大剂量Bcl-2反义硫代磷酸寡核苷酸对细胞系的毒性作用

目的 探讨大剂量Ｂｃｌ－２反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ＰＳ－ＯＤＮ,ＡＳＰＯ）对ＨＬ６０细胞系的毒性作用,同时了解毒性与剂量的关系。方法 应用四氮唑蓝比色法、台盼蓝拒染试验,ＣＦＵ－ＨＬ６０克隆培养法观察大剂量Ｂｃｌ－２ ＡＳＰＯ对ＨＬ６０细胞的毒性作用,同时应用免疫细胞化学染色及流式细胞仪检测Ｐ２６ Ｂｃｌ－２蛋白表达,吖啶橙染色及ＤＮＡ片段电泳对细胞凋亡的观察。并以其正义ＰＳＯＤＮ（ＳＰＯ     

Bcl-2反义硫代寡核苷酸规模化化学合成

目的 建立规模化合成Bcl-2反义硫代寡核苷酸合成工艺。方法 合成采用亚磷酰胺法，泵驱动，流过式反应；紫外分光光度计测其D260nm值；通过DNAPacPA-100分析柱对合成粗产品进行分析。结果 合成周期5h左右，平均合成效率98．4％，总产率76．2％，186μmol合成柱获得粗产品0．75g，色谱柱分析显示各组分都获得分离，最强峰保留时间32．247min，相对峰面积57．68％。结论 本所研究开发规模化合成工艺可获得高产率的反义寡核苷酸，为反义药物开发奠定基础。     

Bcl-2反义寡核苷酸对肾癌细胞株的生长抑制作用

目的：研究bcl-2反义寡核苷酸对肾细胞癌细胞的生长抑制作用及剂量一效应关系。方法：设计、合成与已知人类基因无同源性的bcl-2反义寡核苷酸(AS1翻译起始端，AS2编码区)，以阳离子脂质体Lipofectin转染不同的肾癌细胞株，MTS比色实验测定细胞活率。结果：单纯Lipofectin、反义寡核苷酸及正义寡核苷酸处理，对肾癌细胞ACHN生长无抑制作用，而转染入细胞内的反义寡核苷酸可抑制多种肾癌细胞的生长(ACHN、RCW和OSRC-2)，且抑制作用与剂量呈正相关。结论：bcl-2反义寡核苷酸可剂量依赖性抑制多种肾癌细胞的生长。     

反义寡核苷酸治疗白血病的研究现状

反义核酸技术是近十年来肿瘤治疗研究的热点,它包括反义寡核苷酸(又称反义DNA,Antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)、反义RNA、核酶及RNA干扰等技术.其中反义寡核苷酸技术的主要作用原理是根据碱基互补配对原则,利用合成的寡核苷酸选择性地与靶基因mRNA互补结合,干扰或阻止其基因产物的形成,从而达到治疗肿瘤的目的.     

rhTNF—a联合bcl—2反义寡核苷酸对急性髓细胞白血病细胞株HL—60增殖与凋亡的作用

目的 探讨基因重组人类肿瘤坏死因子a（rhTNF-a）和bcl－2反义寡核苷酸（ASPO）对HL－60细胞增殖与凋亡的作用，进一步认识肿瘤坏死因子a（rhTNF-a）和bcl－2两者调控肿瘤细胞凋亡的作用及相互联系。方法 单独和联合应用rhTNF-a和bcl－2ASPO处理HL－60细胞，通过MTT法检测HL－60细胞生长和存活特性变化；原位细胞凋亡检测和流式细胞技术检测细胞凋亡；应用RT－PCR、免疫组织化学检测癌基因bcl－2表达的改变。结果 rhTNF-a和bcl－2ASPO的联合应用明显增强对HL－60细胞的增殖抑制；细胞凋亡率明显升高；癌基因bcl－2在mRNA和蛋白表达明显下降。结论 TNF和bcl－2ASPO在诱导HL－60细胞凋亡中可能存在协同作用，为血液肿瘤的联合治疗提供了新的途径。     

