Sublytic C5b⁃9刺激上调KLF4促进肾小球系膜细胞生成IL⁃23的作用

目的：研究转录因子KLF4调控sublytic C5b?9刺激肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）诱导促炎因子白介素?23（IL?23）生成的作用。方法：构建KLF4的短发夹状小干扰RNA（shKLF4）及过表达质粒（pIRES2?KLF4）。将pIRES2?KLF4或shKLF4 转染GMC后再行sublytic C5b?9刺激,用qPCR、Western blot和ELISA法检查沉默或过表达KLF4基因后对GMC产生IL?23的影响。此外,构建IL?23基因近端启动子全长质粒,行荧光素酶报告基因实验测定沉默或过表达KLF4基因后对IL?23启动子活性的影响。结果：①Sublytic C5b?9刺激GMC后能明显促进IL?23的生成,而沉默KLF4基因后,由sublytic C5b?9诱导GMC产生的IL?23明显减少,但过表达KLF4后IL?23的水平则显著增加。②Sublytic C5b?9刺激GMC能显著上调IL?23的启动子活性,而沉默KLF4基因后由sublytic C5b?9诱导的IL?23启动子活性明显降低,但过表达KLF4后又能显著升高IL?23的启动子活性。结论：Sublytic C5b?9刺激诱导IL?23的生成可通过其刺激上调转录因子KLF4的表达而实现。     

KLF4调控sublytic C5b-9诱导肾小球系膜细胞IL-23基因启动与表达的作用

目的： 研究转录因子KLF4调控sublytic C5b-9刺激肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)诱导促炎因子IL-23生成的作用。 方法：构建KLF4的短发夹状小干扰RNA(shKLF4)及过表达(pIRES2-KLF4)质粒。将pIRES2-KLF4转染GMC或将shKLF4 转染GMC后再行sublytic C5b-9刺激,用qPCR、Western blot(WB)和ELISA法检查沉默或过表达KLF4基因后对GMC产生IL-23的影响。此外,构建IL-23基因近端启动子全长质粒,行荧光素酶报告基因实验测定沉默或过表达KLF4基因后对IL-23启动子活性的影响。结果：(1)Sublytic C5b-9刺激GMC后能明显提高IL-23的生成,而沉默KLF4基因后,由sublytic C5b-9诱导GMC产生的IL-23明显减少,但过表达KLF4后IL-23的水平则显著增加。(2)Sublytic C5b-9刺激GMC能显著上调IL-23的启动子活性,而沉默KLF4基因后由sublytic C5b-9诱导的IL-23启动子活性明显降低,但过表达KLF4后又能显著升高IL-23的启动子活性。结论：转录因子KLF4确能调控sublytic C5b-9刺激 GMC 诱导IL-23的基因启动与表达。     

GCN5调控sublytic C5b⁃9诱导大鼠肾小球系膜细胞表达Cyclin D1及致SOX9的乙酰化修饰

目的：探讨GCN5调控sublytic C5b?9刺激大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）诱导Cyclin D1基因表达以及GCN5乙酰化修饰SOX9转录因子的作用。方法：先用Western blot检测Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠的肾组织和sublytic C5b?9 刺激的GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1的表达。然后分别将pIRES2?GCN5过表达和shGCN5小干扰质粒或将这些质粒与Cyclin D1启动子质粒行不同组合转染GMC,用荧光素酶报告基因实验和real?time PCR、Western blot检测过表达或沉默GCN5后对Cyclin D1表达的影响。同时用免疫共沉淀（Co?IP）和Western blot检测sublytic C5b?9刺激或分别转染GCN5过表达和酶活性突变质粒（ΔGCN5）的GMC中SOX9的乙酰化修饰。结果：Thy?1N大鼠肾组织和sublytic C5b?9刺激的GMC中GCN5、SOX9、Cyclin D1蛋白水平均明显上调,而过表达GCN5基因能上调Cyclin D1的启动子活性、mRNA和蛋白表达;敲低GCN5表达则得到了相反的结果。此外,sublytic C5b?9刺激和过表达GCN5基因促进了SOX9的乙酰化修饰,而沉默GCN5后则降低了SOX9的乙酰化水平。结论：GCN5可上调GMC中Cyclin D1的表达,并促进SOX9的乙酰化修饰。     

