霍乱弧菌环介导等温扩增LAMP技术检测

目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)进行霍乱弧菌的快速检测.方法 针对霍乱弧菌的管家基因(mdh)设计4条特异性引物(2条内引物和2条外引物),建立快速检测食品中霍乱弧菌的环介导等温扩增方法;应用该方法对17种细菌共42株菌进行LAMP扩增,并进行确证,全面评估该方法的灵敏度、特异性、准确性等.结果 该方法检测21株霍乱弧菌均得到阳性扩增结果,其余21株非霍乱弧菌均未扩增出条带,扩增反应最佳反应时间为60min,反应温度为65℃.霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为40 fg和50 cfu/mL.对模拟食品样品进行直接检测,检测限为70 cfu/g.结论 该方法具有特异性强、灵敏度高,操作简便快速、不需要复杂仪器设备,适用于食品的快速检测.     

环介导等温扩增快速检测人类嗜T淋巴细胞病毒I型方法建立

[目的]建立环介导等温扩增(LAMP)快速检测人类嗜T淋巴细胞病毒I型方法. [方法]将HTLV-I的PX基因转染pUC57构建HTLV-I检测参考菌株,针对PX基因设计LAMP和PCR引物,用正交实验设计优化反应体系,并考察方法的特异性和灵敏度. [结果]25μl LAMP最佳反应体系为:外引物02 μmol/L、内引物1.8 μmol/L、dNTP 2 000 μmol/L、Mg2+4 mmol/L、甜菜碱0.4 mol/L、BstDNA聚合酶8 U;最佳反应条件为64℃恒温反应60min.[结论]LAMP方法具有灵敏、特异、操作简便、成本低廉的特点,可为HTLV-I的快速检测提供新手段.     

小肠结肠炎耶尔森菌环介导管温扩增技术检测方法的建立

目的将一种新颖的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(LAMP)应用于小肠结肠炎耶尔森菌的快速检测。方法针对小肠结肠炎耶尔森氏菌毒素基因yruI/yru R设计5条特异性引物,进行LAMP扩增,对扩增反应进行优化。并考核方法的敏感性和特异性。结果最佳反应时间为60min,反应温度为60℃。对8种相关肠道细菌进行LAMP扩增,仅小肠结肠炎耶尔森菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性。小肠结肠炎耶尔森菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为74fg和43cfu/ml。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为76cfu/g。结论本方法检测小肠结肠炎耶尔森菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低,1.5h即可完成,有望发展成为快速检测小肠结肠炎耶尔森菌的有效手段。     

阪崎肠杆菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 针对当前国内外传统检测方法缺点,建立阪崎肠杆菌快速检测法.方法 根据阪崎肠杆菌外膜蛋白(OmpA)基因,设计4条特异性引物(内、外引物各2条),建立并优化环介导等温扩增(100p-mediattA isothermalamplification,LAMP)检测体系及反应条件,并进行LAMP反应的灵敏度、特异性实验及实际样品检测.结果 LAMP检测阪崎肠杆菌,优化后的条件选择为:Mg2+浓度6 mmoVL,dNTP浓度0.6 mmoVL,甜菜碱浓度0.8 moVL,外引物与内引物的浓度比1:4,扩增温度580C 60min;细菌纯培养检测灵敏度为101cfu/mL;对11种细菌共26株菌进行LAMP扩增,仅8株阪崎肠杆菌得到阳性扩增结果,证明引物具有很高的特异性;对实际样品进行增菌检测,采用试剂盒提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时26 h;并采用传统检测方法验证,正确性为100%.结论 该方法检测阪岐肠杆菌特异性强、灵敏度高,并且操作简便、检测成本低、耗时短,有望成为快速检测阪岐肠杆菌的有效方法.     

