人参皂苷Rh2通过Egr-1/TRL4/mTOR信号通路抑制食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和EMT

目的:研究人参皂苷Rh2对食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用以及作用机制。方法:CCK-8法检测人参皂苷Rh2对食管癌细胞Eca-109增殖的影响;细胞划痕实验检测人参皂苷Rh2对食管癌Eca-109细胞迁移的影响;Western blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin和Slug的蛋白表达水平。结果:人参皂苷Rh2能够显著抑制Eca-109细胞的增殖,且呈剂量依赖性;此外,人参皂苷Rh2显著抑制E-cadherin、Vimentin和Slug的蛋白表达,并抑制Eca-109细胞迁移;人参皂苷Rh2显著抑制Egr-1、TRL4和mTOR的蛋白表达;进一步的研究结果表明人参皂苷Rh2通过抑制Egr-1/TRL4/mTOR信号通路抑制食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和EMT。结论:人参皂苷Rh2能够抑制食管癌细胞Eca-109的增殖、迁移和EMT,其作用机制是通过介导Egr-1/TRL4/mTOR信号通路来实现的。这一结果能够为治疗食管癌的进一步研究提供分子基础。     

尼美舒利对人食管癌Eca-109细胞凋亡及Survivin和Caspase-3表达的影响

目的:观察环氧化酶-2(COX-2)选择性抑制剂尼美舒利对人食管癌Eca-109细胞增殖及凋亡的影响,研究其对凋亡抑制蛋白Survivin和Caspase-3表达的影响,探讨尼美舒利诱导Eca-109细胞凋亡的作用机制.方法:尼美舒利作用Eca-109细胞后,MTT法测定尼美舒利对人食管癌Eca-109细胞增殖的抑制率;电子显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡:RT-PCR法检测Eca-109细胞Survivin mRNA表达变化,Western blot检测Survivin和Caspase-3蛋白表达变化.结果:尼美舒利(50～400μmol/L)对Eca-109细胞生长有抑制作用,随浓度升高、时间延长抑制作用增强,并诱导Eca-109细胞凋亡,呈剂量-时间效应关系;尼美舒利可降低Survivin mRNA和蛋白表达,增加Caspase-3蛋白表达.结论:尼美舒利可诱导人食管癌细胞株Eca-109凋亡,其机制可能与下调Survivin表达及激活Caspase-3表达有关.     

虫草素抑制食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和侵袭的作用及机制研究

目的:探讨虫草素对食管癌细胞Eca-109的作用及其潜在的机制。方法:不同浓度（35、70、140、280 μg/mL）虫草素分别处理Eca-109细胞24 h、48 h、72 h和96 h,CCK-8检测细胞活力,筛选虫草素最佳作用浓度（70 μg/mL）和时间（24 h）。实验分为4组:对照组、虫草素组（70 μg/mL虫草素）、SB203580组（10 μg/mL SB203580）和虫草素+SB203580组（70 μg/mL虫草素+10 μg/mL SB203580）。培养24 h后,CCK-8检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力;qRT-PCR和Western blot分别检测细胞周期相关、凋亡相关和p38 MAPK信号通路相关基因和蛋白的表达。结果:与对照组相比,虫草素组、SB203580组和虫草素+SB203580组细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低（P＜0.05）,细胞发生G2期阻滞,凋亡率显著升高（P＜0.05）,cyclinB1、CDK4、p-p38、ERK1和ERK2的表达下调（P＜0.05）,CKI和Caspase-3的表达上调（P＜0.05）。结论:虫草素可抑制食管癌细胞Eca-109增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡,其作用机制与p38 MAPK信号通路有关。     

转录因子Snail对食管癌Eca-109细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨Snail在诱导食管癌细胞侵袭和迁移中的作用及机制。方法 采用慢病毒转染构建食管癌细胞株Eca-109-Snail和Eca-109-vc,Real-time PCR及Western blot实验分别检测其mRNA及蛋白表达水平,Transwell及细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力。 结果 慢病毒转染细胞株构建成功。经Real-time PCR及Western blot实验鉴定慢病毒转染后的Eca-109-Snail细胞Snail表达量升高,细胞表现出成纤维细胞样外形,细胞之间彼此分离;Eca-109-Snail细胞E-cadherin表达下降,Vimentin和MMP-2表达上升,其侵袭和迁移能力较空载体对照组增强,差异均具有统计学意义（P<0.01）。 结论 Snail通过诱导食管癌Eca-109细胞发生上皮间质转化,进而提高其侵袭和迁移能力。     

食管癌细胞株高侵袭力亚系的建立及其生物学特性研究

目的:建立具有不同转移潜能的高侵袭能力食管癌细胞株亚系并研究其生物特性.方法:利用Transwell侵袭小室从人食管鳞癌Eca-109细胞株筛选高侵袭能力食管癌亚系,HE染色比较细胞形态;四甲基偶氯唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力的变化;流式细胞术( FCM)检测细胞周期;蛋白质印迹法检测与侵袭能力相关基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和金属蛋白醇组织抑制因子-2(TIMP-2)蛋白表达.结果:利用Transwell侵袭小室从食管癌Eca-109细胞株中筛选出高侵袭能力食管癌细胞株亚系,命名为Eca-109 T4.2个细胞系细胞形态没有明显差异.MTT法检测显示,亚系Eca-109 T4增殖能力强.细胞周期显示,增殖指数(PI)高,PI=41.0％,且MMP-2蛋白表达相比增高,P=0.023;TIMP-2蛋白表达相比增高,但差异无统计学意义,P=0.392.结论:建立了不同转移潜能的高侵袭能力食管癌细胞株亚系,将可以用于探讨食管癌转移机制的研究.     

