多重PCR-反向线点杂交技术在检测女性念珠菌和阴道毛滴虫感染中的应用

目的建立和评价多重PCR-反向线点杂交技术(mPCR-RLB)快速同时检测阴道毛滴虫和念珠菌感染的方法。方法分别选择阴道毛滴虫特异性DNA重复序列设计一对特异性引物,以念珠菌属28srRNA至5.8s rRNA间隔序列Ⅱ(ITS2)为靶基因设计一对检测念珠菌的通用引物,构建二重PCR同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌DNA,然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷核探针杂交,并对女性阴道试子标本进行检测。结果多重PCR可同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌临床或标准菌株DNA,上述念珠菌标准菌株可扩增出302～441bp DNA片段,阴道毛滴虫临床株可扩增出262bp DNA片段。6种念珠菌和阴道毛滴虫的特异性寡核苷酸探针可分别与其相应的PCR产物杂交。通过对150例女性阴道试子进行检测,mPCR-RLB检测念珠菌的阳性率为47.33%,阴道毛滴虫的阳性率为6.67%,二者同时阳性率为1.33%。而培养法检测念珠菌阳性率为36.00%,阴道毛滴虫的阳性率为2.00%,二者同时阳性率为0.67%。明显高于培养法(P<0.05)。结论多重PCR-RLB可快速同时检测念珠菌和阴道毛滴虫,为女性阴道炎的临床诊断提供了一种可靠的方法。     

念珠菌多重PCR鉴定方法的评价

目的:评价多重PCR技术快速准确鉴定深部感染常见的6种念珠菌的效果.方法:应用构建的多重PCR检测体系对白念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和季也蒙念珠菌标准菌株进行检测,并与CHROMagar显色培养结果进行比较.结果:CHROMagar快速显色法对白念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌有较好的鉴别效果,对近平滑念珠菌、光滑念珠菌和季也蒙念珠菌的鉴别比较困难.多重PCR检测体系可以分辨所有6种念珠菌.结论:多重PCR体系较传统的CHROMagar念珠菌显色培养基快速、准确,具有一定的实用性.     

阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定

目的对分离自外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道的常见致病性非白念珠菌进行聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法的鉴定。方法首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、法国科玛嘉(CHROMagar)念珠菌显色培养基及API20CAUX酵母菌鉴定系统将分离自VVC患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种,然后采用真菌通用引物将4种常见非白念珠菌(包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌)进行PCR扩增,并选用MspⅠ和HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。结果在4种非白念珠菌中光滑念珠菌15株(7.50%),近平滑念珠菌7株(3.50%),克柔念珠菌5株(2.50%),热带念珠菌2株(1.00%);PCR扩增后均产生稳定、清晰的条带,扩增产物经MspⅠ,HaeⅢ酶切后分别产生4种和2种特异性带型。结论外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌为主;PCR-RFLP方法在鉴定常见致病性非白念珠菌中比较可靠、稳定、特异,但仍有方法繁琐等不足之处。     

PCR反向线点杂交鉴定常见念珠菌的研究

目的 建立PCR反向线点杂交技术（PCR-RLB）快速检测和鉴定常见念珠菌的方法。方法 以念珠菌属间隔序列Ⅱ（ITS2）为靶基因设计通用引物，用生物素标记反义引物，PCR扩增白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念珠菌DNA，然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷酸探针杂交，并进行临床标本和分离株的检测。结果 念珠菌标准菌株可扩增出302 ~ 441 bp DNA片段，6种特异性寡核苷酸探针可分别与相应念珠菌PCR产物杂交，其敏感性为10 cfu/mL。通过对100例分离株的检测，然后与培养法鉴定（Merieux Vitek）的结果比较，有97株与培养结果一致，另外3株通过DNA测序结果证实与PCR-RLB测定结果一致。通过对200例女性阴道拭子进行检测，PCR-RLB阳性率为49%，而涂片法和培养法阳性率分别为27%和39%，明显高于涂片法和培养法（P < 0.05）。结论 该方法可快速、敏感、准确鉴定临床上常见的念珠菌。     