急性白血病c—myc反义核酸基因治疗的实验研究

ｃ－ｍｙｃ基因是调控细胞增殖与分化的癌基因,在急性白血病细胞株及急性白血病、恶性淋巴瘤患者细胞中出现高表达,是影响这些恶性肿瘤发生、发展的重要基因之一。反义核酸治疗恶性肿瘤在技术上具有高效、简便、不需载体等特点,原理是根据碱基互补,将具有特异序列的反义寡核苷酸导入肿瘤细胞与靶基因上的相应部位结合,抑制和阻断相应基因的转录表达。　目的　应用针对ｃ－ｍｙｃ基因的两个反义核酸１５ｍ ｅｒ和１８ｍ ｅｒ作用于急性白血病细胞株和原代细胞,研究反义核酸对白血病细胞的生长、增殖,ｃ－ｍｙｃ ｍ ＲＮＡ 表达以及Ｐ６５ ｃ－ｍｙｃ蛋白表达率的改变,以及对细胞凋亡、分化方面的影响。　方法　采用锥虫蓝染色法测定细胞的拒染率,绘制细胞的生长曲线,用０．８％ 甲基纤维素半固体培养法进行克隆形成试验;用流式细胞仪检测在反义核酸作用前后的Ｐ６５ ｃ－ｍｙｃ 蛋白及凋亡率;用ＲＴ－ＰＣＲ 法检测ｃ－ｍｙｃｍ ＲＮＡ 的表达相对水平;电镜观察凋亡细胞的超微结构;ＤＮＡ 电泳分析凋亡片段;光镜下瑞特染色、ＮＢＴ染色观察细胞分化水平,流式细胞仪检测分化抗原表达,同时ＲＴ－ＰＣＲ检测分化细胞的ｍ ＲＮＡ 表达;ＭＴＴ 法检测反义核酸与化疗药物对细胞联合作用后对     

bcr3/abl2和c-myb基因反义寡核苷酸联用对慢性髓细胞白血病的作用

探讨多癌基因反义寡核苷酸对慢性髓细胞白血病的作用及其相互作用的影响。方法用台盼蓝拒染,集落形成,逆转录－多聚酶链反应及流式细胞仪技术研究反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞株和ＣＭＬ骨细胞的作用。结果ｃ－ｍｙｂ反义寡核苷酸通过促进ＣＭＬ,细胞凋亡,发挥对ｂｃｒ／ａｂｌ反义寡核苷酸的协同作用。结论多癌基因反义核酸的联合应用可为ＣＭＬ基因治疗提供一项新手段。     

c—myc反义寡核苷酸对白血病细胞凋亡的影响

目的 研究c-myc反义寡核苷酸对白血病细胞凋亡的影响。方法 用针对c-myc mRNA 5'端非翻译区的一个18bp的反义寡核苷酸与HL60细胞、分离的急性粒细胞白血病病人白细胞共培养10h,用凋亡细胞计数、DNA凝胶电泳、ELISA、流式细胞仪等方法测白血病细胞的调亡。结果 c-myc反义寡核苷酸能够诱导HL60细胞凋亡,且此作用随着作用浓度的提高而增加;此反义核酸只诱导白血病患者的白血病细胞凋亡,对正常白细胞的凋亡无影响。结论 c-myc反义核酸可以通过诱导白血病细胞凋亡来治疗急性粒细胞白血症,且该作用的特异性好。     