沉默大鼠KAT7 基因对亚溶解型 C5b⁃9 刺激 GMC 诱导趋化因子 MCP⁃1 生成的影响

目的：研究沉默大鼠赖氨酸乙酰基转移酶7（lysine acetyltransferase 7,KAT7）基因对亚溶解型（sublytic）C5b?9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞（glomerular messangial cell,GMC）诱导单核趋化蛋白?1（monocyte chemotactic protein?l,MCP?1）生成的影响。方法：针对KAT7 基因不同位点,用DNA 重组技术设计4 个小发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）,分别克隆到真核表达载体pGCsi?U6/Neo/GFP/shRNA中。之后,用NeonTM电转仪将上述质粒转染至体外培养的GMC中,再给予sublytic C5b?9 刺激。行Western blot实验检查筛选出针对KAT7基因且有最佳沉默效率的shRNA。此外,用real?time PCR和ELISA法分别检测GMC行不同分组处理后MCP?1的mRNA和蛋白水平。结果：核酸测序表明,重组的shKAT7质粒构建成功。Western blot显示,shKAT7?2 是具备最佳沉默效率的shRNA。用shKAT7 转染GMC后,由sublytic C5b?9 刺激GMC诱导的 MCP?1 基因表达水平显著下降。结论：成功构建了大鼠KAT7 shRNA真核表达质粒,并初步证实KAT7基因的表达能够促进sublytic C5b?9刺激大鼠GMC诱导趋化因子MCP?1的合成与分泌。     

SP1基因在sublytic C5b⁃9促大鼠肾小球系膜细胞增殖中的作用

目的：检查特异性蛋白1（specificity protein 1,SP1）在Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠肾组织中和亚溶解型C5b?9（sublytic C5b?9）刺激的大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells,GMCs）中的表达情况,并探讨SP1表达上调对sublytic C5b?9促大鼠GMCs增殖的作用。方法：复制大鼠Thy?1N模型,同时用sublytic C5b?9刺激体外培养的大鼠GMCs,分别用real?time PCR和Western blot检查Thy?1N大鼠肾组织（体内）和sublytic C5b?9刺激的大鼠GMCs（体外）中SP1基因的mRNA和蛋白表达水平及其表达时相。与此同时,构建SP1基因的表达质粒（pEGFP?N1/SP1?His）和发夹状小干扰RNA质粒（SP1 shRNA,shSP1）。将上述质粒分别转染大鼠GMCs（同时设对照质粒转染组）,再给予或不给予sublytic C5b?9刺激。用real?time PCR和Western blot检查SP1表达量,并行CCK?8实验检查GMCs的增殖情况。结果：在Thy?1N大鼠肾组织和sublytic C5b?9刺激的大鼠GMCs中,SP1 mRNA和蛋白表达水平均显著上调,且其体内外表达时相较为一致。体外过表达SP1可显著促进GMCs增殖,而沉默SP1可明显抑制sublytic C5b?9诱导的GMCs增殖反应。结论：Sublytic C5b?9刺激大鼠GMCs后能通过上调SP1表达促进GMCs增殖。     

NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

青藤碱对PKC⁃α/NF⁃κB⁃p65通路的抑制作用及机制

目的：探讨过表达蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）对HEK?293T细胞中核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）磷酸化水平的影响,并检查青藤碱（sinomenine,SIN）对PKC?α/NF?κB?p65信号通路的抑制作用。方法：采用PCR技术扩增大鼠PKC?α基因蛋白质编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到pIRES2?EGFP空载质粒中,构建野生型（wide type,WT）PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?WT,PKC?αWT）;在PKC?αWT质粒的基础上,将PKC?α第25位丙氨酸（A）与368位赖氨酸（K）分别突变为谷氨酸（E）和精氨酸（R）,即构建持续活化（constitutively active,CA）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?A25E,PKC?αCA）和显性负性（dominant negative,DN）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?K368R,PKC?αDN）。本课题组前期构建的大鼠野生型NF?κB?p65过表达质粒（pIRES2?NF?κB?p65,p65WT）分别与上述各PKC?α过表达质粒共同转染HEK?293T细胞,免疫印迹法检测PKC?α、NF?κB?p65的表达及磷酸化水平。再将上述不同质粒转染HEK?293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2 h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC?α、NF?κB?p65磷酸化的影响。结果：菌液PCR及测序证实,上述PKC?α过表达质粒构建成功。在HEK?293T中过表达PKC?αWT或PKC?αCA可促进NF?κB?p65的磷酸化,且过表达PKC?αCA时尤为显著,而过表达PKC?αDN后NF?κB?p65的磷酸化无明显变化。SIN处理可抑制PKC?αWT、PKC?αCA和PKC?αDN转染组HEK?293T细胞中PKC?α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC?αWT上调的NF?κB?p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC?αCA和PKC?αDN对NF?κB?p65的磷酸化作用。结论：过表达PKC?α可促进HEK?293T细胞中NF?κB?p65的磷酸化,SIN处理HEK?293T细胞后可通过抑制PKC?α的磷酸化下调NF?κB?p65的磷酸化修饰。     

沉默GCN5或SOX9基因对Thy⁃1肾炎大鼠肾组织中TGF⁃β1生成的影响

目的：研究沉默大鼠肾组织中通用控制核苷酸合成5（general control nonderepressible 5,GCN5）基因、性别决定区Y框蛋白9（SRY related HMG box?9,SOX9）基因对Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠肾组织内转化生长因子?β1（transforming growth factor?β1,TGF?β1）生成的影响。方法：分别用慢病毒（lentivirus,LV）包装GCN5和SOX9发夹状小干扰RNA（shRNA）,即制备LV?shGCN5和LV?shSOX9重组病毒。然后行大鼠肾动脉灌注术将LV?shGCN5和LV?shSOX9分别导入大鼠肾脏,再经尾静脉注射兔抗大鼠胸腺细胞抗血清（anti?thymocyte serum,ATS）复制Thy?1N模型。在注射ATS后3 h,取大鼠肾组织,用RT?PCR和Western blot检查各组大鼠肾组织中GCN5和SOX9的mRNA及蛋白表达水平,以验证干扰效果及GCN5、SOX9对TGF?β1产生的影响。结果：利用肾动脉灌注术将LV?shGCN5或LV?shSOX9重组病毒导入大鼠肾组织后,不仅能有效沉默相应的靶基因,而且还能下调TGF?β1的表达。结论：沉默大鼠肾组织中GCN5或SOX9基因后能显著抑制Thy?1N大鼠肾内TGF?β1的生成。     

Sublytic C5b-9诱导肾小球系膜细胞产生的TSP-1和TGF-β1对其合成FN和collagen Ⅳ的影响

目的:探讨亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)后,诱生的血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)与转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对其促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM),如纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和 Ⅳ 型胶原蛋白(collagen Ⅳ)合成的影响?方法:体外培养大鼠GMC,进行不同分组处理并给予sublytic C5b-9刺激,然后分别检查受刺激的GMC合成TSP-1和TGF-β1因子水平,同时检测GMC分泌FN和collagen Ⅳ的水平?此外,应用人工合成的TSP-1封闭肽段(GGWSHW)和TGF-β1中和抗体处理培养的大鼠GMC,研究TSP-1和TGF-β1在sublytic C5b-9诱导的GMC分泌上述ECM中的作用及其相互关系?结果:培养的大鼠GMC在sublytic C5b-9刺激后18 h,其FN和collagen Ⅳ表达水平均明显升高?同时,TSP-1蛋白表达和TGF-β1分泌(包括活化的TGF-β1含量)也显著增多?用TSP-1封闭肽段(GGWSHW)处理大鼠GMC后亦能显著抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1活化,并减少FN?collagen Ⅳ的产生?同样用TGF-β1中和抗体处理GMC后也能明显抑制由sublytic C5b-9导致的FN?collagen Ⅳ的分泌?结论:体外用sublytic C5b-9刺激大鼠GMC,能诱导其ECM分泌与TSP-1和TGF-β1的合成及活化,而sublytic C5b-9促进GMC分泌ECM的机制可能与其诱导TSP-1合成及活化的TGF-β1存在一定的关系?     

