人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒pcDNA3—hEGF的构建

目的：构建人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因真核表达质粒，为深入研究ｈＥＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增；提纯及纯化ｐＵＣ１８－ｈＥＧＦ质粒；经ＤＮＡ序列分析其所含ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ；限制性酶切ｈＥＧＦ ｃＤＮＡ片段，连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内，克隆出真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈ     

表达hEGF导入基因的角朊细胞促进体外培养的正常角朊细胞增殖

目的 观察含外源性人表皮细胞生长因子（ｈＥＧＦ）基因改造的角朊细胞（ｈＥＧＦ－ＭＨＫ），对正常培养的角朊细胞（ＮＨＫ）增殖的影响；探讨转ｈＦＧＦ对创面愈合的生物学效应及作用机理。方法 收集含真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈＥＧＦ的Ｈｅｇｆ－ＭＨＫ细胞培养上清，采用放射免疫分析法检测收集的上清液中ｈＥＧＦ含量；以１０％的浓度加入由正常人皮肤组织分离培养的ＮＨＫ细胞培养基内；ＭＴＴ法测定ＮＨＫ细胞增减１５     

rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

c-fos和c-myc 原癌基因与bFGF在烧伤后早期创面组织中的表达规律

目的：探讨烧伤后创面组织原癌基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ ｍｙｃ 和碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ） 的表达顺序及分布规律。方法：采用深Ⅱ度烫伤模型,将４２ 只大鼠分为７ 组,即正常对照组、烫伤后３ ｈ、６ ｈ、１ ｄ、３ ｄ、７ ｄ 和１４ ｄ 组。用ＳＰ免疫组化方法研究烫伤后不同时间点内源性ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ ｍｙｃ 和ｂＦＧＦ蛋白的表达规律及分布特征。结果：烧伤可以诱导ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ ｍｙｃ 和ｂＦＧＦ表达,但三者的表达模式不尽相同,正常皮肤即有ｃ－ｆｏｓ 表达,伤后３ ｈ 达峰值,以后逐渐下降,１ 天以后降至最低水平,其阳性颗粒主要分布于表皮基底细胞胞浆及真皮成纤维细胞的胞核内。ｃ－ ｍｙｃ 的表达在伤后３ 天达最高值,阳性信号分布于真皮层成纤维细胞的胞浆中;而ｂＦＧＦ则在伤后６ ｈ 开始出现,伤后第１ 天达最高值,主要分布于真皮层的成纤维细胞的胞浆中。结论：烧伤可以诱导皮肤创面组织原癌基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ ｍｙｃ 及ｂＦＧＦ的表达,其表达具有时相与部位分布特征。三者表达的时相性提示在烧伤后早期原癌基因与生长因子基因之间具有相互调控作用,而这种调控作用对后期组织修复将产生一定的影响。     

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究通过反转录ＰＣＲ得到人ＧＭ-ＣＳＦ基因片段后，通过重组插入ｐＢＶ２２０载体质粒的ＥｃｏＲⅠ、ＢａｍＨⅠ之间，构建了重组表达质粒ｐｈＧＭ９１。借助计算机分析，优化了构建质粒的转译起始区，采取定点诱变以消除ＳＤ序列和ＡＴＧ区的强二级结构，提高了表达水平。将ＧＭ-ＣＳＦ基因进行序列测定，与文献报导完全一致，所对应的氨基酸序列与天然氨基酸序列一致。将带有表达质粒ｐｈＧＭ９１的ＤＨ５α菌在４２℃诱导，表达了预期的１５ＫＤ的蛋白，约占菌体总蛋白的２０％，并探讨了不同菌株对表达水平的影响。用ＭＴＴ法测定所表达的ＧＭ-ＣＳＦ生物活性，比活性可达到１×１０~７ＩＵ／ｍｇ，表明所表达的ＧＭ-ＣＳＦ具有生物学作用。     

