr2b-/- mice. These results reveal a new role for Fgf signaling in mammalian palate development. We show that coordinated epithelial-mesenchymal interactions are essential during the initial stages of palate development and require an Fgf-Shh signaling network.     

维甲酸诱导BALB／C近交系小鼠产生腭裂的剂量研究

目的：研究维甲酸诱导BALB／C近交系小鼠产生腭裂所需的剂量。方法：将40只BALB／C近交系小鼠分成四组,每组10只,在妊娠10d时分别给予不同剂量的维甲酸,给药后观察所有孕鼠的反应,在妊娠15d时解剖部分孕鼠,取胎鼠头部,行冠状切片,苏木精一伊红染色法（HE染色）,进行观察。剩余孕鼠任其自然分娩,观察子鼠情况。结果：给予70mg／kg维甲酸后,孕鼠组绝大多数表现腭裂动物模型所需特征。结论：70mg／kg剂量维甲酸能够诱导BALB／c近交系小鼠产生可靠的腭裂动物模型。     

腭帆提肌重建联合颊脂垫瓣修复对大龄腭裂的临床效果

目的探讨腭帆提肌重建联合颊脂垫瓣修复对大龄腭裂的临床效果。方法选取我院收治的76例大龄腭裂患者,采用随机数字表法分为观察组(38例,腭帆提肌重建+颊脂垫瓣修复)和对照组(38例,腭帆提肌重建+碘仿纱布修复)。比较两组的预后情况。结果术后3个月,观察组的治疗总有效率明显高于对照组,腭瘘的发生率明显低于对照组(P<0.05)。术后随访1年,观察组的上颌牙弓长、牙弓前段宽、牙弓后段宽、高鼻音与鼻漏音评分、语言清晰度和腭部瘢痕分级均明显优于对照组(P<0.05)。结论腭帆提肌重建联合颊脂垫瓣修复治疗大龄腭裂的临床效果显著,可减少并发症的发生,促进患者上颌牙发育,改善语音功能。     

Analysis of the candidate genes responsible for non-syndromic cleft lip and palate in Japanese people

In order to assess the association of alleles for candidate genes with non-syndromic cleft lip and palate, DNA samples from 43 Japanese patients were compared with those from 73 control subjects with respect to the genes encoding transforming growth factor alpha (TGFalpha), TGFbeta and gamma-aminobutyric acid type A receptor beta3 (GABRB3). The restriction fragment length polymorphisms of the 3'-non-coding region of the TGFalpha gene K-primer region were observed after digestion with NcoI and HinfI. Allele 4 was the most common among cases of cleft lip with or without cleft palate, whereas allele 2 was the most common among controls. A significant difference was found in this region between groups with cleft lip (with or without cleft palate) and controls (chi2=10.190; P=0.017). Three alleles of the TGFbeta2 gene were tested, and allele 2 was the most common in both cases and controls. The proportion of allele 2 in the case group was greater than that in the control group, showing a significant difference between cases of cleft lip (with or without cleft palate) and controls (chi(2)=19.208; P<0.0001). No significant differences in variants of TGFbeta3 or GABRB3 between case and control populations were observed. Thus it is concluded that TGF genes play a role in craniofacial development, and that alleles of TGFalpha or/and TGFbeta2 are associated with cleft lip and cleft palate in Japanese populations.     

唇腭裂的超声筛查及诊断价值

目的：研究常规鼻唇冠状切面加特殊切面在胎儿唇腭裂畸形筛查中的应用价值.材料与方法：对11688例,孕24 ～ 30周胎儿唇腭部采用常规鼻唇冠状切面加特殊切面（经唇部冠状面、经双眼标准横断面、经鼻腔标准横断面、经上牙槽突标准横断面、经舌标准横断面、经下牙槽突标准横断面和经鼻正中矢状面）行产前超声筛查,并与出生儿颜面部检查结果进行对照分析,总结鼻唇冠状切面加特殊切面超声扫查法的诊断符合率.结果：11688例胎儿共查出59例阳性患者,阳性率0.50％（59/11688）,单纯唇裂13例,占阳性病例的22.03％ （13/59）,唇裂合并腭裂的46例,占阳性病例的77.97％（46/59）,左侧唇腭裂38例,占64.4％ （38/59）,右侧唇腭裂10例,占16.9％（10/59）,正中唇裂2例占3.39％（2/59）,双侧唇腭裂9例,占12.25％（9/59）.结论：超声诊断胎儿唇腭裂畸形通过观察鼻唇部冠状切面加特殊切面（上牙槽突标准横断面、下牙槽突标准横断面、鼻腔横断面、双眼标准横断面、舌标准横断面、胎儿头颅矢状面）及配合一定手法,可明显提高其诊断率.     

左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导中转化生长因子β1及Smad2/3的影响

背景：滋补肾阴左归丸、温补肾阳右归丸均可协同诱导剂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,但其机制尚有待探讨。 目的：观察左、右归丸含药血清对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中转化生长因子β1及其信号转导蛋白Smad2/3表达的影响。 方法：运用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞;分别以空白血清对照组,左归丸、右归丸、阳性对照药补佳乐制备的大鼠含药血清加诱导剂（地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠）,以及诱导剂组为对照共5组对骨髓间充质干细胞进行干预。采用Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白表达,用免疫组化法检测转化生长因子和Smad2/3在细胞内的表达。 结果与结论：左归丸、右归丸含药血清诱导骨髓间充质干细胞成骨后Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β1、Smad2/3蛋白表达高于空白组、诱导剂组,差异有显著性意义（P〈0.05）,且左归丸优于右归丸（P 〈0.05）。提示左、右归丸含药血清能通过转化生长因子β1调节Smad2/3信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化,且左归丸组效果更好,表明中医“滋肾阴”法更能有效的促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。     

改良喂养方式对唇裂腭裂新生儿喂养的效果

目的探讨改良喂养方式对唇裂腭裂新生儿的喂养效果。方法将40例唇裂腭裂新生儿随机分为对照组和实验组各20例,对照组使用普通汤匙常规喂养,实验组采用改良喂养方式喂养。结果实验组新生儿发生呛咳与呕奶、窒息和吸入性肺炎三项并发症的概率明显低于对照组,差异具有统计学意义（P〈0．05）,其家长对于护理工作的认可情况也明显好于对照组,差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论改良喂养方式能减少唇裂腭裂新生儿喂养并发症的发生,提高家长满意度,随访结果好,值得临床推广。