PCR法扩增角鲨烯环氧化酶鉴定白念珠菌的研究

目的：通过扩增角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,进行PCR来鉴定白念珠菌。方法：根据白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因的开放读框中编码1MSSVKY^6的序列设计上游引物5‘－ATGAGTTCAGTTAAGTATG－3‘,编码^492NEIVR^496的序列设计下游引物5‘-CTATCTTACAATCTCGTTC-3‘,对白念珠菌ATCC11006,22株临床分离株,7株其它致病性念珠菌,8株致病性丝状真菌,1株新生隐球菌及1份人的基因组DNA进行了PCR扩增,并对PCR产物用酶切方法鉴定,结果：所有23株白念菌均可获得约1．5kb大小的PCR产物,16株其它致病性真菌及人的DNA标本均无扩增产物,PCR产物经BamHI酶切,产生两个大小分别约为1．0kb和500bp的片段。结论：利用设计的引物,扩增角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,可以特异地鉴定白念珠菌。     

外阴阴道念珠菌病的致病菌群分析

目的 探讨青岛及周边地区外阴阴道念珠菌病致病菌的菌种特征。 方法 采用常规念珠菌培养方法鉴定菌种,包括沙氏培养基,血清芽管实验,CHROMagar念珠菌显色培养基及API 20C AUX酵母菌鉴定系统。结果 2011年5 ~ 11月共收集362例妇科门诊患者的阴道分泌物,病原学分析显示,念珠菌阳性例数为313例,总感染率为86.46%,菌种构成分布为白念珠菌275株,光滑念珠菌13株,近平滑念珠菌8株,热带念珠菌7株,克柔念珠菌5株,葡萄牙念珠菌1株,都柏林念珠菌1株,粘质红酵母菌1株,奥默毕赤酵母菌1株,粘性丝孢酵母菌1株。结论 白念珠菌仍是外阴阴道念珠菌病的常见致病菌,非白念以光滑念珠菌为主。     

PCR-RFLP鉴别念珠菌、曲霉和隐球菌的探讨

为快速鉴别３类医学上重要真菌－念珠菌、曲霉和隐球菌,应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）的分子生物学说法方法对白念珠菌、克柔念珠菌、季地蒙念珠菌、近平滑珠菌、热带念珠菌、乳念珠菌、新生隐球菌格梯变种、新生隐球菌新生变种、罗伦隐球菌格梯变种、新生隐球菌新生变种、罗伦隐球菌１、工霉、黄曲霉和杂色曲霉进行体外研究。新生隐新生变种、罗伦隐球菌、曲霉隐球菌放增出３１０ｂｐ经ＰＣＲ含珠菌、     

在免疫损伤病人中的霉菌性菌血症

本文报道了110名免疫损伤的住院病人霉菌性菌血症的发生情况:一、110名病人中男61例,女49例;平均年龄46.9岁.二、致病菌株:白念珠菌40例;热带念珠菌25例;光滑球拟酵母菌22例;副拔毛念珠菌13例;新型隐球菌6例;克柔氏念珠菌3例和伪热带念珠菌1例.发现热带念珠菌菌血症的发病率逐年在增加,而白念珠菌菌血症的发病率有所下降.     

外阴阴道念珠菌病的病因研究及体外药敏检测

目的了解福州地区阴道念珠菌病的病因、致病菌的菌种特征。方法采用科玛嘉念珠菌显色培养基和YBC鉴定卡及API-20C AUX酵母菌鉴定系统对门诊就诊661例患者阴道分泌物分离到的332株致病真菌进行鉴定,并采用ROSCO纸片扩散法对4种抗真菌药进行药物敏感检测。结果总感染率为69.45%共分离菌种6种。339株念珠菌,其中白念珠菌为288株占85%,光滑念珠菌23株占6.8%,热带念珠菌12株占3.54%,克柔念珠菌7株占2%,近平滑念珠菌4株占1.18%,光滑假丝酵母菌4株占1.18%,酿酒酵母菌1株占0.29%。结论本地区念珠菌性阴道炎主要的病原菌以白色念珠菌为主,其次是光滑念珠菌、热带念珠菌。     

