高效液相色谱法测定鼠肝微粒体中CYP1A2酶的活性及动力学考察

目的:建立以非那西丁为探针的高效液相色谱-紫外检测的实验方法,测定大鼠肝微粒体中CYP1A2酶活性并对其进行动力学考察。方法:采用Shimadzu Shim-Pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为:100 mmol·L-1磷酸二氢钠缓冲液(pH 4.3)和乙腈,梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,柱温为室温,检测波长245 nm。非那西丁与大鼠肝微粒体在37℃温孵60 min,加入冰甲醇终止,12000 r.min-1离心10 min,取上清进行HPLC分析,以Lineweaver-Burk作图计算Vmax与Km值。结果:非那西丁、对乙酰氨基酚及其内标间乙酰氨基酚三者分离良好且无内源性干扰。对乙酰氨基酚最低检测限50 nmol·L-1,线性范围0.1～10μmol·L-1。日内日间精密度均小于10%。回收率大于75%。动力学考察表明选择甲醇作为终止试剂效果较好,非那西丁在0.2 mg·mL-1大鼠肝微粒体体系中孵育60 min,测得动力学参数Vmax为0.21 nmol·min-1.mgprotein-1,Km为20.39μmol·L-1。结论:该方法稳定,结果能准确地反映CYP1A2酶的活性,可以用于相关动力学研究。     

补骨脂酚的体外肝微粒体代谢及代谢减毒作用的种属比较

目的研究补骨脂酚在人、比格犬和大鼠肝微粒体的体外代谢动力学及种属差异,评价不同种属肝微粒体对补骨脂酚人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)的减毒作用。方法应用MTT法检测HK-2细胞的存活率来评价补骨脂酚对HK-2细胞的毒性作用以及不同种属肝微粒体对其毒性的影响。应用HPLC法分析补骨脂酚在3个种属肝微粒体孵育液中的剩余浓度,研究其在肝微粒体中的代谢稳定性和代谢动力学。结果在3个种属肝微粒体分别作用下,补骨脂酚的HK-2细胞毒性明显降低。补骨脂酚在人肝微粒体中的代谢最慢,在大鼠肝微粒体中的代谢最快,人、犬和大鼠的代谢动力学参数Km、Vmax、T21和CLint分别为:(81.66±3.41),(89.35±4.32)和(31.89±2.60)μmol.L-1;(0.47±0.01),(0.57±0.01)和(1.88±0.09)μmol.L-1.min-1;(44.14±1.13),(53.31±0.29)和(6.79±0.39)min;(39.38±1.04),(65.16±0.35)和(365.92±20.01)ml.min-1.kg-1。结论肝微粒体降低补骨脂酚的HK-2细胞毒性,这一减毒作用与补骨脂酚经肝微粒体酶的代谢相关。补骨脂酚的体外肝代谢动力学性质存在着一定的种属差异;犬肝微粒体对高浓度补骨脂酚所致的HK-2细胞毒性的降低作用要弱于人和大鼠肝微粒体。     

LC-MS/MS法测定人血浆中的金刚烷胺浓度及其药动学

目的建立HPLC-MS/MS分析方法测定人血浆中的金刚烷胺浓度,并用于研究健康受试者口服氨酚咖黄烷胺片后金刚烷胺的药动学。方法血浆经乙醚-二氯甲烷(4∶1,V/V)提取,采用C18柱为分析柱,甲醇-10 mmol.L-1醋酸铵溶液-冰醋酸(60∶40∶0.08,V/V/V)为流动相,流速1.0 mL.min-1,柱后分流,0.2 mL.min-1进入质谱,柱温35℃。质谱检测方式:多反应离子监测,选择监测的离子为m/z152→m/z135(金刚烷胺)和m/z275→m/z230(内标物,氯苯那敏)。结果金刚烷胺的线性范围为1~200μg.L-1(r=0.9999),血浆中金刚烷胺的最低定量限达1μg.L-1(RS,N>10),回收率>80%。结论本法简便、准确、灵敏度高,适用于金刚烷胺的药动学研究。     