利用环介导等温核酸扩增技术(LAMP)快速检测霍乱弧菌

目的:建立基于环介导等温核酸扩增技术(LAMP)的霍乱弧菌快速检测方法,为霍乱疫情监测与预防提供及时的应急检测服务和参考结果。方法:通过Genbank检索、下载霍乱弧菌ctxA基因序列,使用BLAST、GENtle、DNAMan等相关核酸序列分析软件比对分析确定目标序列,使用PrimerExplorer v4软件设计霍乱弧菌LAMP引物。以SYBR Green I作为荧光剂在荧光定量PCR仪上实时检测LAMP反应结果,作为本研究的主要研究方式。通过优化反应温度、时间、组成浓度等实验条件对LAMP检测方法进行改进,并与PCR方法进行比较与评价。结果:从分属不同种属的20株实验菌株中分别正确地检出所有5株产霍乱毒素的霍乱弧菌菌株,对菌株纯培养物的检出限达到了5 cfu/μl(10 cfu/reaction)。结论:本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法是一种灵敏、特异、快速、简便的霍乱弧菌检测方法,适于基层单位推广使用,对霍乱疾病监测与暴发后疫情应急检测具有重要意义。     

基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病毒58型基因检测

目的 建立基于实时荧光环介导等温扩增的人乳头瘤病58型基因检测体系，用于其快速检测和早期诊断。 方法 运用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer V5, 针对人乳头瘤病毒58型的L1区域保守基因设计引物，在反应前加入荧光核酸染料SYBR Green Ⅰ，并对该反应体系中的dNTPs、Mg2+和内引物（FIP、BIP）浓度进行优化,优化结果通过“S”型扩增曲线判断，并对优化后的实时荧光环介导等温扩增体系进行特异性、灵敏度检测及临床标本检测。 结果 针对人乳头瘤病毒58型所建立的实时荧光环介导等温扩增检测体系具有良好的特异性及灵敏度，且与临床实验室检测结果（qPCR方法）的符合率达100%，该检测方法的灵敏度可达10拷贝/μL。 结论 本研究建立了人乳头瘤病毒58型的实时荧光环介导等温扩增检测体系，它是一种耗时少、操作简便、特异性强、灵敏度高的方法，适用于HPV临床样本的快速检测。     

LAMP法和PCR法快速检测阪崎肠杆菌的比较

[目的]建立阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测技术,并与PCR检测方法进行比较,为阪岐肠杆菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]根据阪崎肠杆菌外膜蛋白OmpA基因,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术体系,并对2种方法检测的灵敏度、特异性和实际样品的检测结果进行比较。[结果]建立了优化的LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限为101cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对36株近源菌进行特异性检测,结果显示,LAMP仅8株阪崎肠杆菌得到阳性结果,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP特异性比PCR高。应用于46份奶粉样品的检测,LAMP和PCR均有清晰、特异的预期条带和结果产生,并与常规检测结果一致。[结论]LAMP检测技术作为一种快速检测阪崎肠杆菌的方法具有简便、灵敏快速,与PCR方法比较,特异性强、操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速检测阪岐肠杆菌的有效手段。     

志贺菌环介导等温扩增检测方法建立

目的 建立志贺菌环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法.方法 针对志贺菌侵袭性质粒抗原H基因(ipaH)特征性保守序列设计1套4条引物,应用LAMP技术对21株志贺菌和非志贺菌进行特异性检测以确定其特异性;使用LAMP和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对ipaH基因重组质粒倍比稀释液进行检测以确定其灵敏度;使用重组质粒计算其初始拷贝数与反应时间之间的线性关系以评估定量检测的可能性.结果 荧光定量LAMP扩增曲线图显示,LAMP技术可以在1 h内获得结果;有较好的特异性,与其他17种食源性致病菌无交叉反应;LAMP检测技术的灵敏度高出经典PCR技术10倍以上,检测限达到200拷贝/μL;平均变异系数＜5%;反应时间与模板初始浓度有良好的线性关系(R2=0.985 5).结论 志贺菌环介导等温扩增检测体系是一种快速、灵敏、特异的核酸筛查方法,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段.     

嗜肺军团菌核酸等温扩增快速检测技术研究

目的建立一种嗜肺军团菌的核酸等温扩增试纸条及pH显色快速检测方法,从而实现对空调冷却水样中嗜肺军团菌的快速现场检测。方法基于嗜肺军团菌特异性mip基因设计引物,建立环介导等温扩增体系,并结合反应产物横向流动试纸条和pH显色检测技术,进而验证方法的灵敏性、特异性,并对浙江省不同地区的中央空调冷却水水样进行检测。结果环介导的等温扩增试纸条及pH显色检测方法灵敏度可高达3 cfu/μl,特异性好,且检测时间仅需40 min左右。检测的灵敏度与荧光定量PCR的方法基本一致,对外环境空调冷却水的检测阳性率与荧光定量也相符。结论建立的嗜肺军团菌试纸条与pH显色快速检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。     

