大鼠自体嗅黏膜移植修复胸髓损伤:形态学和行为学的验证

目的:采用自体嗅黏膜作为组织供体修复脊髓损伤,从形态学和行为学角度验证嗅成鞘细胞移植治疗脊髓损伤的作用及效果,为应用自体嗅成鞘细胞移植治疗临床脊髓损伤提供实验依据。方法:实验于2002-06/2004-10在北京大学基础医学院解剖学与组织胚胎学系中枢神经发育与再生研究室完成。选取清洁级6周龄雄性SD大鼠18只,随机分为自体嗅黏膜移植组10只,冻融对照组8只。两组均建立脊髓损伤模型,自体嗅黏膜移植组取位于鼻中隔后上部的嗅黏膜移植于脊髓损伤处,冻融对照组将自体嗅黏膜冷冻于-20℃冰箱5min,取出后室温放置5min解冻,重复5次后将冻融自体嗅黏膜移植于脊髓损伤处。术后6周于脊髓损伤节段上下各5mm处取材,片厚20μm。然后两组分别以神经丝蛋白和神经生长因子受体蛋白免疫荧光双标染色、激光共聚焦显微镜检测移植效果。免疫组织化学染色观察移植嗅黏膜与周围组织的生长情况。通过BBB行为学评分对两组动物后肢恢复功能进行评估。结果:实验选取SD大鼠18只,全部进入结果分析。①免疫组织化学摄片观察移植细胞在脊髓组织中再生情况:自体嗅黏膜移植组有部分空洞形成,但有部分神经纤维穿过移植区,可见神经生长因子受体蛋白免疫反应阳性的嗅成鞘细胞呈束状排列。冻融对照组无再生纤维通过且形成较大空洞,神经生长因子受体蛋白p75免疫组化反应阴性。②两组大鼠的神经丝蛋白和神经生长因子受体蛋白免疫荧光双标染色结果:自体嗅黏膜移植组免疫荧光标记纤维中夹有神经生长因子受体蛋白p75标记的存活的嗅成鞘细胞,细胞随标记的神经丝蛋白纤维走行方向排列,与宿主组织愈合良好。冻融对照组未见神经生长因子受体蛋白p75标记的嗅成鞘细胞以及神经丝蛋白标记的再生纤维,且形成较大空洞。③两组大鼠手术前后行为学评分结果:与冻融对照组比较,术后2,3,4,5,6周自体嗅黏膜移植组BBB行为学评分显著升高[(3.8±0.7),(5.6±1.4);(4.1±0.6),(9.7±1.3);(4.6±1.7),(12.5±1.2);(5.8±0.9),(13.5±0.9);(6.3±0.9),(13.8±0.9)分;P<0.05或0.01]。结论:嗅黏膜移植以及其中的嗅成鞘细胞对大鼠脊髓损伤修复具有明显的促进作用,并可恢复损伤神经的部分功能。同时自体嗅黏膜移植还有助于脊髓损伤部位神经纤维的再生。     

移植神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅鞘细胞对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的：探讨大鼠脊髓损伤后神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅神经鞘细胞移植对脊髓损伤后细胞凋亡及促进神经功能恢复的作用。方法：实验于2003—09／2004—04在广东医学院实验动物中心完成，SD大鼠48只，雌雄不限，体质量240～260g。随机分为3组：基因修饰组，嗅鞘细胞移植组，脊髓损伤组，每组16只。均首先行大鼠脊髓损伤造模。基因修饰组和嗅鞘细胞移植组分别移植神经生长因子、脑衍生神经生长因子修饰的嗅鞘细胞和单纯嗅鞘细胞，脊髓损伤组不做治疗。移植后12周，采用免疫组织化学法和原位末端标记法对损伤区的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测，主要观察bcl-2(细胞凋亡抑制基因)，bax和fas(细胞凋亡诱导基因)阳性表达的情况评估经基因修饰和未经基因修饰的单纯嗅鞘细胞对脊髓神经凋亡的抑制及诱导作用。结果：48只大鼠均进入结果分析。①原位末端标记法检测结果：基因修饰组细胞凋亡数低于嗅鞘细胞移植组，脊髓损伤组最高。②免疫组织化学结果：Bcl-2蛋白表达的顺序为基因修饰组&;gt;嗅鞘细胞移植组&;gt;脊髓损伤组(20．79&;#177;6．40，13．54&;#177;3．66，9．34&;#177;2．12，P&;lt;0．05）；Fas，Bax蛋白表达的顺序均为脊髓损伤组&;gt;嗅鞘细胞移植组&;gt;基因修饰组【(24．98&;#177;4．32，40．48&;#177;2．05)，(18．92&;#177;4．74，25．54&;#177;3．82)，(11．78&;#177;3．81，16．87&;#177;3．30)，(P&;lt;0．05)】。结论：单纯移植嗅鞘细胞其存活时间与分泌有限。神经生长因子和脑衍生神经生长因子是神经营养因子的主要成员，用神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰嗅鞘细胞后可提高嗅鞘细胞的生存时间和提高分泌神经营养因子功能，移植后具有抑神经细胞凋亡的作用。     

