成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

大鼠嗅球成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞（Olfactory cnsheating cells,OECs）分离与培养的方法。方法：无菌条件下嗅球置于少量人工脑脊液中，用眼科镊子直接将嗅球撕烂、挤压，得片状组织块，胰酶消化，吹打，细胞悬液进行培养。结果：本方法分离、培养的OECs具有双极或多极突起，且突起十分细长，神经生长因子受体和胶质纤维酸性蛋白免疫组化呈阳性。结论：该方法简便易行，为深入研究OECs神经生物学特性、阐明促进中枢神经元轴突生长的作用机制打下基础。     

大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分裂增殖和免疫细胞化学特性

目的:体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs),观察其形态、分裂增殖和免疫细胞化学特性,探索自体嗅黏膜嗅鞘细胞作为OECs来源的可能性。方法:采用差时贴壁的方法分离培养成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞,相差显微镜下观察细胞形态和分裂增殖;用免疫组化方法观察GFAP、NGFRp75、S鄄100、NGF、BDNF、NT鄄3的表达。结果:培养的细胞根据形态来分,可分为双极、多极和偏平状;细胞分裂时先回缩成球形,分裂成两个子球,再伸出突起,变成梭形或多极形。GFAP、NGFRp75、S鄄100、BDNF和NT鄄3表达阳性。结论:在含血清培养基上,大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞能正常分裂增殖和分泌神经营养因子。     

成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的分离、培养、纯化与生物学特性的研究

目的探讨成年大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的分离、培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫细胞化学特性。方法采用原代培养技术,从成年大鼠的嗅球分离培养OECs,用差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体等方法纯化培养OECs,并用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）扩增OECs,倒置相差显微镜下观察OECs的形态变化特点及生长情况,采用GFAP、NGFRp75、S100等抗体行免疫细胞化学染色,根据NGFRp75免疫细胞化学染色结果统计培养的OECs的纯度,并计算OECs的增殖率。结果体外培养的成年大鼠OECs主要为双极或三极细胞,其突起细长。差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法的纯化效率高于其他两种。免疫细胞化学染色显示,培养的成年大鼠OECs呈现GFAP、NGFRp75、S100蛋白染色阳性。bFGF能明显促进OECs的增殖（P〈0.01）,对OECs的形态、纯度没有明显影响。结论差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法是一种高效率的纯化培养OECs的方法,bFGF能明显促进OECs的增殖。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs)的分离培养方法并观察其形态。方法：采用差时贴壁和阿糖胞苷(Ara—c)抑制相结合的方法培养嗅鞘细胞,并在不同阶段进行观察和行NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定。结果：成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形3种类型,突起细长编织成网状。结论：差时贴壁和Ara—c抑制相结合的纯化培养方法是一种简单而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。     

人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响

目的:观察人血清及神经生长因子对成人鼻黏膜嗅鞘细胞体外增殖的影响.方法:取成人(自愿者)鼻腔嗅黏膜,制成细胞悬液,分别用DF12培养基(对照组)、10 ng/ml NGF DF12培养基、10%胎牛血清的DF12培养基、10 ng/ml NGF 10%胎牛血清的DF12培养基、10%人血清的DF12培养基和10 ng/mlNGF 10%人血清的DF12培养基培养细胞,并用差时贴壁法纯化嗅鞘细胞.采用MTT法观察上述各种培养液对嗅鞘细胞增殖的影响.结果:加入与不加入NGF培养液组之间的光密度无统计学意义(P＞0.05);胎牛血清组、人血清组与对照组之间的光密度有显著统计学意义(P＜0.01);胎牛血清组和人血清组之间的光密度无统计学意义(P＞0.05).结论:人嗅鞘细胞的体外培养对血清具有依赖性,人自体血清培养可替代胎牛血清用于嗅鞘细胞的体外培养、扩增.本研究结果为人嗅鞘细胞的自体移植治疗脊髓损伤提供了可行性基础.     