大鼠Thy-1肾炎增殖病变及sublytic C5b-9致其肾小球系膜细胞增生的实验研究

目的:检查大鼠Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)的增生病变及亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物在GMC增殖中的作用?方法:复制大鼠Thy-1N模型,分别于注射Thy-1抗体后18 h?3 d和7 d时,取肾组织,用real-time PCR和Western blot方法检查其肾组织中细胞增殖指标,即细胞周期蛋白D2(cyclin D2)和增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen,PCNA)的mRNA丰度及蛋白表达水平?用免疫荧光观察肾小球中C5b-9复合物的沉积?同时,使用BrdU掺入法?光镜及电镜观察大鼠肾小球细胞的增殖情况?此外,体外培养大鼠GMC,进行不同分组处理后再给予sublytic C5b-9刺激,用3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入法(3H-thymidine incorporation,3H-TdR)检查GMC的增殖情况?结果:大鼠Thy-1N病变18 h,肾组织中cyclin D2?PCNA表达和肾内BrdU阳性细胞数均开始升高,实验3 d和7 d,其表达进一步提高?同时肾小球内可见C5b-9复合物沉积,部分C5b-9包绕的肾细胞形态完好?另形态学观察还发现,实验18 h,部分GMC溶解坏死,而实验3 d,GMC数量明显增多,7 d增加更为显著?体外实验中,大鼠GMC在sublytic C5b-9刺激后18 h,其细胞增殖水平显著增高,而用sublytic C5b-9刺激GMC产生的培养上清处理正常的GMC后,亦能轻度刺激GMC增殖?结论:大鼠Thy-1N肾小球病变存在早期增殖和继发增生的病理改变,而GMC的早期增殖可能与sublytic C5b-9作用有关?     

转录因子KLF5在恶性肿瘤发生中作用的研究进展

Krüppel样因子5(KLF5)是一种能与DNA结合的锌指转录调节因子,其在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和肺癌等多种恶性肿瘤中的作用具有环境依赖性。微RNA和长链非编码RNA可以调控KLF5的表达。同时KLF5也可以调控众多的下游靶基因的表达。本文主要介绍了KLF5在恶性肿瘤中的作用,也分析了在不同的细胞状态下通过调节KLF5蛋白的水平而影响下游基因表达的机制差异。深入研究这些差异性或能进一步揭示KLF5在肿瘤发生发展中的作用规律。     

基因芯片筛查亚溶解型C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞基因表达差异的研究

目的:应用高通量的基因芯片技术筛查亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9)介导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells, GMCs)的基因表达谱的变化?方法:体外分离?培养大鼠GMCs,人工质控sublytic C5b-9复合物的形成,并用其刺激培养GMCs,然后分别提取sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min?3 h及未刺激对照组细胞的总RNA?经逆转录合成生物素标记的cDNA探针,然后与基因芯片杂交(涵盖31 000个转录本,代表28 000个基因)?经Affymetrix Scanner 3000 扫描芯片荧光信号图像?GCOS1.4读取数据后将差异表达基因注释于GO基因功能分类体系,分析其相应的功能?结果:芯片检查数据显示,sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min 时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为4 124个和2 234个,刺激3 h时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为4 512个和2 859个;而sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min和3 h后同时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为2 325个和1 419个?sublytic C5b-9刺激GMCs表达差异基因其功能主要涉及生物学过程调节?生物调节?定位相关?刺激应答?生长发育?增殖?代谢过程?细胞生理过程?多细胞机体过程等?结论:Sublytic C5b-9 刺激GMCs确能引起基因表达谱的变化?     