嗅鞘细胞移植后脊髓损伤区髓磷脂相关糖蛋白表达的动态变化

目的：观察嗅鞘细胞移植对脊髓损伤区轴突生长抑制因子髓磷脂相关糖蛋白的影响。 方法：实验于2005-08／2006—02在西安交通大学教育部环境与疾病相关基因研究重点实验室完成。①选取成年SD大鼠40只，随机数字表法分为正常组、模型组、DF12对照组、嗅鞘细胞组，10只／组，②除正常组外，其余各组均建立脊髓全横断损伤模型．术后嗅鞘细胞组在距损伤缘上下各1mm处注射原代培养12d的成年大鼠嗅鞘细胞悬液．浓度掘整为1&;#215;10^11 L^-1，深度均为1．0mm，每处各注射细胞悬液1μL，DF12对照组注射DF12培养液，方法与剂量同上：模型组、正常组均不进行任何移植处理。③分别于移植后1，4，8周采用组织学、行为学方法和免疫印迹技术检测各组动物脊髓损伤区髓磷脂相关糖蛋白表达的变化。 结果：实验选取40只SD大鼠均进入结果分析①组织学检查嗜银染色结果：移植8周后除正常组外，其余各组均可见明显的神经纤维再生。但模型组、DF12对照组大部分纤维排列紊乱如乱发状．明显迂曲；而嗅鞘细胞组新生轴突明显，无论数墙还是质量都优于模型组及DF12对照组。②移植后不同时间点各组下肢运动功能检测BBB评分结果的比较：移植1．4，8周，嗅鞘细胞组BBB评分均明显高于模型组、DF12对照组，且移植4，8周时差异有显著性意义[（5．25&;#177;1．28），（1．62&;#177;1．50），（2．25&;#177;1．03）分：（11．5&;#177;2．20），（4．37&;#177;1．84），（3．75&;#177;1．03）分；F=18．090～47．635，P均〈0．01]。③髓磷脂相关糖蛋白western blot检测结果：模型组、DF12对照组、嗅鞘细胞组脊髓损伤后髓磷脂相关糖蛋白的表达明显增强，均明显高于正常组（P〈0．05）；但嗅鞘细胞组明显低于模型组、DF12对照组（P〈0．05）。 结论：嗅鞘细胞移植可能通过降低脊髓损伤后损伤区髓磷脂相关糖蛋白的表汰．从而促讲榻伤脊髓的修复．     

胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤影响功能恢复的因素

目的：探讨胚胎嗅鞘细胞移植晚期脊髓损伤患者后，影响其功能恢复的因素b。方法：①取胚胎嗅球，消化成单个嗅鞘细胞后培养12-17d待用。②选择2001—11／2004—01首都医科大学附属北京朝阳医院和北京西山医院收治的脊髓损伤、志愿接受胚胎嗅鞘细胞移植的患者300例。其中完全性损伤222例。不完全性损伤78例。病程0．5-31年，平均3．1年。将胚胎嗅鞘细胞移植到脊髓损伤部位的上下处。③所有患者在胚胎嗅鞘细胞移植手术前和手术后2-8周按ASIA标准评价和随访，比较年龄、受伤时间、性别、损伤程度和损伤水平对胚胎嗅鞘细胞移植后功能恢复的影响。。结果：①按ASIA标准评价神经功能有部分功能快速恢复，其中运动功能由术前（39．1&;#177;20．6）分提高到（45．9&;#177;20．3）分（P〈0．001）。轻触觉由术前（51．7&;#177;24．9）分提高到（63．4&;#177;23．0）分（P〈0．001），痛觉由术前（53．0&;#177;24．21分提高到（65．3&;#177;22．7）分（P〈0．001）。②手术前ASIA级别为A级者222例。术后38例改善为B级。46例为C级。（萤除损伤水平中颈段运动和轻触觉分数高于胸段外，年龄、受伤时间、性别、损伤程度和损伤水平等因素比较没有显著性差异。结论：胚胎嗅鞘细胞移植能快速帮助晚期脊髓损伤患者恢复部分神经功能。但除损伤水平中颈段运动和轻触觉分数高于胸段外，年龄、受伤时间、性别、损伤程度和损伤水平并不是影响胚胎嗅鞘细胞移植后功能恢复的因素。     

嗅鞘细胞移植改善晚期脊髓损伤患者神经功能的近期效应

背景：既往认为中枢神经无再生能力。但近年来研究发现，脊髓损伤后，改变局部环境，损伤的神经轴突可以有再生能力并能恢复部分神经功能。 目的：探讨胚嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤患者是否安全、可行和有效恢复神经功能。 设计：自身前后对照观察。 单位：北京西山医院神经疾病研究治疗中心、首都医科大学附属北京朝阳医院神经外二科和解放军海军总医院神经外二科。 对象：选择2001-11／2003—02首都医科大学附属北京朝阳医院神经外二科和海军总医院神经外二科治疗的晚期脊髓损伤患者171例。其中完全性损伤147例，不全性损伤24例。伤后时间：0.5～18年。治疗过程经有关医疗伦理委员会讨论同意，细胞捐献者自愿同意，被治疗者知情同意。 方法：①取胚胎嗅球，消化成单个嗅鞘细胞后培养12-17d。②将胚胎嗅鞘细胞移植到患者脊髓损伤部位的上下处。③所有患者在胚胎嗅鞘细胞移植手术前和手术后2～8周按美国脊髓损伤学会（ASIA）评分标准评价。 主要观察指标：①嗅鞘细胞移植术后患者脊髓功能恢复情况。②不良事件及副反应。 结果：171例患者全部进入结果分析。①嗅鞘细胞移植术后患者脊髓功能恢复情况：171例均有部分神经功能快速恢复，其中运动功能评分由术前34．5&;#177;20、3提高到42．0&;#177;20．0（P〈0．001），轻触觉评分由术前47、2&;#177;24．0提高到61．8&;#177;23．0（P〈0．001），痛觉评分由术前48．6&;#177;23、5提高到64．0&;#177;22、8（P〈0、001）。②不良事件及副反应：1例术区感染导致脊髓损害表现早期加重；2例严重肺部感染，1例丘脑出血，此3例患者最终因严重呼吸、循环衰竭而死亡。 结论：嗅鞘细胞移植能快速促进晚期脊髓损伤患者恢复部分神经功能，但作用机制尚需进一步观察。     