基于细胞色素P450 2B6酶的补骨脂素对环泊酚代谢的影响

目的 通过体外大鼠肝微粒体孵育实验考察环泊酚的酶促反应动力学,并进一步探究补骨脂素对其代谢的影响。方法 色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(250.0 mm×4.6 mm, 5μm),柱温：30℃,流动相：乙腈-水=73∶27,检测波长：272 nm,流速：1.0 mL·min^-1,进样量：20μL,内标为丙泊酚。大鼠肝微粒体与系列浓度的环泊酚注射液共同孵育,用Graph Pad Prism 8软件计算环泊酚的米氏常数(K_m)、最大反应速度(V_max)和固有清除率(CL_int);孵育体系中加入系列浓度的补骨脂素,用HPLC法测定大鼠肝微粒体中的环泊酚减少量,并计算半数抑制浓度(IC₅₀),考察补骨脂素对环泊酚代谢的影响。结果 环泊酚在大鼠肝微粒体孵育体系中的K_m为129.8μmol·L^-1,V_max为98.42 nmol·min^-1·mg protein^-1,CL...     

HPLC-RF测定小鼠肝微粒体中CYP2A5的酶活性

目的 以香豆素为探针底物建立测定小鼠肝微粒体中CYP2A5酶活性的方法.方法 用Waters Symmetry C18柱;流动相为0.1％醋酸-乙腈=70∶ 30;流速为1.0 mL·min-1,柱温30℃,Ex=340 nm,Em =458 nm.香豆素与小鼠肝微粒体在37℃孵育20 min,加入含内标的冰乙腈终止,4℃、12000 r·min-1离心15 min,取上清液,用HPLC测定其代谢产物7-羟基香豆素的含量,以GraphPad Prism 5.0作图计算酶动力学参数.结果 7-羟基香豆素与内标两者分离良好.7-羟基香豆素的检测限为2nmol · L-1(S/N≥3),线性范围为8～ 800 nmol·L-.日内日间精密度RSD小于5％,回收率为91.3％～101.4％.香豆素羟化反应的Km为2.15 μmol·L-1;Vmax为9.74 pmol·(min·mg protein)-1.结论 该方法稳定可靠,灵敏度高,适于体外CYP2A5酶活性的测定.     

补骨脂素和异补骨脂素在大鼠和人肝微粒体的酶促动力学

目的研究中药有效成分补骨脂素和异补骨脂素的细胞色素P450(CYP)酶促动力学特征,比较其结构和种属差异,为体内药代动力学特征的预测提供科学依据。方法建立补骨脂素和异补骨脂素的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测方法,在优化人和大鼠肝微粒体孵育体系和评价体外代谢稳定性的基础上,进行了代谢稳定性和酶促动力学研究,应用非线性回归法计算最大反应速率(V_(max))和米氏常数(K_m)。结果应用建立的LC-MS/MS检测方法,补骨脂素、异补骨脂素在肝微粒体孵育液中定量范围为0.1~50.0μmol·L~(-1),线性关系良好,精密度和准确度等满足检测要求。体外代谢稳定性研究显示,当底物浓度为1μmol·L~(-1),蛋白浓度为0.5 g·L~(-1),孵育40 min内,补骨脂素和异补骨脂素在大鼠和人肝微粒体呈线性消除,体外半衰期分别为74.5,95.0,74.5和173.3 min。补骨脂素在大鼠和人肝微粒体中的V_(max)分别为:(1.140±0.080)μmol·min-1·g-1蛋白,(0.620±0.060)μmol·min-1·g-1蛋白;K_m分别为(12.9±0.3)μmol·L~(-1)和(7.4±1.3)μmol·L~(-1)。异补骨脂素在大鼠和人肝微粒体中的V_(max)分别为(0.251±0.012)μmol·min-1·g-1蛋白和(0.103±0.014)μmol·min-1·g-1蛋白;K_m分别为:(3.0±0.4)μmol·L~(-1)和(3.4±0.7)μmol·L~(-1)。结论补骨脂素和异补骨脂素的CYP酶促动力学特征及代谢稳定性具有一定的种属和结构差异,在大鼠两者基于CYP酶的代谢清除过程可能相似。而在人体,异补骨脂素的CYP代谢清除可能慢于补骨脂素,导致药代动力学特征的差异。     

2005高效液相色谱法测定肾组织中的西洛他唑

建立测定肾组织中西洛他唑含量的高效液相色谱法.色谱柱Shim-pack VP-ODS,Shim-pack C18预柱;流动相乙腈-水(4555);流速1.0ml·min-1;柱温25℃;检测波长254nm.线性范围50μg·L-1～1600μg·L-1,r=0.9996;回收率均在98%以上(n=5),RSD＜4%;最低检测限10μg·L-1.本法简便,快速,重现性好,适于西洛他唑的药动学研究.     