反义bcl-2基因抗白血病作用的研究

目的 研究反义bcl-2基因抗白血病作用及其特点,探讨反义基因或联合药物体外净化和治疗白血病可行性。方法 （1）RT－PCR和蛋白印迹方法检测HL－60、U937、K562、CEM白血病细胞株以及常见白血病类型的bcl-2 mRNA和P26蛋白表达情况。（2）选择高表达bcl-2基因的HL－60细胞株作为靶细胞,用人工合成bcl-2正反义硫代寡聚脱氧核苷酸（PS－ODN）体外培养处理。检测bcl-2 mRNA和P26蛋白的变化;DNA梯形分析细胞凋亡,锥虫蓝拒染法和克隆培养观察细胞生长;同时将HL－60细胞与PS－ODN培养孵育7天后的活细胞腹腔接种Scid鼠,半巢式RT－PCR和病理分析该HL－60细胞在体内生物学行为改变。（3）建立三种白血病细胞株CEM、K562、HL－60 Scid鼠白血病模型和有效监测与追踪白血病细胞株的方法,掌握体内白血病细胞株生物学行为;用bcl-2正反义PS－ODN腹腔给药治疗HL－60 Scid鼠白血病模型,观察治疗后体内白血病进展变化。（4）用RT－PCR方法克隆bcl-2基因和构建其两种不同的反义RNA逆转录病毒表达载体。（5）转染高表达bcl-2的HL－60细胞,比较两种反义RNA在对抗bcl-2的作用与降低内源性bcl-2蛋白水平上的异同性。观察两种反义RNA介导的靶基因抑制对烷化溶血磷脂（ALP）和四种化疗药物诱导的HL－60细胞凋亡的影响。（6）RT－PCR检测基因转染HL－60在化疗药物作用下FGFβ1表达。结果 （1）白血病细胞株表达bcl-2有差异,bcl-2 mRNA和它的P26蛋白不平行。（2）三种白血病细胞株HL－60,K562,CEM可在Scid鼠增殖,产生典型白血病浸润模型特征,白血病增殖和浸润程度与白血病细胞生物特性有关,其顺序为CEM＞K562＞HL－60。（3）人工合成的bcl-2反义硫化寡脱氧核苷酸（ASPO）能够下调HL－60细胞bcl-2表达,诱导凋亡,抑制增殖和克隆形成;同时使其失去在体内的致白血病能力。（4）bcl-2反义硫代寡脱氧核苷酸,腹腔给药能够抑制肿块增长,白血病扩张,延长Scid鼠生存期,呈剂量依赖性。（5）部分编码区的反义RNA能够降低HL－60细胞内源性Bcl-2蛋白水平,提高ALP和四种化疗药物对HL－60杀伤率,促进它们诱导的HL－60细胞凋亡。（6）反义基因转染的HL－60细胞在化疗药物作用下负调控因子TGFβ1基因表达增加。结论 bcl-2反义基因可有效对抗bcl-2原癌基因表达,发挥明显的抗白血病作用,为体外净化白血病细胞和体内治疗白血病提供依据。     

hTR反义寡核苷酸对急性白血病原代细胞端粒酶活性及凋亡的影响

目的　探讨端粒酶RNA(hTR)反义寡核苷酸 (ASODN)对急性白血病 (AL)原代细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响。方法　应用与人hTR起始密码子互补的硫代ASODN处理AL原代细胞 ,用台盼蓝拒染的方法计数活细胞 ,用端粒酶重复扩增分析 (TRAP) -PCR -ELISA检测法观察端粒酶活性的变化 ,用Giemsa染色、Hoechst332 5 8 PI双染荧光显微镜检查及流式细胞仪检测凋亡细胞的发生。结果　经hTR -ASODN作用后 ,AL原代细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,并与ASODN的浓度和处理时间相关 ,10 μmol/LASODN在作用 72h时端粒酶活性为( 0 0 95± 0 0 6 ) ,较细胞对照组 ( 1 15 4± 0 15 )下调明显 (P <0 0 1) ;在作用第 5天经荧光显微镜可观察到ASODN组细胞凋亡形态学变化。流式细胞仪检测到其凋亡率为 ( 31 72± 8 6 4 ) ,与细胞对照组的凋亡率 ( 6 33± 0 91)比较 ,差异有显著性 (P <0 0 1)。结论　hTR -ASODN可明显抑制AL原代细胞端粒酶活性并诱导其凋亡 ,hTR可能成为白血病基因治疗新靶点     