嗅鞘细胞移植后脑出血大鼠神经前体细胞增殖及神经功能评分变化

背景：嗅鞘细胞作为一种可再生且自体取材的移植细胞，在脊髓疾病移植治疗中受到广泛关注，关于脑出血的移植治疗目前有待实验结果的进一步积累。目的：观察嗅鞘细胞移植后脑出血大鼠神经前体细胞的增殖，评估嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的疗效。设计：完全随机对照实验。单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科。材料：实验于2002-03／2003-03在华中科技大学同济医学院临床神经研究中心完成。选择健康雄性Wistar大鼠32只随机分为2组，每组16只。嗅鞘细胞移植组在制作大鼠尾状核出血模型第3天时，取10μL嗅鞘细胞悬液向大鼠脑内匀速注射（1μL/min）。对照组注射生理盐水10μL。方法：大鼠在移植前，移植后第3，7，14，30天分别进行神经功能评分。模型制作后第1天在两组中各取1只大鼠，制备脑组织切片，神经元轴突髓鞘观察采用髓鞘固蓝染色，神经纤维观察采用神经纤维嗜银染色。各组移植后第3，7，14，30天各取1只大鼠，制作石蜡切片，观察嗅鞘细胞移植后存活、迁徙及神经前体细胞的增殖情况，并进行神经前体细胞计数。主要观察指标：①两组大鼠脑出血后神经元轴突髓鞘和神经纤维观察。②两组大鼠脑出血后第3，7，14，30天神经前体细胞计数。③两组大鼠脑出血后第3，7，14，30天时神经功能缺损评分。结果：32只大鼠均进入实验分析。①脑出血后第30天时血肿周边及血肿灶中嗅鞘细胞计数：移植组的髓鞘化数量和神经纤维数量明显多于对照组。②两组大鼠脑出血后神经前体细胞计数：脑出血后第7，14，30天，嗅鞘细胞移植组的神经前体细胞数明显多于对照组[（41．1&;#177;2.4）个／视野，（34．5&;#177;1．2）个／视野；（43．6&;#177;1．2）个／视野，（37．2&;#177;2．0）个／视野；（19.3&;#177;1．0）个／视野，（14．2&;#177;0．4）个／视野，（t=2．42-4．02,P〈0．05）]。③两组大鼠脑出血后神经功能缺损评分：嗅鞘细胞移植组在脑出血后第14，30天时明显低于第3天[（2．21&;#177;0．20）分，（1．50&;#177;0．21）分，（2．74&;#177;0．21）分，0=2．06，3．27，P〈0．05）]，对照组只在脑出血后第30天时低于第3天[（1．96&;#177;0．12）分，（2．76&;#177;0．20）分，（t=2．47，P〈0．05）]。结论：①嗅鞘细胞有增加内源性神经前体细胞数量的作用。②嗅鞘细胞可促进脑内神经细胞轴突再生，使其重新髓鞘化并建立突触联系，恢复其运动功能，进而加快损伤组织的修复。     

移植神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅鞘细胞对脊髓损伤后细胞凋亡的影响

目的:探讨大鼠脊髓损伤后神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰的嗅神经鞘细胞移植对脊髓损伤后细胞凋亡及促进神经功能恢复的作用。方法:实验于2003-09/2004-04在广东医学院实验动物中心完成,SD大鼠48只,雌雄不限,体质量240～260g。随机分为3组:基因修饰组,嗅鞘细胞移植组,脊髓损伤组,每组16只。均首先行大鼠脊髓损伤造模。基因修饰组和嗅鞘细胞移植组分别移植神经生长因子、脑衍生神经生长因子修饰的嗅鞘细胞和单纯嗅鞘细胞,脊髓损伤组不做治疗。移植后12周,采用免疫组织化学法和原位末端标记法对损伤区的脊髓组织切片进行细胞凋亡的检测,主要观察bcl-2(细胞凋亡抑制基因),bax和fas(细胞凋亡诱导基因)阳性表达的情况评估经基因修饰和未经基因修饰的单纯嗅鞘细胞对脊髓神经凋亡的抑制及诱导作用。结果:48只大鼠均进入结果分析。①原位末端标记法检测结果:基因修饰组细胞凋亡数低于嗅鞘细胞移植组,脊髓损伤组最高。②免疫组织化学结果:Bcl-2蛋白表达的顺序为基因修饰组>嗅鞘细胞移植组>脊髓损伤组(20.79±6.40,13.54±3.66,9.34±2.12,P<0.05);Fas,Bax蛋白表达的顺序均为脊髓损伤组>嗅鞘细胞移植组>基因修饰组[(24.98±4.32,40.48±2.05),(18.92±4.74,25.54±3.82),(11.78±3.81,16.87±3.30),(P<0.05)]。结论:单纯移植嗅鞘细胞其存活时间与分泌有限。神经生长因子和脑衍生神经生长因子是神经营养因子的主要成员,用神经生长因子和脑衍生神经生长因子基因修饰嗅鞘细胞后可提高嗅鞘细胞的生存时间和提高分泌神经营养因子功能,移植后具有抑神经细胞凋亡的作用。     