山姜素在人肝微粒体的葡萄糖醛酸化反应研究

目的研究体外肝微粒体孵育体系中山姜素的葡萄糖醛酸化代谢情况,鉴定参与山姜素葡萄糖醛酸化代谢的UGT亚型。方法用体外肝微粒体孵育体系,用HPLC-UV检测方法,检测山姜素的葡萄糖醛酸化代谢情况。将代谢产物进行纯化后,用质谱(MS)和核磁共振(NMR)法进一步鉴定其结构。用商业化重组表达的UGT单酶,鉴定代谢产物的结构和归属可能参与山姜素葡萄糖醛酸化代谢反应的葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)亚型。结果山姜素葡萄糖醛酸代谢产生一个代谢产物,经结构鉴定为山姜素-氧-单葡萄糖醛酸化产物。人肝微粒体代谢山姜素的动力学行为,符合米方程且动力学参数:Vmax=(101.9±3.0)nmol·min-1·mg-1·pro,Km=(40.6±3.6)μmol·L-1。UGT1A1、UGT1A3、UGT1A9和UGT2B15均参与了山姜素的葡萄糖醛酸化反应。结论山姜素在人肝微粒体孵育体系中会被代谢成为一个单葡萄糖醛酸化产物,且归属了参与的UGT酶。     

石榴叶鞣质中短叶苏木酚在大鼠体内药代动力学变化

目的建立测定短叶苏木酚血药浓度的高效液相色谱方法,探讨大鼠ig石榴叶鞣质后体内短叶苏木酚动力学变化。方法色谱条件依利特Hypersil色谱柱;流动相为乙腈-5mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(pH25;86∶14,V/V);流速10ml·min-1;紫外检测波长为276nm,以短叶苏木酚峰面积定量。结果短叶苏木酚在176~880μg·L-1内线性良好,回归方程为^Y=393E5X+182E3(n=5),相关系数r2=09994,血浆中最低检测浓度为176μg·L-1。其352,176,880μg·L-13个浓度的回收率>85%,日内日间变异<7%。大鼠ig石榴叶鞣质后短叶苏木酚体内吸收、分布及消除均较快,符合二室开放模型。结论短叶苏木酚可以部分的反映了石榴叶鞣质的药代动力学特征。     

大鼠肝细胞色素P4503A活性测定及其孵育条件的优化

目的:测定大鼠肝微粒体中细胞色素P4503A(CYP3A)的活性,并对其体外孵育条件进行优化。方法:采用1’-羟基咪哒唑仑的生成量表示肝中CYP3A的活性,高效液相色谱法测定肝微粒体中1’-羟基咪哒唑仑的浓度,用单因素试验法对其体外孵育条件进行优化,用线性Lineweaver-Burk双倒数作图法研究肝CYP3A酶促动力学。结果:1’-羟基咪哒唑仑在18.20~1 820.00μg.L-1范围内线性关系良好;体外优化的孵育条件为5μmol.L-1咪哒唑仑、0.102mg肝微粒体、孵育15min;肝CYP3A酶促动力学参数Km为1.67μmol.L-1,Vmax为95.15pmol.min-1.mg-1。结论:HPLC法操作简便、灵敏、快速,适用于肝微粒体中1’-羟基咪哒唑仑的浓度测定,肝CYP3A孵育条件及其酶促动力学研究为研究经CYP3A代谢的药物相互作用及其他物质对CYP3A酶的影响提供理论依据。     

菌体中L-5-甲基四氢叶酸的HPLC法检测

目的:建立高效液相色谱法测定菌体中L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)的方法。方法:加热法破碎细胞,强碱性阴离子交换树脂纯化,高效液相色谱柱为C18反向柱,流动相为K2HPO4(0.02 mol.L-1,pH7.2)-甲醇(84∶16)溶液,流速为1.0 mL.min-1,柱温为40℃,检测波长为290 nm。结果:L-5-MTHF在0.5～50μg.mL-1范围内线性良好,r=0.999 5,RSD为1.11%。结论:色谱法灵敏、准确、重现性好,可用于菌体中L-5-甲基四氢叶酸的定性与定量。     