HEK293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修饰位点的鉴定

目的：研究人胚肾 293T(HEK 293T,简称 293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel-like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式和修饰的位点。方法：将构建的Flag-TRAF6、HA-KLF5、泛素过表达质粒、shTRAF6小干扰质粒和TRAF6 C70A位点突变质粒行不同组合转染293T细胞48 h。用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和免疫印迹(immunoblotting,IB)实验检查TRAF6与 KLF5 的结合以及 KLF5 K63 或 K48 多聚泛素化水平。此外,构建 KLF5 全部赖氨酸突变的质粒,分别与 TRAF6 质粒共转染 293T 细胞。用前述 IP/IB 检测 KLF5 K63 连接的多聚泛素化修饰,并确定 KLF5 K63 泛素化修饰的位点。结果：293T 细胞中 TRAF6能与KLF5结合;TRAF6过表达和基因沉默或TRA6酶活性缺失能相应上调或下调KLF5 K63的多聚泛素化;KLF5 被 TRAF6 K63多聚泛素化修饰的位点是其第99位和第100位的赖氨酸。结论：TRAF6能与KLF5相互作用,并对KLF5-K99和 K100进行K63多聚泛素化修饰。     

IL⁃36γ在哮喘患者血清及支气管上皮细胞中的表达及意义

目的：研究白细胞介素（interleukin，IL）?36γ在支气管哮喘患者血清中的水平及在支气管上皮细胞中的表达，探讨其在哮喘病情评估中的潜在临床价值。方法：收集24例哮喘患者及24例同期健康志愿者的临床资料及血清标本，采用酶联免疫吸附实验检测血清IL?36γ表达水平，分析其与肺功能、病情控制水平以及血清IL?13的相关性。采用实时定量PCR法检测人支气管上皮细胞16HBE IL?36γ的mRNA表达以及相关炎症因子对该过程的影响。结果：哮喘组血清IL?36γ表达水平高于健康对照组［（175.90 ± 25.70）pg/mL vs.（100.40 ± 8.49）pg/mL，P=0.008］，其表达与肺功能FEV1/FVC（r=-0.347，P=0.016）、FEV1%pred（r=-0.454，P=0.001）均呈负相关，与血清IL?13水平（r=0.611，P=0.003）呈正相关。根据哮喘患者的病情控制水平进行分级，血清IL?36γ主要在未控制组高表达，明显高于部分控制组（P < 0.05）、完全控制组（P < 0.05）及健康对照组（P < 0.001）。外源重组蛋白IL?13刺激16HBE促进IL?36γ mRNA呈浓度和时间依赖性表达。结论：哮喘患者血清IL?36γ表达增高，其表达上调可能和IL?13有关，该蛋白可能是哮喘评估和病情监测的潜在生物学标志物。     

pCAG⁃3×flag⁃PP2A Cα转基因小鼠构建及高表达系的筛选

目的：构建过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα转基因小鼠,筛选高表达稳定遗传系,建立PP2A Cα基因相关功能研究模型动物。方法：将Flag蛋白标签序列与鼠源PP2A Cα cDNA 转录本设计成融合基因,插入CAG启动子下游,构建过表达载体pCAG?3×flag?PP2A Cα。通过原核显微注射技术,将线性化pCAG?3×flag?PP2A Cα质粒注射入受精卵雄原核,构建pCAG?3×flag?PP2A Cα过表达模型小鼠,PCR筛选阳性过表达小鼠。提取阳性过表达小鼠组织总蛋白,在蛋白质水平分析转基因小鼠3×flag?PP2A Cα的表达。结果：PCR 鉴定及测序结果证实,pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因载体及过表达pCAG?3×flag?PP2A Cα 转基因小鼠模型构建成功。Western blot筛选转基因高表达系小鼠。结论：筛选得到pCAG?3×flag?PP2A Cα高表达稳定遗传系小鼠。     

沉默TSP-1基因对亚溶解型C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:研究沉默血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)基因对于亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)增殖的影响.方法:设计合成针对TSP-1基因的发夹式siRNA(small hair RNA,shRNA...     