兔坐骨神经细胞微囊化处理移植至大鼠损伤脊髓对神经生长因子表达变化的影响

目的：观察并比较兔坐骨神经组织细胞微囊化处理与单纯兔坐骨神经组织细胞移植至大鼠损伤脊髓及大鼠单纯脊髓损伤3组神经生长因子表达的变化。方法：实验于2003-05／2005-05在九江学院医学科研中心完成。①制备不同移植材料：取10只成年家兔双侧完整坐骨神经制备细胞悬液；兔坐骨神经组织细胞悬液微囊化处理，将细胞浓度调整为（2．0-2．5）&;#215;10^6L^-1后与15g/L海藻酸钠生理盐水溶液混合，经双腔喷头将海藻酸钠-坐骨神经组织细胞悬液混合液喷入20mmol/L的氯化钡生理盐水溶液中，加入生理盐水洗涤2次。②脊髓损伤大鼠模型制作：取健康SD大鼠90只，随机分为3组，微囊化兔坐骨神经组织细胞悬液组（微囊化组）；单纯兔坐骨神经组织细胞悬液组（单纯悬液组）和单纯损伤组，每组30只。健康SD大鼠腹腔麻醉（30mg／kg）成功后，以T10为中心，暴露T10棘突及椎板，作脊髓右半侧横向切开，并去除约2min脊髓组织。立即在损伤腔内植入约2mm&;#215;2mm&;#215;2mm的明胶海绵作为填充支架，微囊化组在明胶海绵上吸附10μL微囊化兔坐骨神经组织细胞悬液；单纯悬液组在明胶海绵上吸附10μL单纯兔坐骨神经组织细胞悬液；单纯损伤组不做任何移植。③神经生长因子检测：于移植后1，3，7，14，28d，取出大鼠脊髓损伤平面为中心的2cm脊髓标本，每组6个标本共18张切片，进行免疫组织化学染色（SABC法），神经生长因子染色以细胞浆呈明显的棕黄色为阳性染色。分别计算每平方毫米阳性神经细胞数。 结果：90只大鼠全部进入结果分析。①各组神经生长因子阳性神经元测定结果：微囊组在1，3，7，14，28d均高于单纯损伤组和单纯悬液组；在第7，14，28天明显高于单纯损伤组和单纯悬液组[7d：（28．55&;#177;2．26），（7．65&;#177;3．35），（19．35&;#177;．2．39）个／mm^2；14d：（30．52&;#177;3．51），（8．10&;#177;2．45）（20．45&;#177;3．45）个／mm^2；28d：（27．50&;#177;4．50）。（6．59&;#177;3．85）．（17．50&;#177;4．65）个／mm^2，P〈0．01或0．05]；第14天达到顶峰（P〈0．01）。②神经生长因子免疫组织化学染色结果：微囊组可见大量棕黄色颗粒，主要分布在脊髓前角神经元和胶质细胞，白质和灰质也可见阳性颗粒。 结论：兔坐骨神经组织细胞悬液移植对大鼠脊髓损伤修复有明显的促进作用，微囊化处理后大鼠损伤脊髓神经生长因子表达高于单纯细胞悬液移植和单纯损伤组，更有利于损伤脊髓的再生和修复。     

切断周围神经后局部嗅鞘细胞移植对脊髓及神经节内神经元的作用

目的：观察周围神经切断后局部嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓及神经节内神经元的作用，为嗅鞘细胞移植治疗周围神经损伤提供实验依据。 方法：实验于2005—08／2006—01在西安交通大学医学院动物实验中心完成。选用健康成年SD大鼠55只，随机数字表法分为3组：对照组25只．实验组25只、空白组5只。①对照组与实验组大鼠在坐骨切迹处游离坐骨神经的各分支，在远端切断，在半腱肌内侧肌膜上切口，将坐骨神经近断端的各游离分支包埋进肌肉，神经外膜与肌膜缝合固定，实验组在缝合口两侧2mm处肌肉中各注射1&;#215;10^9L^-1的嗅鞘细胞0．1mL，对照组注射细胞培养液DMEM。空白组仅暴露坐骨神经而不进行切断。②术后1，2，3，7和14d，分批处死对照组和实验组大鼠，每次5只，空白组于14d后处死，分别进行病理及TUNEL法观察神经元的改变。 结果：实验共选用大鼠55只，全部进入结果分析。①坐骨神经损伤后各组不同时间点苏木精-伊红染色观察伤侧前角运动神经元存活率变化：术后7，14d，实验组大鼠脊髓前角运动神经元的形态改变与对照组相似，但变性数目明显少于对照组，存活神经元数目明显多于对照组（P〈0．01）。②坐骨神经切断后各组坐骨神经损伤侧前角运动神经元凋亡指数变化：在术后第3，7，14天，对照组明显多于实验组[（21&;#177;1．1）％，（1．2&;#177;0．8）％；（3．1&;#177;1．1）％，（1．4&;#177;0．6）％；（6．1&;#177;1．8）％，（4．1&;#177;1.3）％，P〈0．05]。③坐骨神经切断后各组坐骨神经损伤侧神经节神经元凋亡指数变化：7，14d时，实验组的神经节内的感觉神经元凋亡阳性细胞要较对照组少[（2．1&;#177;0.32）％，（4．4&;#177;0．56）％；（4．3&;#177;1．8）％，（6．7&;#177;2．5）％，P〈0．05]。 结论：在周围神经损伤后脊髓及神经节内神经元有凋亡发生，嗅鞘细胞移植对神经元凋亡有保护作用。     