小鼠神经生长因子cDNA的克隆及核苷酸序列分析

用Ｔ４－ＤＮＡ连接酶在限制性内切酶ＳｍａＩ存在下，将神经生长因子ｃＤＮＡ片断克隆到具有双向转录启动子的载体质粒ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）中。Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定其核苷酸顺序表明，所克隆的ＮＧＦｃＤＮＡ片断，长３６３ｂｐ，包含了成熟神经生长因子的全部编码。该重组质粒可分别用于制备ＮＧＦｃＤＮＡ探针和ＲＮＡ探针，是研究ＮＧＦ基因结构及表达调控等方面的重要工具。     

hG－CSF cDNA重组逆转录病毒的构建

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ重组入逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ中。重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清液能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆。该克隆细胞染色体中成功地整合了ｈＧ－ＣＳＦｃＤＮＡ，并且表达了有生物学活性的ｈＧ－ＣＳＦ产物。     

人转化生长因子β1基因在pET表达系统中的表达

目的：研究人转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）成熟肽基因在大肠杆菌中的表达。方法：利用ｐＥＴ－３ｂ载体，分别从宿主、培养基、诱导时间及转录终止子的距离等方面对ＴＧＦβ１的表达进行了优化。结果：ＴＧＦβ１在大肠杆菌中获得一定程度的表达，并存在于包涵体中。结论：利用ｐＥＴ表达系统，可使ＴＧＦβ１基因在大肠杆菌胞内获得表达。     

hG—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建

通过ＤＮＡ重组技术，将不含非编码区的人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ重组入逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ中。重组质粒转染ＰＡ３１７细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞培养上清液能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，使之在筛选培养基中形成典型的Ｇ４１８抗性克隆。该克隆细胞染色体中成功地整合了ｈＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ，并且表达了有生物学活性的ｈＧ－ＣＳＦ产物。     

缺氧条件下血管活性因子对血管内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

文章探讨在缺氧条件下人脐静脉血管内皮细胞血管内皮生长因子 (ＶＥＧＦ)表达及缩血管活性物质内皮素、舒血管活性物质ＮＯ和ＮＯ抑制剂ＬＮＮＡ对ＶＥＧＦ基因表达的影响。采用体外培养人脐静脉血管内皮细胞、缺氧及血管活性物质处理、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、酶联免疫检测和计算机图像分析等方法观察ＶＥＧＦｍＲＮＡ和蛋白表达水平。结果发现 ,ＶＥＧＦ基因在正常情况下及缺氧 3ｈ检测不出 ,而缺氧 6ｈ可见有ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达。ＥＴ、ＮＯ、ＬＮＮＡ对血管内皮细胞处理后 ,检测到ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达 ,ＥＴ能促进ＶＥＧＦｍＲＮＡ的…     

利用杆状病毒早期启动子在昆虫细胞中持续表达人β－干扰素

在含苜蓿尺蠖核多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）早期基因启动子的载体ｐＡｃＩＥ１中，插入人β－干扰囊（ＨｕＩＦＮ－β）基因，构建成转移载休ｐＩＥ１－ＩＢ；ｐＩＥ１－ＩＢ与含新霉素抗性基因（ＮＥＯ￣ｒ）的质粒ｐＩＥＩ－ＮＥＯ共转染秋粘虫细胞（Ｓｆ９细胞），使ＨｕＩＦＮ－β基因和ＮＥＯ￣ｒ基因整合到细胞基因组上产生转化细胞，含Ｇ４１８的培基分离新霉素抗性克隆，并增殖传代；转化细胞株传至５０代以上，不同传代水平细胞ＤＮＡ的点杂交证实ＨｕＩＦＮ－β基因已整合在细胞ＤＮＡ分子上，同时检测出干扰素（ＩＦＮ）的持续稳定表达，活性为５００—４０００ＩＵ／１０￣６细胞。抗天然ＨｕＩＦＮ－β抗体能完全中和所表达ＩＦＮ的抗病毒活性。     