念珠菌碱溶性β—葡萄糖水解生成葡萄糖含量的分类鉴定意义

目的：探讨8种医学上重要的念珠菌酵母相胞壁碱溶性β－葡聚糖解生成的D－葡萄糖占菌体干重含量百分率的分类鉴定意义。方法：采用双波长薄层扫描法，测定65株8种念珠菌及8种酿酒酵母的标准菌株上述含量值，并检测46株念珠菌临床分离株，且与标准株结果相比较。结果：实验结果经Tukey法统计处理，可将9种菌分为3个同质性亚群，亚群1：酿酒酵母、克柔、季也蒙、光滑、热带念珠菌（P＝0．065），亚群2：克柔、季也蒙、光滑、热带、近平滑、伪热带、星形念珠菌（P＝0．336），亚群3：白念珠菌（P＝1．000）。此外，酿酒酵母与8种念珠菌经t检验，均有显著性差异。临床分离株与标准标均无显著性差异。结论：该指标能在属水平区分念珠菌和酿酒酵母，可将8种念珠菌分为3个亚群，且重复性较好。因此似能作为一种念珠菌分类鉴定研究的化学分类法指标。     

DNA芯片鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变

目的 建立DNA芯片技术鉴定念珠菌种和氟康唑耐药基因ERG11突变。方法 根据6种常见念珠菌内转录间隔（ITS2）区种特异性序列和白念珠菌ERG11基因中已证实可导致对氟康唑耐药的6种突变序列设计探针,制备DNA芯片,鉴定12条50 bp的念珠菌种特异性序列和ERG11突变序列及34株念珠菌（其中白念珠菌29株,热带念珠菌、光滑念珠菌、都柏林念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌各1株）。结果 ①芯片正确鉴定12条人工合成序列;②正确鉴定34株试验菌株的菌种;③正确鉴定29株白念珠菌ERG11基因中可致耐药的已知突变。敏感性和特异性均为100%。结论 用DNA芯片进行念珠菌菌种鉴定和白念珠菌ERG11突变筛查,结果可靠。     

常见病原念珠菌鉴定的数码分类方法

建立了一种用于常见病原性念珠菌菌种鉴定的多种碳源同化试验及结果分析的数码分类方法。结果，对１４种碳源固相同化试验结果的编码分析可形成５位数码，进而形成１８种数码可明确区分８种受试的病原念珠菌。结果表明，多种碳源同化试验及编码分析方法可以快速、明确地鉴定８种临床最常见的念珠菌，也为今后建立临床酵母菌快速鉴定系统打下了基础。     

实时荧光定量PCR快速鉴定五种常见念珠菌

[摘要] 目的 建立实时荧光定量PCR快速检测和鉴定五种常见念珠菌的方法并探讨其可行性。方法 应用真菌通用引物ITS4和ITS86,分别构建五种常见念珠菌重组质粒,进行实时荧光定量PCR检测,绘制融解温度曲线图,并对融解温度进行统计学分析。结果 五种常见念珠菌融解温度为：（87.33±0.13）℃（白念珠菌）、（84.39±0.20）℃（热带念珠菌）、（85.53±0.18）℃（近平滑）、（86.47±0.10）℃（光滑念珠菌）、（91.41±0.18）℃（克柔念珠菌）。结论：本研究显示实时荧光定量PCR方法可快速检测和鉴定五种常见念珠菌。     