嗅鞘细胞移植对周围神经端侧吻合后侧支轴突再生的修复作用

目的：观察大鼠腓神经轴突数目、神经纤维直径、髓鞘厚度、神经电生理和胫前肌湿重恢复率，探讨大鼠周围神经损伤行嗅鞘细胞移植对端侧吻合后轴突再生的作用。方法：实验于2004—03／11在广东医学院实验动物中心完成。Wistar大鼠72只，随机分为3组，每组24只。端端吻合组：行左腓总神经端端吻合；端侧吻合组：行左胫腓神经端侧吻合；嗅鞘细胞组：行左胫腓神经端侧吻合后再生室内注嗅鞘细胞悬液。术后30和60d进行各项指标检测。①再生腓神经的神经电生理检测：应用VikingⅡ型肌电图仪检测大鼠胫前肌的肌电图和运动神经传导速度。②胫前肌湿重：胫前肌肌湿重恢复率=实验侧肌湿重／正常侧肌湿重&;#215;100％。⑧组织学检查：腓总神经轴突数目。④超微结构：透射电镜下观察。结果：纳入72只大鼠均进入结果分析。①各组大鼠再生腓神经电生理检查结果：术侧胫前肌M波，术后30d，端端吻合组出现M波，波幅〉5mV，端侧吻合组和嗅鞘细胞组75％出现M波，术后60d，端侧吻合组和嗅鞘细胞组100％出现M波，其中嗅鞘细胞组的波幅大部分〉5mV。随时间的延长各组手术侧运动神经传导速度增加，潜伏期缩短，30d，端端吻合组与正常侧差异无显著性（P〉0．05），60d时嗅鞘细胞组与端端吻合组之间差异无显著性（P〉0．05），与端侧吻合组比较差异仍有显著性（P〈0．05）。②大鼠胫前肌湿重恢复率：30d，嗅鞘细胞组明显优于端侧吻合组[（56．57&;#177;1．89）％，（50．21&;#177;3．68）％，P〈0．05]，在60d时已与端端吻合组无显著性差异[（91．34&;#177;1．76）％，（97．11&;#177;3．41）％，P〉0．05]。③大鼠腓总神经组织学检查：60d，嗅鞘细胞组神经轴突数目优于端侧吻合组[（997．00&;#177;123．34），（710．00&;#177;102．01）个／mm^2，P〈0．05]。④大鼠再生神经组织透射电镜观察结果：60d嗅鞘细胞组再生纤维增厚，髓鞘内板层变致密，轴浆内富含神经微丝，微管排列规则，分布均匀，电镜下观察同端端吻合组类似。结论：嗅鞘细胞移植可以促进周围神经端侧吻合后侧支轴突再生，改善端侧吻合质量。     

自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠修复大鼠脊髓全横断损伤

背景：神经损伤时移植嗅鞘细胞能促进轴突再生,减少星形胶质细胞增生。目的：探讨自体嗅鞘细胞移植联合中药β-七叶皂甙钠对脊髓继发性损伤的保护作用。方法：制作SD大鼠脊髓损伤模型,随机分为对照组（注射生理盐水）、自体嗅鞘细胞移植组、自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗组。结果与结论：脊髓损伤后脊髓血管源性水肿、基质金属蛋白酶9表达上调,大鼠运动功能缺失,经自体嗅鞘细胞移植及自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠治疗后脊髓水肿明显减轻、基质金属蛋白酶9表达下调,大鼠运动功能恢复,以自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗效果更明显。说明自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠可更有效修复损伤脊髓,发挥保护作用。     

嗅鞘细胞移植促进脊髓损伤修复的长期实验和临床观察

目的：嗅鞘细胞在大鼠完全损伤脊髓内长期存活和修复作用的研究以及嗅鞘细胞移植治疗人类脊髓损伤的观察。方法：解放军北京军区总医院全军骨科中心实验室用新生Wistax大鼠嗅球做嗅鞘细胞原代纯化培养，大量增殖后植入完全损伤的大鼠脊髓内，同时设立注入DMEM培养液和单纯椎板切除的对照组。术前及术后2，4，8，16和24周进行动物神经功能评定(BBB评分)；术后24周取损伤段及其邻近脊髓标本，行苏木精—伊红染色、嗜银染色，及透射电镜观察了解脊髓再生情况；同时荧光显微镜下观察Hoechst标记的嗅鞘细胞在体内存活情况。选择解放军北京军区总医院2003—06／12住院的脊髓损伤患者进行嗅鞘细胞移植，术后随访。结果：①手术后4周，嗅鞘细胞移植组，DMEM注射组开始有运动功能恢复，嗅鞘细胞移植组运动功能好于DMEM注射组(P&;lt;0．01)；在各个时间段BBB分值嗅鞘细胞移植组均高于DMEM注射组(P&;lt;0．01)。②苏木精—伊红及嗜银染色显示，嗅鞘细胞移植组，DMEM注射组脊髓损伤区及其近端都有神经纤维，排列紊乱，嗅鞘细胞移植组数量多于DMEM注射组(P&;lt;0．01)，但都少于相应节段的对照组(P&;lt;0．01)。③24周后荧光显微镜下观察到Hoechst标记的嗅鞘细胞仍存在于OEG移植组脊髓损伤段周围。④透射电镜结果见嗅鞘细胞移植组胶质瘢痕近端大量新生有髓神经纤维并形成S型突触连接。⑤患者运动功能无显著改善(P&;gt;0．01)，感觉功能恢复明显(P&;lt;0．01)。结论：①移植的嗅鞘细胞可在受体内长期存活(至少6个月)并迁移。②嗅鞘细胞移植能促进轴突再生，并对脊髓功能有一定的修复作用。     