c—fos和c—myc原癌基因与bFGF在烧伤后早期创面组织中的表 …

目的：探讨烧伤后创面组织原癌基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｍｙｃ和碱性成纤维细胞生物因子（ｂＦＧＦ）的表达顺序及分布规律。方法：采用深Ⅱ度烫伤模型,将４２只大鼠分为７组,即正常对照组、烫伤后３ｈ、６ｈ、１ｄ、７ｄ和１４ｄ组。用ＳＰ免疫组化方法研究烫伤后不同时间点内源性ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｍｙｃ和ｂＦＧＦ蛋白的表达规律及分布特征。结果：烧伤可以诱导ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｍｙｃ和ｂＦＧＦ表达,但三者的表达模式不尽相同,正     

丙型肝炎病毒核心蛋白可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术,构建表达丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）的原核表达载体,并在大肠杆菌ＪＭ１０９中表达可溶性的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ。以重组的ＨＣＶ核心蛋白为包被抗原,利用噬菌体抗体库的表面展示技术,筛选到含有ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ基因的噬菌体克隆。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经ＮｃｏⅠ／Ｎｏｔ Ⅰ酶切鉴定,该ＳｃＦｖ基因由７５０ｂｐ组成。将其亚克隆到ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ表达载体中,转化大肠杆菌ＪＭ１０９,提取质粒进行ＤＮＡ序列测定,符合ＳｃＦｖ的重链可变区和轻链可变区基因结构特点。ＩＰＴＧ诱导转化的大肠杆菌ＪＭ１０９,在其培养上清中获得了可溶性ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ的表达。酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）证实表达的ＨＣＶ－ｃｏｒｅ－ＳｃＦｖ进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡ     

利用杆状病毒早期启动子在昆虫细胞中持续表达人β—干扰素

在含苜蓿尺蠖核多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）早期基因启动子的载体ｐＡｃＩＥ１中，插入人β－干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）基因，构建成转移载体ｐＩＥ１－ＩＢ；ｐＩＥ１－ＩＢ与含新霉素抗性基因（ＮＥＯ＾ｒ）的质粒ｐＩＥ１－ＮＥＯ共转染秋粘虫细胞（Ｓｆ９细胞），使ＨｕＩＦＮ－β基因和ＮＥＯ＾ｒ基因整合到细胞基因组上产生转化细胞，含Ｇ４１８的培基分离新霉素抗性克隆，并增殖传代；转化细胞株传至５０代以上，不同传代水平细     

表皮生长因子受体在外阴营养不良和外阴鳞癌中的表达及其临床意义

表皮生长因子受体 (ＥＧＦＲ)是细胞信号传导的一部分 ,其基因的拷贝数增加或过度表达 ,均能促进正常细胞的转化 ,ＥＧＦＲ与其相应配体表皮生长因子 (ＥＧＦ)或转化生长因子 (ＴＧＦａ)结合 ,可引起细胞增殖分化。学者们发现 :许多肿瘤组织和癌前病变组织中均有较高水平ＥＧＦＲ的表达〔1、2〕。作为对该基因的初步研究 ,本文应用链霉卵白素 过氧化物酶(Ｓ Ｐ)免疫组织化学技术观察该基因在妇女正常外阴皮肤、外阴营养不良、外阴鳞癌中的表达状况 ,探讨ＥＧＦＲ与外阴营养不良及外阴鳞癌发生的关系 ,为今后的深入研究及临床应用提供依据。1…     

逆转录病毒介导的基因转移方法的建立

将人促红细胞生成素（ｈＥＰＯ）、人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）、细胞程序死亡抑制基因（ＢＣＬ－２）重组逆转录病毒质粒ＤＮＡ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７后，经Ｇ４１８抗性筛选，其单克隆细胞株培养上清液均具有感染ＮＩＨ３Ｔ３及大鼠原代成纤维细胞、成肌细胞并形成Ｇ４１８抗性克隆的能力。其感染细胞的染色体ＤＮＡＰＣＲ鉴定结果均为阳性，表明其染色体中均成功地整合了目的基因；感染的靶细胞均能表达外源基因编码蛋白，表明已成功地建立了逆转录病毒介导的基因转移技术。     