新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

嗅球成鞘细胞的培养纯化及与功能相关的形态学研究

目的 培养纯化嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)并对其进行免疫细胞化学研究，探讨其相关功能。方法 分离嗅球嗅神经纤维层获得嗅球成鞘细胞，采用免疫溶解法对培养的嗅球成鞘细胞进行纯化，并利用免疫细胞化学方法和电镜技术进行形态学观察。结果 通过纯化可以使培养的OECs纯度达95％以上，免疫细胞化学显示OECs表达P75NGFr、GAP43、N—CAM和GFAP；电镜结果显示OECs呈分叶状核，胞浆电子致密，胞膜有伪足样皱褶。结论 免疫溶解法可以较好的纯化OECs并保持其良好的生长状态，培养的OECs表达P75NGFr、GAP43、N-CAM可能与其促进轴突再生的功能相关。     

大鼠嗅成鞘细胞培养不同分离方法对纯度的影响

目的通过对多种分离方法的比较获得较为理想的嗅成鞘细胞的分离措施。方法应用3种不同分离方法各取12份样本,对同一条件下培养10d的细胞纯度进行p75NGFR免疫细胞化学测定及统计分析;结果(1)3种不同分离方法取材平均活细胞率:传统分离法(组)为84.52%,直接挤压法(组)为97.33%,机械过滤法(组)为83.97%,直接挤压(组)法分散后的OECs活细胞数量最多(P<0.05);(2)3种分离方法取材、培养所获得的OECs纯度:传统分离法(组)为67.58%,直接挤压法(组)为91.23%,机械过滤法(组)为63.51%;直接挤压法(组)培养细胞纯度最高(P<0.05)。结论嗅成鞘细胞最佳分离措施为直接挤压法,应用直接挤压法可收获大量嗅成鞘细胞,对OECs进一步的基础研究以及将来的临床应用奠定了基础。     

低氧诱导的大鼠嗅黏膜来源嗅鞘细胞自噬及其对细胞增殖能力的影响

目的: 探讨低氧诱导SD新生鼠嗅黏膜来源嗅鞘细胞(OECs)自噬的发生,分析自噬对细胞增殖能力的影响。方法: 采用酶消化法和改良的Nash差速贴壁法分离提纯培养SD新生鼠嗅黏膜来源OECs,利用免疫荧光法鉴定细胞属性和纯度。以低氧条件(氧浓度为2％)培养的SD新生鼠嗅黏膜来源OECs作为低氧处理组,以正常条件下培养的OECs作为对照组,采用自噬抑制剂3-MA处理后的OECs继续在低氧条件下培养作为3-MA低氧处理组。相差显微镜下观察各组细胞形态;Western blotting法检测对照组、4h低氧处理组和8h低氧处理组OECs中低氧诱导因子1α(HIF-1α)、自噬标志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和自噬标志基因Beclin-1的蛋白表达水平;采用CCK-8法检测对照组、3-MA低氧处理组、低氧处理组和3-MA低氧处理组OECs的增殖能力。结果: 在对照组、低氧处理组和3-MA低氧处理组经分离提纯的OECs均呈梭形,表现为典型的双极、三极细胞形态,3组间无明显差异。OECs呈NGFRp75和GFAP阳性,纯度为87%;与对照组比较,低氧处理组OECs中HIF-1α表达水平升高(P<0.05),LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1表达水平升高(P<0.05);与低氧处理组比较,3-MA低氧处理组OECs增殖能力降低。结论: 低氧诱导的自噬可降低SD新生鼠嗅黏膜来源OECs的增殖能力。     

Culture and purification of human fetal olfactory bulb ensheathing cells

Objective：To obtain high purity of human fetal olfactory bulb ensheathing cells （OB-hOECs） in vitro and to develop a simple and effective method for primary culture of OB-hOECs. Methods： OB-hOECs were cultured based on the differential rates of attachment of the various harvested cell types. Then the method was combined with arabinoside cytosine （Ara-C）inhibition, serum-free starvation or intermittent neurotrophin 3 （NT3） nutrition method to observe cell states in different cultural environments. The purity of OB-hOECs was assessed with immunocytochemical analysis. Results： OB-hOECs appeared bipolar and tripolar shape, with slender processes forming network. The purity of OECs reached 88% with the selective attachment method on day 6, and then fibroblast proliferated quickly and reduced the purity. When combined with the starvation method, the purity of OECs was 91% on day 6 and 86% on day 9, however, OECs were in a poor state. While combined with the NT3 method, the purity reached 95% on day 9 and 83% on day 12, respectively. The cells still remained in a good state. Conclusion： A combination of selective attachment and intermittent NT3 nutrition is an effective method to obtain OECs with higher purity and quality.     