HPLC法同时测定阿司匹林维生素C分散片中两种成分含量

目的采用高效液相色谱法同时测定阿司匹林维生素C分散片中阿司匹林和维生素C的含量。方法使用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱,流动相为乙腈-甲醇-0.01mol.L-1磷酸二氢钾溶液-三乙胺（5∶40∶55∶0.1）（用磷酸调pH至2.5）,柱温为30℃,流速为1.0mL.min-1,检测波长为270nm。结果阿司匹林和维生素C的线性范围分别为101.12～505.60μg.mL-1（r=0.9998）,60.46～302.30μg.mL-1（r=0.9997）;平均回收率分别为100.5%、99.2%,RSD分别为0.69%、0.55%。结论该方法快速、简便、灵敏,分离度好,其他成分无干扰,适用于控制产品质量。     

速效止泻胶囊定性定量检测方法研究

目的:建立速效止泻胶囊的定性定量检测方法。方法:采用TLC法鉴别速效止泻胶囊中盐酸小檗碱和拳参;采用HPLC法测定处方中盐酸小檗碱含量及拳参中绿原酸含量。盐酸小檗碱色谱条件:依利特Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-三乙胺(40∶60∶0.1)为流动相,流速1 mL·min-1,紫外检测波长346 nm,柱温为30℃;绿原酸色谱条件:依利特Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-三乙胺-磷酸(7∶93∶0.4∶0.3)为流动相,流速1 mL·min-1,紫外检测波长327 nm,柱温为30℃。结果:盐酸小檗碱和拳参薄层色谱定性鉴别特征明显;盐酸小檗碱与绿原酸含量测定,分别在2.0～6.0μg(r=0.9992)和0.1～1.8μg(r=0.9999)线性关系良好;平均回收率(n=6)分别为99.2%和102.3%,RSD分别为0.77%和1.3%。结论:本法可准确地定性、定量,有效地控制速效止泻胶囊的质量。     

HPLC法测定注射用阿奇霉素的含量

目的：建立反相高效液相法测定注射用阿奇霉素含量的方法。方法采用Inertsil ODS柱（4．6 mm ×250 mm,5μm）,以0．1 mol·L－1乙酸铵（用氨水调节pH值至8．6）—乙腈—甲醇（50∶30∶20）为流动相,流速1．0 mL·min－1,检测波长218 nm,柱温60℃。结果阿奇霉素的线性范围为100～2000 mg·L－1,r＝0．9998,平均回收率98．8％,RSD＝0．6％（n＝9）。结论该方法简便快速、准确,更适于控制注射用阿奇霉素的质量。     

HPLC法测定大鼠肝微粒体中睾酮的含量

目的:建立以高效液相色谱法测定大鼠肝微粒体中细胞色素P4503A4(CYP3A4)探针底物睾酮含量的方法。方法:色谱柱为Ultimate-XB C18,流动相为水-乙腈(50∶50),内标为地西泮,流速为1.0mL·min-1,检测波长为245nm,柱温为30℃,进样量为20μL。结果:睾酮生物样品检测浓度的线性范围为10.0～200.0μmo·lL-1(r=0.9995);低、中、高浓度的平均方法回收率分别为86.15%、103.10%、97.48%,平均相对回收率为111.15%、107.24%、100.78%,日内RSD分别为3.92%、2.46%、2.82%,日间RSD分别为2.98%、1.34%、2.41%。结论:本方法简便快速、灵敏度高、重复性好,可用于大鼠肝微粒体中CYP3A4活性的测定及相关研究应用。     