环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌方法的建立与应用

目的建立适合基层实验室快速检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。方法根据副溶血性弧菌gyrB基因设计4条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果建立的LAMP体系具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,副溶血性弧菌为阳性,其他菌株均为阴性。该方法对培养的副溶血性弧菌的检测下限为25cfu/mL,可在60min内完成扩增反应。用该体系对120份海产品进行检测,阳性率62.5%,与传统方法一致。结论 LAMP法与传统方法相比,可节省大量时间,且对实验仪器要求低,具有良好的实用性。     

环介导等温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

目的基于环介导等温核酸扩增法(LAMP)建立副溶血性弧菌tlh基因的快速检测方法。方法以副溶血性弧菌tlh基因为扩增的靶序列分别设计外引物、内引物和环引物各1对,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域在恒温条件下扩增靶序列,快速检测副溶血性弧菌。并对该法进行灵敏度、特异度试验,将该方法与荧光定量PCR法检出率进行统计学比较。结果 LAMP法最低检出限为10 fg/μl,灵敏度是荧光定量PCR的10倍;特异度实验中除检出2株副溶血性弧菌外,6株非副溶血性弧菌均未检出;LAMP法与荧光定量PCR法检出率差异无统计学意义(P0.05)。结论 LAMP法具有高特异性、高效性、快速简便易检测等特点,适合现场快速检测,在食物中毒暴发处置中有深远的经济价值。     

结核分枝杆菌LAMP检测方法的建立及应用

目的建立一种基于环介导等温扩增(LAMP)的结核分枝杆菌核酸快速检测方法,并应用于出入境人群的肺结核样本检测。方法针对结核分枝杆菌插入序列6110(IS6110)设计5组LAMP引物,利用LAMP实时浊度仪筛选出1组最佳引物,用20株临床致病菌株进行特异性检测,用10倍梯度稀释法进行灵敏度测定,用25份痰培养阳性样本对阳性率进行评估。结果筛选出1组最佳引物TB159,该引物特异性良好,与20株常见致病菌株无交叉反应。此方法的最低检测限为24.77 pg/μl,对25份痰培养阳性样本检测的阳性率为100%。结论建立了一种特异性好、灵敏度高的LAMP快速检测方法,可以应用于结核病检测。     

环介导等温扩增技术检测调味粉中罂粟可待因

目的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP),建立调味粉中罂粟可待因的检测方法。方法根据可待因特异性基因序列设计引物,通过对12种罂粟种子、11种香辛料叶或种子、1种虞美人种子的DNA样品进行特异性实验、最佳温度筛选实验、敏感性实验,并以此确立LAMP反应体系,对市售8种调味粉进行检测。结果 12种罂粟和虞美人的DNA样品发生了特异性反应,最佳反应温度为66℃,LAMP检测最低浓度达9 pg/μL,敏感性是PCR检测(0.9 ng/μL)的100倍。市售8种调味粉中,有1种含有可待因成分。结论LAMP检测法灵敏度高、特异性强、操作方便、快速,适用于调味粉中罂粟可待因的检测。     

嗜肺军团菌的环介导等温扩增检测技术研究

目的建立一种简便、快速和高灵敏度的嗜肺军团菌的检测方法。方法利用环介导等温扩增(1oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,根据嗜肺军团菌mip基因的特征性保守序列,设计LAMP检测引物,建立LAMP检测方法,用常规PCR检测平台和其他21种致病菌评估该方法的特异性、灵敏度、重复性及实用性,同时以荧光法建立反应阈值与模板初始浓度之间的线性标准曲线。结果建立的LAMP方法检出限为1.0×102copies/μl,与其他致病菌无交叉反应,反应阈值与初始模板浓度有良好的线性关系(R2=0.9843),LAMP检测结果与传统分离培养方法具有良好的吻合性。结论环介导等温扩增技术检测嗜肺军团菌简便、快速、敏感度高,具有广阔的应用前景。     

LAMP微流控芯片快速检测三种食源性致病菌

建立一种结合环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和微流控芯片技术检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌三种食源性致病菌的方法,实现对3种致病菌的快速检测。通过比对选取3种致病菌特异性基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(hlyA)基因、大肠杆菌O157脂多糖编码(rfbE)基因、金黄色葡萄球菌耐药基因FemA基因作为目的基因,设计LAMP引物,通过实时LAMP筛选合格引物。设计微流控芯片,将引物冻干后固化到芯片上,制成LAMP微流控芯片。选择合适的LAMP反应体系,添加显色剂,加入芯片中,反应结果通过肉眼或仪器判读。使用标准菌株检验芯片的特异性与敏感性,并使用人工污染样品进一步检验其在实际样品检测时的敏感性。结果表明:制成的LAMP微流控芯片具有较好的特异性,3种致病菌的检测敏感性均可达到100 cfu/ml,可用于食源性致病菌的现场快速检测。     