慢性粒细胞白血病反义核酸基因治疗的实验研究

目的单独应用ｂｃｒ－ａｂｌ反义硫代磷酸寡聚脱氧核糖核酸（ＡＳＰＯ）或ｃ－ｍｙｂＡＳＰＯ作用于慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）细胞的研究已有报道，但抑制的不彻底性是个主要问题。由于ＣＭＬ的发生是多癌基因协同作用及相互影响的结果，为进一步提高ＡＳ－ＰＯ对ＣＭＬ细胞的作用效果，用互补于两种类型（ｂ２ａ２及ｂ３ａ２）的ｂｃｒ－ａｂｌ基因融合位点两侧各１３个核苷酸的ＡＳＰＯ（ｂ２ＡＳＰＯ和ｂ３ＡＳＰＯ）及ｃ－ｍｙｂ基因起始密码子２－７互补的ＡＳＰＯ（ｍＡＳＰＯ）联合作用于Ｋ５６２细胞株和原代ＣＭＬ细胞。方法硫代磷酸寡核基酸（ＰＳ－ＯＤＮ）的合成由３９２－０５型ＤＮＡ－ＲＮＡ合成仪自动合成，经ＯＰＣ柱纯化；细胞与ＰＳ－ＯＤＮ共培养后２４，４８，９６，１２０ｈ倒置显微镜下活体观察，０．４％台盼蓝拒染法进行死活细胞计数；ＣＦＵ－Ｋ５６２、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－ＧＥＭＭ采用０．８％甲基纤维素半固体培养法；采用两对引物ＲＴ－ＰＣＲ半定量法检测细胞ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ表达；通过流式细胞仪检测及电镜观察细胞凋亡情况。结果（１）ＡＳＰＯ能够特异性抑制ｂｃｒ－ａｂｌ基因表达；经ＲＴ－ＰＣＲ的检测发现１０μｍｏｌＡＳＰＯ作用４８ｈ，两种反义     

急性白血病Bcl-2, P-糖蛋白的表达及意义

0 引言 多药耐药基因(MDR1)及其编码产物P-糖蛋白(P-gp)是产生MDR主要机制，其过度表达与急性白血病(AL)预后密切相关[1]．抗凋亡基因bcl-2的高表达与mdr1基因一样可导致白血病细胞MDR[2,3]．     

脂质体介导Bcl-2反义脱氧寡核苷酸对人卵巢癌细胞作用的研究

目的 探讨bcl-2反义脱氧寡核苷酸体外转染卵巢癌细胞后,对癌细胞bcl-2基因表达调控作用、诱导其凋亡的作用以及对顺铂敏感性的影响.方法 体外培养顺铂耐药的人卵巢上皮性癌细胞系CAOV3,以阳离子脂质体为载体,将bcl-2反义脱氧寡核苷酸片断作用于CAOV3细胞.应用逆转录聚合酶链反应(BT-PCR)技术检测bcl-2基因的表达;流式细胞仪(FACS)检测转染后CAOV3细胞调亡的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色试验检测转染后CAOV3细胞对顺铂敏感性的影响.结果 脂质体介导的bcl-2反义脱氧寡核苷酸作用于CAOV3细胞后,bcl-2基因mRNA 表达水平显著低于对照组(P<0.01),并可诱导卵巢癌细胞凋亡,增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性.结论 脂质体介导的bcl-2反义脱氧寡核苷酸作用于CAOV3细胞,可下调bcl-2基因的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡,并增强CAOV3细胞对顺铂的敏感性.     

急性白血病患者骨髓细胞中Cox-2和Bcl-2的表达

目的:探讨急性白血病患者骨髓细胞中Cox-2和Bcl-2的表达及意义.方法:应用免疫组织化学SP法检测45例初治急性白血病患者、24例完全缓解急性白血病患者及20例正常对照骨髓细胞中Cox-2、Bcl-2的表达.结果:初治组Cox-2和Bcl-2的表达率和阳性积分均高于完全缓解组和对照组(P均＜0.05),完全缓解组与对照组之间差异均无统计学意义(P＞0.05).骨髓细胞中Cox-2与Bcl-2的表达呈正相关(r=0.957,P＜0.05).结论:Cox-2和Bcl-2在急性白血病骨髓细胞的异常高表达可能与白血病发生发展有关.     