采用葡萄糖消耗法快速测定念珠菌对唑类药物的敏感性

目的:探讨采用葡萄糖消耗法进行快速念珠菌药敏试验的实用性和优越性。方法:采用葡萄糖消耗法快速检测104株念珠菌对氟康唑和伊曲康唑的敏感性,并和NCCLS M27-A方案微量法进行比较。受试菌株主要分离自临床深部真菌感染的患者,包括白念珠菌(C. albicans)45株、近平滑念珠菌(C. parapsilosis)24株、热带念珠菌(C.tropicalis)17株、克柔念珠菌(C.krusei)10株、光滑念珠菌(C. glabrata)8株。结果:对于氟康唑,两种方法在±1个、±2个稀释度范围内的一致性为76.0％和89.4％;对于伊曲康唑,两种方法的一致性分别为82.7％和89.4％。结论:葡萄糖消耗法和NCCLS M27-A方案微量法的一致性较高,可以用于念珠菌药敏的快速测定。     

奶粉吐温琼脂鉴定白念珠菌的实验研究

目的 改进白念珠鉴定方法。方法 设计奶粉吐温琼脂（ＭＴＡ）可一次鉴定白念珠菌的芽管和顶端厚壁孢子,并选择来源不同的１０３株念珠菌（白念珠菌８８株,克柔念珠菌,季也蒙念珠菌,近平滑念珠菌、热带念珠菌和乳酒念珠菌各３株）与灭活人血清和玉米吐温琼脂相比较。结果 ８８株白念珠菌在ＭＴＡ上能产生芽管的有６９株,在灭活人血清上有７８株。ＭＴＡ上能产生芽管的有６９株,在灭活人血清上有７８株。ＭＴＡ ２４ｈ能产生     

复发性阴道念珠菌病念珠菌的菌种及药敏分析

目的：了解复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)临床分离菌株及其对几种常见抗真菌药物的敏感性：方法：分别采用念珠菌显色培养基和ROSCO纸片扩散法进行RVVC念珠菌菌种鉴定和药敏试验。结果：62株阳性标本中,分离出白念珠菌47株(75．81％),热带念珠菌4株(6．45％),光滑念珠菌2株(3．23％),克柔念珠菌5株(8．06％),其他念珠菌4株(6．45％)．62株念珠菌对4种常用的抗真菌药物,即两性霉素B、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑的敏感率分别为：100．00％(62／62)、88．71％(55／62)、96．77％(60／62)、95．16％(59／62)。结论：RVVC的主要致病菌仍是白念珠菌,但非白念珠菌所占比例呈上升趋势：RVVC分离菌株对咪唑类抗真菌药物仍有较高的敏感率。     

2002-2003年中国部分地区甲真菌病致病菌流行病学调查报告

目的：调查2002-2003年我国甲真菌病致病菌流行情况。方法：在全国进行多中心开放性研究，自2002年5月-2003年11月，采用统一培养基，多点接种法进行研究。结果：从1084例患者965个培养基中分离出739株致病菌．其中皮癣菌占首位，而皮癣菌中红色毛癣菌占56．4％，须癣毛癣菌占5．5％，犬小孢子菌占0．3％，石膏样小孢子菌占2．6％．絮状表皮癣菌占1．5％，紫色毛癣菌占0．1％等；酵母菌居第2位，其中白念珠菌占10．0％，光滑念珠菌占5．1％，热带念珠菌占4．5％．近平滑念珠菌占5．8％，克柔念珠菌占1．9％等；霉菌居第3位。结论：甲真菌病致病菌中酵母菌类日益增多，故治疗应个体化．宜选用广谱抗真菌药物治疗。     

试管法检测氟康唑和特比萘芬对常见致病性真菌的敏感性观察

目的(1)检测氟康唑和特比萘芬对临床常见真菌的敏感性;(2)探讨并建立皮肤癣菌的标准药敏试验方法.方法以NCCLS M27-A方案试管法为基础,检测氟康唑和特比萘芬对24株念珠菌和20株皮肤癣菌的敏感性.结果氟康唑对大部分念珠菌的敏感性较好,对皮肤癣菌的敏感性较差,而特比萘芬对皮肤癣菌高度敏感.结论NCCLS M27-A方案具有重复性好、一致性高的特点,可应用于酵母菌和皮肤癣菌的体外药敏实验.