异体移植气管中骨形态发生蛋白诱导软骨再生的实验

目的：比较骨形态发生蛋白2在犬自体、异体、冷冻异体气管移植体内诱导软骨再生的作用。方法：实验于2004-03／10在第四军医大学唐都医院实验外科完成。21只杂种犬随机等分为3组，自体移植组、异体移植组、冷冻后的异体移植组。各组动物颈部切除4环气管段作为移植体，植入骨形态发生蛋白2后埋入腹腔大网膜中。骨形态发生蛋白2均以胶原溶液作为缓释载体，用注射器直接注入各软骨环间。术后5周处死实验动物，通过对标本组织学观察、碱性磷酸酶活性和钙含量测定，对各标本的新生软骨进行观察和定量分析。结果：各组实验犬均存活到预杀期。①定量组织学观察：各实验组骨形态发生蛋白2植入区均可见新生软骨细胞和软骨岛，HPLAS-1000病理图像分析系统计算各环间新生软骨的像素面积，自体移植组、异体移植组、冷冻后的异体移植组的新生软骨面积差异有显著性[2573．6&;#177;738．4，1691．3&;#177;743．6，2482．9&;#177;827．5，F=5．711，P〈0．05]，而自体移植组和深低温冷冻后的同种异体移植组差异无显著性。②碱性磷酸酶活性和钙含量测定：自体移植组、冷冻后的异体移植组与异体移植组均差异有显著性[自体移植组：（7．00&;#177;0．50）μkat／g，（5．48&;#177;1．15）mg／g；冷冻后的异体移植组：（7．00&;#177;0．83）μkat／g，（5．03&;#177;0．91）mg／g；异体移植组：（5．00&;#177;0．67）μkat／g，（3．57&;#177;0．98）mg／g，P〈0．05]，自体移植组与深低温冷冻后的同种异体移植组间无显著性差异（P〉0．05）。结论：骨形态发生蛋白2能在气管移植体内有效地诱导出新生软骨，在冷冻后的异体气管移植体内的作用效果与自体气管移植体内相似，明显优于异体气管移植体。     

大鼠脊髓缺血再灌注损伤后促红细胞生成素及其受体的表达变化

目的：观察脊髓缺血再灌注损伤后促红细胞生成素及其受体的表达变化，分析促红细胞生成素对中枢神经保护作用的可能途径。 方法：实验于2003-04／10在解放军第三军医大学外研所三室完成。选择健康雄性SD大鼠（鼠龄4～6个月）20只，随机分为正常对照组10只和脊髓损伤组10只。建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，采用反转录-聚合酶链反应方法来测定促红细胞生成素和促红细胞生成素受体mRNA的表达，采用免疫荧光细胞化学染色测定促红细胞生成素受体蛋白表达情况。 结果：纳入动物20只，均进入结果分析。①总RNA的提取：在10g／L琼脂糖凝胶电泳上，可见28s和18s两个清晰条带，28s与18s比值约为2：1，未见明显降解。②脊髓损伤前后促红细胞生成素及促红细胞生成素受体mRNA的表达：在正常脊髓组织中，促红细胞生成素及促红细胞生成素受体mRNA有少量表达，目的基因与内参的吸光度比值为0．107&;#177;0．017，0．289&;#177;0．023；缺血再灌注损伤48h后促红细胞生成素及促红细胞生成素受体mRNA分别为0．173&;#177;0．032，0．725&;#177;0．109，比正常对照组增加61．7％和150．9％，二者相比差异显著（P〈0．01）。③脊髓损伤前后促红细胞生成素受体蛋白水平的表达：阳性反应显色位于细胞膜及胞浆，促红细胞生成素受体反应在神经元和胶质细胞均存在，但主要集中于神经元。正常对照组脊髓神经元细胞有少量促红细胞生成素受体蛋白表达，阳性细胞数／高倍视野（&;#215;200）为13．10&;#177;2．68；而脊髓损伤组表达明显增加，荧光亮度增强，阳性细胞数／高倍视野（&;#215;200）为36．00&;#177;5．93，与正常对照组相比差异显著（P〈0．01）。 结论：脊髓组织中存在促红细胞生成素及促红细胞生成素受体，促红细胞生成素对中枢神经保护作用的机制可能与脊髓缺血再灌注损伤后促红细胞生成素受体表达明显增加有关。     