水胺硫磷在大鼠肝微粒体的生物转化和代谢动力学

目的 探讨水胺硫磷在大鼠肝微粒体的体外代谢活化产物及代谢动力学特征。方法 应用液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC/QTOF MS)筛查并鉴定水胺硫磷在大鼠肝微粒体孵育液中的氧化产物。用乙酰胆碱酯酶抑制法考察水胺硫磷及其氧化产物水胺氧磷的抑酶活性。应用液相色谱-三重四级杆串联质谱(LC/Triple-Q MS/MS)定量检测肝微粒体中的水胺硫磷及其代谢产物水胺氧磷,研究水胺硫磷及其产物的消长动力学和氧化产物生成的酶动力学。结果 筛查并鉴定了水胺硫磷在大鼠肝微粒体的氧化脱硫产物水胺氧磷。水胺氧磷对乙酰胆碱酯酶的抑制活性远高于水胺硫磷,IC₅₀值比水胺硫磷低4个数量级,表明水胺硫磷的氧化脱硫反应是一个代谢活化过程。水胺硫磷在大鼠肝微粒体中的半衰期(t_1/2)为14.6 min,外推得到体内肝清除率Cl_H为43.8 ml·min^-1·kg^-1。水胺氧磷的生成符合双相酶动力学模型,K_m,app1为1.12 μmol·L^-1,产物生产最大速率(V_max1)为0.43 μmol·min^-1·g ^-1;蛋白K_m,app2为67.92 μmol·L^-1,V_max2为1.28 μmol·min^-1·g ^-1蛋白。结论 水胺硫磷在大鼠肝微粒体中能快速代谢消除,生成抑酶活性更高的产物水胺氧磷而产生毒性。     

RP-HPLC法测定痹痛宁胶囊中士的宁和马钱子碱的含量

采用反相高效液相色谱法测定痹痛宁胶囊中士的宁和马钱子碱的含量。色谱柱CAP-CELL C18(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相:水-乙腈(80∶20)(含三乙胺0.01 mol·L-1,用磷酸调pH至2.6±0.1);检测波长260 nm;流速1.0 mL·min-1;柱温25℃。测得士的宁和马钱子碱的浓度分别为0.2097～3.1455μg(r=0.9996)和0.0952～1.4280μg(r=0.9994),平均回收率(n=9)分别为99.2%、99.3%。     

HPLC法测定大鼠离体肝微粒体中氯胺酮和去甲氯胺酮的含量及其性别差异研究

目的:建立同时测定大鼠离体肝微粒体中氯胺酮和去甲氯胺酮含量的方法,比较氯胺酮在雌雄大鼠肝微粒体中代谢的性别差异。方法:采用高效液相色谱法,以非那西丁为内标,色谱柱为WelchromC18,流动相为乙腈-0·015mol·L-1乙酸胺(加醋酸调pH5·85)=40:60,流速为1mL·min-1,检测波长为215nm,柱温为30℃,进样量为20μL。比较5～1000μg·mL-1氯胺酮在雌雄大鼠离体肝微粒体(1·0mg·mL-1)中孵育15min的代谢情况。结果:氯胺酮检测浓度的线性范围为0·1～20·0μg·mL-1(r=0·9999)和20·0～1000·0μg·mL-1(r=0·9994),去甲氯胺酮的线性范围为0·1～20·0μg·mL-1(r=0·9998),最低检测限均为2ng·mL-1;日内RSD均小于10·8%,日间RSD均小于12·7%;方法回收率分别为(89·6±8·5)%～(102·5±6·4)%、(86·5±3·6)%～(101·7±4·8)%,提取回收率分别为(90·6±6·3)%～(92·8±4·2)%、(84·5±7·9)%～(87·7±5·5)%。加药量在5～1000μg·mL-1时,氯胺酮消除速率和去甲氯胺酮生成速率在雄大鼠肝微粒体中均明显高于雌大鼠。结论:本方法灵敏、简便、准确,可用于大鼠肝微粒体中氯胺酮和去甲氯胺酮的含量测定。氯胺酮在大鼠离体肝微粒体中的代谢存在性别差异。     

高效液相色谱法测定皮肤透过液中酮康唑浓度

目的建立测定Franz实验制得的皮肤透过液中酮康唑浓度的高效液相色谱法,为研究酮康唑经皮给药后药动学奠定基础。方法采用高效液相色谱法测定皮肤透过液中酮康唑浓度,ECOSIL C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相：甲醇 0.02 mol&#8226;L－1 磷酸二氢钾溶液（70：30,用0.01 mol&#8226;L－1氢氧化钠溶液调节pH至6.8）,流速：1.0 mL&#8226;min－1,柱温35 ℃,紫外检测波长235 nm。结果酮康唑线性范围0.05～25.00 μg&#8226;mL－1（r＝0.999 3）。高、中、低浓度平均回收率98.109%,RSD＝2.956%（n＝9）,日内精密度和日间精密度RSD均＜3.30%。结论该方法测定酮康唑乳膏皮肤透过液中的酮康唑含量快速、简捷,可用于酮康唑乳膏剂的质量控制和酮康唑经皮吸收研究。