汉滩型汉坦病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法建立

目的建立一种针对汉滩型汉坦病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测技术,以实现汉坦病毒的快速、高效检测。方法针对汉坦病毒汉滩型S片段的保守区,设计合成4条特异性引物,建立汉滩型汉坦病毒LAMP检测方法。结果该方法能够有效检测汉坦病毒标准质粒,并且该套引物具有良好的特异性,检测灵敏度达到10个基因拷贝,应用建立的LAMP检测方法能够有效检测血液样本中的汉滩型汉坦病毒。结论建立的LAMP方法具有高度灵敏性及特异性,是一种高效快速的检测汉滩型汉坦病毒的基因检测方法 。     

可视化金黄色葡萄球菌LAMP检测方法的建立及应用

目的建立一种基于颜色判断结果的金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)快速、敏感和特异的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法并应用于食源性疾病样品的金葡菌筛查。方法针对金葡菌耐热核酸酶(thermostable nuclease,nuc)基因特异性序列的6个区域设计2对引物,建立LAMP方法。利用LAMP和普通PCR方法同时检测金葡菌和对照组菌株来验证LAMP方法的特异性;将金葡菌菌液作10倍系列稀释后利用LAMP和PCR方法同时进行检测来评价两者的敏感度,利用LAMP和PCR方法分别对330份食源性疾病样品进行检测来比较两者的检出率。结果 LAMP方法可以利用肉眼进行结果判断,其特异性与普通PCR相当,但其敏感性比普通PCR高10倍,LAMP方法检测下限为10 cfu/ml,PCR方法检测下限为100 cfu/ml;LAMP和普通PCR方法对食源性疾病样品的检出率相符。结论可视化金葡菌LAMP方法是一个快速、敏感和特异的方法,可应用于食源性疾病样品中金葡菌的筛查。     

嗜肺军团菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用

目的建立一种灵敏、快速、安全、方便适合口岸现场应用的嗜肺军团菌检测方法。方法分析嗜肺军团菌基因组序列,选择特异性基因片段设计引物,建立环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LMAP)方法,并优化反应条件。结果建立的方法特异性好,灵敏度可达103cfu/ml,检测能力与荧光定量PCR法相当。结论应用环介导恒温扩增技术建立的嗜肺军团菌检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测。     

水产品中致病性弧菌PCR快速检测研究

〔目的〕建立一种快速、准确、特异的方法,快速检测和鉴定出食品中的非致病性和致病性霍乱弧菌与副溶血性弧菌。〔方法〕针对霍乱弧菌的种特异性基因ompW、毒力基因tcpA、ctxA和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh设计引物,建立PCR检测体系。〔结果〕检测结果显示,该方法能够特异性检出副溶血性弧菌或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdht、cpA或ctxA毒力基因,检测的灵敏度可达到5×101cfu/ml菌浓度。〔结论〕与传统方法比较,该方法快速、特异、灵敏,能在较短时间内对大量水产品样品进行检测。     

环介导等温扩增法检测空肠弯曲菌

目的 空肠弯曲菌是重要的食源性疾病病例标本的病原菌检测项目,用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的方法,对食源性致病菌空肠弯曲菌进行快速检测。方法 以空肠弯曲菌 mapA 基因序列为检测靶基因,建立了空肠弯曲菌的LAMP 快速检测方法。空肠弯曲菌的LAMP反应由DNA扩增试剂盒提供的反应体系加入引物和模板进行。做了空肠弯曲菌DNA模板灵敏度的检测、菌液灵敏度的检测和特异性检测。结果 我们方法对空肠弯曲菌DNA 的检测灵敏度为84.5fg/反应管;对空肠弯曲菌菌液检测灵敏度为0.8 CFU/反应管;特异性100%。结论 对食源性疾病腹泻样本的空肠弯曲菌检测项目,可以采用mapA-LAMP方法进行等温扩增初筛,初筛阳性的样品再有针对性地进行后续的传统培养。