自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠修复大鼠脊髓全横断损伤

背景:神经损伤时移植嗅鞘细胞能促进轴突再生,减少星形胶质细胞增生。目的:探讨自体嗅鞘细胞移植联合中药β-七叶皂甙钠对脊髓继发性损伤的保护作用。方法:制作SD大鼠脊髓损伤模型,随机分为对照组(注射生理盐水)、自体嗅鞘细胞移植组、自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗组。结果与结论:脊髓损伤后脊髓血管源性水肿、基质金属蛋白酶9表达上调,大鼠运动功能缺失,经自体嗅鞘细胞移植及自体嗅鞘细胞联合β-七叶皂甙钠治疗后脊髓水肿明显减轻、基质金属蛋白酶9表达下调,大鼠运动功能恢复,以自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠治疗效果更明显。说明自体嗅鞘细胞移植联合β-七叶皂甙钠可更有效修复损伤脊髓,发挥保护作用。     

延迟植入嗅鞘细胞修复成鼠的胸髓损伤

背景:脊髓损伤后在一定的微环境中有再生的能力。嗅鞘细胞兼具星形胶质细胞和许旺细胞的特性,具有促进脊髓轴突再生的能力。目的:制作成鼠胸髓损伤模型,观察嗅鞘细胞对损伤脊髓轴突再生的作用。设计:观察性实验。单位:中山大学附属第二医院。材料:实验于2001-01/2002-11在中山大学附属第二医院完成。20只成年SD雄性大鼠,体质量(380±20)g,由中山大学实验动物中心提供(机构许可证号:SYXK(粤)2004-0020)。低糖的DMEM培养液(L-DMEM,GibcoBRL公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、MBP(髓磷脂碱性蛋白,Sigma公司)、抗神经生长因子受体抗体(Sigma公司)。应用随机数字表完全随机化分为细胞移植组和对照组,每组10只。方法:将成年SD大鼠麻醉断颈处死,无菌条件下取出完整嗅球分嗅神经。采用改良Allen法打击脊髓建立胸髓损伤模型。细胞移植组于损伤脊髓处注入10μL嗅鞘细胞悬液(2.5×1010L-1),对照组仅注入相同剂量DMEM/F12(1∶1)培养液。移植后6周通过组织学和免疫组织化学方法观察嗅鞘细胞对脊髓轴突再生的影响。主要观察指标:①抗神经生长因子受体抗体染色鉴定嗅鞘细胞。②髓磷脂碱性蛋白染色观察髓鞘的修复。③嗜银染色观察神经轴突再生。结果:细胞移植组有2只动物死亡,对照组有3只死亡,共15只大鼠进入结果分析。①细胞移植组可见损伤脊膜完整,较正常脊髓稍变细。苏木精-伊红染色见损伤区有多极细胞,且与脊髓组织有移行过度现象,说明存活的嗅鞘细胞与宿主融合良好。新生的轴突多呈束状,周围有小圆淋巴细胞浸润。嗜银染色可见再生轴突长入损伤区组织中,多与束状排列的多极细胞伴行;对照组脊髓损伤处明显变细,脊膜尚完整。苏木精-伊红染色见脊髓损伤区未见新生轴突。嗜银染色未见再生轴突。②细胞移植组可见多极细胞,多呈束状排列,胞浆内有大量抗神经生长因子受体抗体阳性颗粒存在,进一步证明嗅鞘细胞移植6周后仍然存活,且与宿主融合良好。髓磷脂碱性蛋白染色见损伤区有呈线状髓磷脂碱性蛋白阳性纤维,提示损伤区两端均有髓鞘样物质产生,且互相靠拢。同时多极细胞中也发现有髓磷脂碱性蛋白阳性物质存在,说明移植的嗅鞘细胞有产生髓鞘样物质的作用。对照组未见轴突再生。结论:嗅鞘细胞延迟植入成鼠打击伤后脊髓后,可存活并产生髓鞘样物质,促进宿主脊髓轴突再生。     

大鼠脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子及神经营养因子3的表达变化

目的：观察脊髓半横断损伤后早期不同时间神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的表达变化。方法：实验于2005-07／12在解放军总医院神经外科实验室完成。取成年清洁级雄性SD大鼠，体质量（250&;#177;20）g。将24只SD大鼠按双盲法随机分为2组，对照组6只，仅进行至椎板切除，即行切口关闭，不损伤脊髓。损伤组18只，3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，T10处椎板切开后，在T9～T10间用虹膜刀片横断半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫，刺激无反应后，关闭切口。分别于伤后3，7，21d不同时间点取材，每个时间点6只。取损伤位点尾侧段T10节段制作冰冻切片，运用神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3兔抗血清以免疫组化ABC法染色。观察并计数脊髓半横断损伤后尾侧端腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的阳性神经元数。组间比较均采用q检验。结果：①神经生长因子、脑源性神经营养因子主要分布于正常大鼠脊髓腹角神经元细胞浆，神经营养因子3分布于脊髓腹角神经元细胞核、胞浆。②损伤后3，7，21d腹角脑源性神经营养因子和神经营养因子3阳性神经元数均较对照组明显增加[（15．48&;#177;3．20）。（12．59&;#177;2．03），（11．33&;#177;1．92），（7．31&;#177;1．54）；（16．73&;#177;3．30），（11．15&;#177;2．85）。（13．20&;#177;3．39）。（6．00&;#177;1．50），（P〈0．01）1，术后3d时达高峰，随伤后时间的延长进行性减少。⑧损伤后3，7，21d神经生长因子阳性神经元数较对照组明显增加[（10．63&;#177;2．90），（14．07&;#177;2．37），（9．35&;#177;3．50），（4．00&;#177;0．63）。（P〈0．01）]，术后7d时达高峰，3d与21d比较差异无显著性意义。结论：脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3表达明显增加，提示它们可能在脊髓半横断损伤早期修复中发挥作用。     