FAS抗原胞外区片段GST融合蛋白的产生

目的：获得重组ＦＡＳ抗原，用于抗体制备及进一步的功能分析。方法：用ＰＣＲ技术从完整的ＦＡＳｃＤＮＡ克隆上扩增其编码胞外区的部分，将ＰＣＲ产物直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统，ＤＮＡ序列分析证实序列完全正确；用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ将ＦＡＳ胞外区片段切出，定向克隆到经同样酶切处理的ｐＧＥＸ－ＫＧ表达载体，转化大肠杆菌，经优化ＩＰＴＧ的诱导条件，获得了ＦＡＳ胞外区与谷胱甘肽－Ｓ－转移酶的融合蛋白高效表达；用亲合层析法从细菌粗提物中纯化了ＧＳＴ－ＦＡＳ融合蛋白，免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。结果：用重组ＦＡＳ为免疫原制备的抗体能诱导Ｕ９３７细胞产生细胞凋亡。结论：重组ＦＡＳ抗原和制备的抗体能用于对ＦＡＳ系统的功能研究     

皮肤基底细胞癌,鳞状细胞癌表皮生长因子及其受体免疫组化研究

应用免疫组化法观察了４３例基底细胞癌（ＢＣＣ）、２６例鳞状细胞癌（ＳＣＣ）表皮生长因子（ＥＧＦ）及其受体（ＥＧＦＲ）的表达。结果表明：ＥＧＦ及ＥＧＦＲ在所有ＢＣＣ中表达均有增强，且在边缘肿瘤组织表达强于中央肿瘤组织。ＳＣＣ组织中ＥＧＦ及ＥＧＦＲ表达强度与肿瘤分化程度呈负相关。提示ＥＧＦ和ＥＧＦＲ对ＢＣＣ及ＳＣＣ的发展可能起促进作用；ＳＣＣ组织中ＥＧＦ及ＥＧＦＲ表达有助于识别其生物学行为及估计预后。     

不同时间生理刺激对躯体感觉皮层转录因子表达的影响

近年来的药理学研究表明，毒蕈碱样激动剂刺激神经原突触后膜可在神经元样的ＰＣ１２细胞中诱导即刻早期基因（ＩＥＧ，ＩｍｍｅｄｉａｔｅＥａｒｌｙＧｅｎｅ）ｃ－ｆｏｓ［１］；癫痫作为强烈的刺激亦可在活体神经元中诱导出这些ＩＥＧ［２］；近来研究着重于生理刺激是否影响ＩＥＧ在大脑皮层的表达。阻断视觉传入活动导致Ｚｉｆ２６８（ＮＧＦＩ－Ａ）在枕叶皮质的表达下降［３］；刺激胡须产生躯体感觉皮层中一些ＩＥＧ的诱导，包括ＮＧＦＩ－Ａ，ＮＧＦＩ－Ｂ，ｆｏｓ－相关抗原［４］；同样的刺激也产生了这些转录因子的靶基因，如谷…     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

报道两种长度的ＨＣＶ核心基因片段在Ｅ．ｃｏｌｉ中的表达结果。从ＨＣＶ感染者的血清扩增出核心区基因，利用表达质粒ｐＱＥ－３０，构建了两组重组质粒，其插入片段分别为ＨＣＶ的全长核心区基因（ｃ５７３）和“截断型”基因（ｃ３７５）。经ＩＰＴＧ诱导，含两种质粒的菌株都表达了目的蛋白，ｃ５７３表达的蛋白子分量为２２ｋＤ，表达量占菌体蛋白的８．７％；ｃ３７５表达的蛋白分子量为１９ｋＤ，表达量占菌体蛋白的３９．９