脂质体包裹DNMT1反义寡核苷酸诱导白血病细胞株孕酮受体去甲基化的实验研究

目的研究脂质体包裹DNA甲基转移酶(DNMT1)反义寡核苷酸转染对白血病细胞株孕酮受体(Progesterone Receptor，PR)启动子甲基化及表达的影响，探讨甲基化基因治疗的新途径。方法人工合成的DNMT1反义寡核苷酸MG88用脂质体包裹后转染白血病细胞株，用RT-PCR检测DNMT1、PRBmRNA表达的变化以及用MSP分析PRA、PRB甲基化状态的改变。结果用MG88转染白血病细胞株后，DNMT1 mRNA显著下降；PRA、PRB启动子出现脱甲基化，PRB mRNA表达显著上升。结论DNMT1反义寡核苷酸MC88可以诱导白血病细胞PR脱甲基化，使PRB mRNA表达升高，为DNA甲基化基因治疗的实验性研究提供了可能。     

Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用

[目的]研究Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用。[方法]NCI-H446肺癌细胞株分5组:空白对照、单纯照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组。相应组照射10GY后24、48、72小时,MTT法检测各组的细胞增殖抑制率和联合相互作用。[结果]照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组均有细胞抑制,并呈时间依赖关系。其中Bcl-2反义寡核苷酸联合照射组抑制率明显高于其它三组(P<0.01),联合作用指数(CDI)=0.86。[结论]Bcl-2反义寡核苷酸促进了照射对NCI-H446肺癌细胞的增殖抑制作用,两者有协同作用。     

急性白血病P-gp和Bcl-2表达与临床意义

目的　探讨P gp和Bcl 2两种蛋白在急性白血病 (AL)临床耐药中的作用及相互作用。 方法　用流式细胞仪检测 97例AL骨髓细胞P gp和Bcl 2蛋白的表达率。 结果　急性髓细胞性白血病 (AML)难治与复发组P gp阳性率明显高于初治组。急性淋巴细胞性白血病 (ALL)初治组和难治与复发组Bcl 2阳性率有显著性差异。P gp和Bcl 2在M4 、M5表达率较高 ,而M3 表达率较低。P gp+ 组缓解率明显低于P gp-组缓解率 ;Bcl 2 + 组缓解率与Bcl 2 -组缓解率无显著差异 (P >0 .0 5 )。P gp+ 组和Bcl 2 + 组早期复发率明显高于P gp-组和Bcl 2 -组早期复发率。P gp+ /Bcl 2 + 组缓解率明显低于P gp-/Bcl 2 -组缓解率 ;P gp+ /Bcl 2 + 组早期复发率明显高于P gp-/Bcl 2 -组早期复发率。P gp和Bcl 2表达无相关性。 结论　P gp和Bcl 2高表达均预示AL预后不良。联合检测P gp和Bcl 2对评价AL预后具有较大的临床意义。     

反义寡核苷酸对HL60细胞c-myc基因表达的抑制和诱导分化作用

目的研究ｃｍｙｃ反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞中ｃｍｙｃ基因的表达及ＨＬ６０细胞分化的影响。方法采用针对原癌基因ｃｍｙｃ的ｍＲＮＡ５’非翻译区的一个１８ｂｐ的反义寡核苷酸５’ｄ（ＣＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧ）３’与人早幼粒白血病细胞系ＨＬ６０细胞共培养５ｄ，检测ｃｍｙｃｍＲＮＡ量的变化及其对ＨＬ６０细胞分化的影响。结果用ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测出ＨＬ６０细胞ｃｍｙｃｍＲＮＡ的含量减少；细胞形态学变化以及非特异性酯酶（ＮＳＥ）染色、硝基四氮唑蓝（ＮＢＴ）还原试验均提示ＨＬ６０细胞出现了分化，部分细胞向粒细胞方向分化，部分细胞向单核细胞方向分化。结论ｃｍｙｃ反义寡核苷酸能够抑制ｃｍｙｃ基因的表达并能诱导ＨＬ６０细胞分化。