大鼠骨髓基质细胞移植对脊髓横断损伤的修复功能

目的：研究骨髓基质细胞修复脊髓损伤的可能性，探索治疗脊髓损伤的新方法。方法：实验于2002-04／2003—04在哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心完成。取20只大鼠，制作椎体水平脊髓离断伤的大鼠动物模型，随机分为细胞移植组和单纯损伤组。前者将体外培养至第5代的大鼠骨髓基质细胞，用Brdu标记后，移植到大鼠脊髓离断处，后者仅注射等量生理盐水。饲养12周，定期观察动物体质量变化，进行功能评定，12周后处死动物，行病理，免疫组织化学和电镜检查。进行两组对比观察。结果：细胞移植组动物和单纯损伤组动物在脊髓损伤后12周后肢功能的Tarlov评分分别为(4．65&;#177;0．18)，(3．65&;#177;0．35)分，斜板试验结果分别为(74．82&;#177;7．04)&;#176;，(50．21&;#177;5．06)&;#176;，体质量变化分别为(127&;#177;15．96)．(123．9&;#177;16．5)g，差异均有显著性意义。骨髓基质细胞移植组大鼠脊髓功能恢复优于单纯损伤组，大体所见及病理，免疫组织化学，电镜检查证明该组离断脊髓有明显修复迹象。结论：体外培养的大鼠骨髓基质细胞移植在大鼠骨髓内能够至少存活12周，并在脊髓损伤处发挥一定的修复功能。     

外源性神经生长因子对血肿灶周神经元再生的影响

目的：观察神经生长因子作用下血肿灶周神经元再生状况。 方法：实验于2003-03／2004-04在河北医科大学第二医院影像科分子影像学实验室完成。健康家犬21只，随机分为3组：神经生长因子组（n=9）：注血后0．5h，将神经生长因子2000AU立体定向导入血肿灶周区。脑出血对照组（n=6）：只注血，不注药。对照组（n=3）：只进针，不注血和注药。3组动物进入实验程序后前3d进行BrdU标记，在脑出血后3，10，28d3个时间点进行激光共聚焦显微镜检测，观察血肿灶周BrdU荧光单标和BrdU-NSE及BrdU-GFAP荧光双标细胞的数目和所在位置（BrdU为新生神经元的标记物，NSE为成熟神经元的标记物，GFAP为成熟星形胶质细胞的标记物）。 结果：实验动物21只均进入结果分析。①新生神经元数目：神经生长因子组3，10，28d时BrdU单标阳性细胞数多于脑出血对照组（2．31&;#177;0．24，9．52&;#177;1．87，4．43&;#177;0．56：0．12&;#177;0．14，3．85&;#177;1．87，1．41&;#177;0．32，P〈0．05）．10和28d时BrdU-NSE和BrdU-GFAP双标阳性细胞数明显多于脑出血对照组（BrdU-NSE：3．84&;#177;0．24和6．23&;#177;1．92，1．35&;#177;0．71和1．39&;#177;0.24；BrdU-GFAP：4．51&;#177;9．08和10．53&;#177;9．47，1．65&;#177;0．08和1．37&;#177;0．13，P〈0．05）：神经生长因子组10d时BrdU单标阳性细胞数最多，28d时BrdU-NSE和BrdU-GFAP双标阳性细胞数明显增多。②新生神经元分布：神经生长因子组双标细胞的分布多位于血肿靠近额叶皮质面，在皮质与皮质下移行区内可见双标细胞，而脑出血对照组极罕见。 结论：外源性神经生长因子立体定向导入血肿灶周区，能够通过刺激额叶皮质内源性神经干细胞再生、迁徙和分化的机制，促进血肿灶周神经功能的修复。     

许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用

目的：观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤舯促进作用，为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据。 方法：实验于2004-04／2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成。纳入普通级雄性Wistar大鼠24只，体质量180-220g。随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组，每组8只。分笼饲养。另纳入5-8d龄spmgue-Dawley乳鼠40只，取其双侧坐骨神经与臂丛神经。实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损。空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损。酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞；许旺细胞与10mm长的脱细胞神经移植物共培养后，应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损。13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况。 结果：Wistar大鼠24只全部进入结果分析，没有脱失。①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀，轴索略粗，髓鞘厚度有差别，部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构，许旺细胞包绕神经纤维，轴索内微丝微管结构较清晰，无髓神经纤维直径较小，不均匀分布在有髓神经纤维之间，由一层纤维结缔包裹形成纤维束，实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄，自体移植组再生神经纤维均较粗，许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘，髓鞘厚薄基本相同。②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形，并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布。许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着。③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率（有髓纤维总面积／神经干总面积）接近自体移植对照组，差异无显著性意义[（5344&;#177;592），（5514&;#177;373）；（3．13&;#177;0．16），（3．19&;#177;0．25）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（57．11&;#177;2．28）％；P〉0．05]；与空白对照组比较差异有显著性意义[（5344&;#177;592），（3191&;#177;236）；（3．13&;#177;0．16），（1．28&;#177;0．33）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（31．05&;#177;4．19）％；P〈0.05]。 结论：与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生，促进神经损伤修复，是临床修复神经缺损的可行办法。