嗅粘膜源性嗅鞘细胞移植联合NGF对脊髓损伤的修复

目的：探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）移植联合神经生长因子(nerve growth factor, NGF)修复脊髓急性损伤的可行性和疗效,并观察二者的协同作用。方法：自成年Wistar大鼠嗅粘膜取材,采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制纯化相结合的方法培养纯化嗅鞘细胞。建立大鼠脊髓半切模型,并随机分成对照组（A组）,OECs组（B组）和OECs＋NGF组（C组）,在不同时段进行肢体活动的BBB评分。8周后取脊髓标本进行组织学检查,评价对脊髓损伤的修复作用。结果：B组和C组2周后BBB评分高于A组（P＜0.05）,C组自4周后明显优于A组和B组（P＜0.01）。组织学检查表明,C组可明显促进轴突再生。结论:OECs联合NGF具有良好的脊髓损伤修复作用,且二者具有明显的协同作用。     

Compatibility of olfactory ensheathing cells with functionalized self-assembling peptide scaffold in vitro

Background Olfactory ensheathing cell （OEC） transplantation is a promising or potential therapy for spinal cord injury （SCI）. However, the effects of injecting OECs directly into SCI site have been limited and unsatisfied due to the complexity of SCI. To improve the outcome, proper biomaterials are thought to be helpful since these materials would allow the cells to grow three-dimensionally and guide cell miqration.     

功能化自组装多肽水凝胶与嗅鞘细胞生物相容性研究

Olfactory ensheathing cell (OEC) transplantation is a promising or potential therapy for spinal cord injury (SCI). However, the effects of injecting OECs directly into SCI site have been limited and unsatisfied due to the complexity of SCI. To improve the outcome, proper biomaterials are thought to be helpful since these materials would allow the cells to grow three-dimensionally and guide cell migration. In this study, we made a new peptide hydrogel scaffold which named GRGDSPmx by mixing the pure RADA16 and designer-peptide RADA16-GRGDSP solution, and we examined the molecular integration of the mixed nanofiber scaffolds using Atomic force microscopy (AFM). In addition, we have studied the behavior of OECs in GRGDSPmx condition as well as on RADA16 scaffold by analyzing their phenotypes such as cell proliferation, apoptosis, survival and morphology. The experimental results showed that GRGDSPmx could be self-assembled to form a hydrogel. Inverted optical microscope and Scanning electron microscope (SEM) analysis showed that OECs are viable and they proliferate within the nanostructured environment of the scaffold. MTT assay demonstrated that OECs proliferation rate was increased on GRGDSPmx scaffold compared to the pure RADA16 scaffold. In addition, OECs on GRGDSPmx scaffolds also showed less apoptosis and maintained the original spindle-shape morphology. Calcein-AM/PI fluorescence staining revealed that OECs cultured on GRGDSPmx grew well and the viable cell count was 95%. These results suggested that this new hydrogel scaffold provided an ideal substrate for OEC 3D culture and suggested its further application for SCI repair.     

嗅内衬细胞的培养

目的 :探索一种简单的培养纯化嗅内衬细胞的方法。方法 :取新生 2 0 d的大鼠嗅球表层 ,以阿糖胞苷和牛垂体提取液分别作用 ,应用差速贴壁分选方法纯化培养细胞 ,以P75NGFR抗体鉴定。结果 :取得了较高纯度的嗅内衬细胞。结论 :应用阿糖胞苷和牛垂体提取液 ,联合差速贴壁分选法是有效可行的获取高纯度嗅内衬细胞的方法。