KLF9基因腺病毒载体的构建及其脂肪酸氧化功能

目的:构建Krüppel样转录因子9（KLF9）过表达的腺病毒，初步探讨KLF9在肝脏脂肪酸氧化中的功能。方法:根据分子克隆的原理，构建融合表达3×Flag的KLF9过表达的腺病毒，并在293A细胞中验证KLF9腺病毒感染效率。将融合表达3×Flag的KLF9过表达的腺病毒分别感染肝原代细胞、正常饮食小鼠以及高脂小鼠，通过Q-PCR检测过氧化物酶体增殖物活化受体-γ协同刺激因子PGC 1-α等脂肪酸氧化相关基因的表达情况。结果:Q-PCR以及 Western blot 结果证明融合表达3×Flag的KLF9过表达腺病毒载体包装成功，通过荧光显微镜观察到感染效率达90%以上。经Q-PCR检测，感染Ad-KLF9的肝原代细胞和肝脏组织中，PGC1-α等脂肪酸氧化相关基因表达明显高于对照组。结论:初步认定KLF9可促进脂肪酸氧化，改善高脂诱导的非酒精性脂肪肝。     

IL⁃17诱导的p300调控NSCLC细胞迁移、侵袭和MMP2表达的作用

目的：探讨IL?17刺激非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer,NSCLC）细胞上调腺病毒E1A相关300 kDa蛋白（adenoviral E1A binding protein of 300 kDa,p300）调控其细胞迁移、侵袭及生成基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2,MMP2）的作用。方法：用IL?17刺激 NSCLC细胞（H1299）后行划痕和Transwell实验观察细胞迁移和侵袭的变化。然后用Western blot检查p300和MMP2蛋白的表达。同时,将p300过表达质粒（pcDNA3.1/p300）或shp300干扰质粒分别转染H1299细胞（后者再行IL?17刺激）,用前述方法测定细胞迁移、侵袭和MMP2的表达。结果：用IL?17刺激H1299细胞后能显著诱导其迁移和侵袭,并上调p300和MMP2的表达。过表达p300可增强细胞的迁移与侵袭,并提高MMP2的生成,但沉默p300基因后由IL?17诱导的细胞迁移和侵袭能力及MMP2的表达均显著降低。结论：IL?17上调的p300能促进H1299细胞的迁移与侵袭以及MMP2基因的表达。     

KLF5 在脱氧胆酸诱导胃黏膜 肠上皮化生中的作用

目的 探究Krüppel 样因子5（KLF5）是否参与脱氧胆酸（DCA）诱导的胃黏膜肠上皮化生及 其可能的作用机制。方法 收集正常胃黏膜和肠上皮化生组织,用不同浓度DCA（100、200 和500μmol/L） 处理胃黏膜上皮GES-1 细胞,Western blot 和实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测KLF5 和Wnt3a 的表达。将GES-1 细胞分为空白对照组、DCA 组、阴性对照组及KLF5 沉默组,分别用MTT 法检测细胞增 殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot 和qRT-PCR 检测TFF2、VIL1 和CDX2 的表达。用氯 化锂LiCl（Wnt 通路激活剂）处理si-KLF5 转染的细胞,检测各组细胞中Wnt3a、β-catenin 和CDX2 的表达。 结果 与正常胃黏膜相比,肠上皮化生组织中KLF5 和Wnt3a 的表达上升。随着DCA 浓度增加,GES-1 细 胞中KLF5 和Wnt3a 的表达逐渐升高。500μmol/L DCA 处理GES-1 细胞后,细胞的增殖能力提高,凋亡率 降低,TFF2、VIL1 和CDX2 的表达升高,而si-KLF5 转染使细胞增殖能力降低,凋亡率升高,TFF2、VIL1 和 CDX2 的表达降低,抑制DCA 对GES-1 细胞的作用。另外,LiCl 能减弱DCA 处理后si-KLF5 转染对细胞中 Wnt3a、β-catenin 和CDX2 表达的影响。结论 KLF5 可能通过激活Wnt 通路,促进DCA 诱导的胃黏膜肠 上皮化生。