RNA干扰靶向抑制食管癌细胞株Nucleostemin基因表达

[目的]探讨NHeleostemin（NS）基因特异性RNA干扰对食管癌Eca-109细胞株增殖和凋亡情况的影响。[方法]用NS特异性siRNA表达载体转染食管癌Eca-109细胞株．利用MTT法测试细胞增殖抑制率：RT—PCR法检测NS基因表达量的变化．流式细胞仪法检测细胞周期分布和细胞凋亡情况。[结果]与阴性对照组相比．PCDNA4／C—NS—silencer组细胞的增殖速率降低,24h、48h、72h细胞增殖抑制率分别为57．8％、74．9％、87.3％：NS基因表达量下降,GdG,期细胞百分率显著升高,S期细胞减少,细胞凋亡率增加。[结论]RNAi技术可显著抑制食管癌Eca-109细胞株NS基因表达,导致细胞增殖缓慢．细胞周期阻滞．凋亡增加。     

腺病毒介导NDRG2在体外对人食管鳞癌细胞系Eca-109增殖和凋亡的影响

目的:研究抑癌候选基因NDRG2在体外对人食管鳞癌细胞系Eca-109增殖和凋亡的影响.方法:腺病毒介导NDRG2转染人食管鳞癌细胞系Eca-109,逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测NDRG2基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基嚷唑基四唑法(MTT法)绘制细胞生长曲线,流式细胞仪(FCM)分别分析细胞周期和细胞凋亡.结果:腺病毒介导NDRG2转染人食管鳞癌细胞系Eca-109后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞增殖受到明显抑制(P＜0.05);流式细胞仪检测显示,与对照组相比,感染后48小时Eca-109细胞G2期细胞明显减少(P＜0.01),S期细胞明显增多(P＜0.01);转染后的Eca-109细胞中凋亡细胞明显增多,感染48h后达16.0%.结论:过表达NDRG2可明显抑制人食管鳞癌细胞Eca-109的增殖并诱导细胞凋亡.     

siRNA干扰STAT3基因对食管癌Eca-109细胞生物学特性的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3信号传导通路对人食管癌Eca-109细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法:针对人STAT3基因mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,将其连入pRNAT-U6.1/neo质粒中,构建STAT3-siRNA表达载体,稳定转染人食管癌Eca-109细胞,利用RT-PCR、Western blot技术分别检测转染细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,MTT实验、流式细胞技术检测转染细胞的增殖、细胞周期和凋亡变化情况.结果:成功构建STAT3-siRNA表达载体,经测序鉴定正确.RT-PCR和Western blot结果显示,STAT3-siRNA3表达载体明显抑制了人食管癌Eca-109细胞中STAT3基因mRNA和蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01).MTT实验显示,稳定转染siRNA后,siRNA3实验组细胞的增殖能力明显下降,细胞生长抑制卒为35.68%,较对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞技术显示,siRNA3实验组出现了细胞周期阻滞和细胞凋亡,细胞周期阻滞于G_0/G_1期,细胞凋亡率为13.26%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);结论:RNA干扰技术沉默STAT3基因可以有效地抑制STAT3基因的表达,进而抑制人食管癌Eca-109细胞的增殖,引起细胞周期G_0/G_1期阻滞,促进其凋亡.     

香加皮宝霍甙-Ⅰ抑制人食管癌细胞增殖的机制

目的观察香加皮活性成分宝藿甙-Ⅰ对食管癌细胞增殖活性及凋亡的影响,并探讨其与β-catenin通路的关系。方法采用MTT法观察宝藿甙-Ⅰ对食管癌细胞Eca-109增殖活性的影响;Annexin V/PI染色检测宝藿甙-Ⅰ对食管癌细胞凋亡的影响。RT-PCR法检测宝藿甙-Ⅰ对食管癌细胞β-catenin、survivin 和c-myc mRNA表达的影响,Western blot和激光共聚焦显微镜检测食管癌细胞β-catenin、磷酸化β-catenin、survivin和c-myc蛋白表达的变化。结果10~40μg/ml宝藿甙-Ⅰ明显降低了Eca-109细胞的增殖活性并诱导其凋亡。经宝藿甙-Ⅰ处理24 h后,β-catenin、survivin 和c-myc mRNA和蛋白表达水平均降低,磷酸化的β-catenin蛋白表达升高,β-catenin在细胞核和细胞质中的表达均降低,且在胞核中的降低更为明显。结论香加皮宝藿甙-Ⅰ可通过调节β-catenin通路活性抑制食管癌Eca-109细胞增殖。     

γ-synuclein在食管癌中的表达及其对食管癌Eca-109细胞侵袭力的影响

目的:研究γ-synuclein在食管癌中的表达及其对人食管癌细胞株Eca-109侵袭力的影响.方法:选取2010年1月至12月于河北医科大学第四医院食管癌患者组织标本30例,同时取10例正常食管组织作对照.采用免疫组化法观察食管癌组织中γ-synuclein的表达情况.采用脂质体法转染含γ-synuclein的重组质粒pcDNA3.0-γ-synuclein,应用RT-PCR检测转染后Eca-109细胞中γ-synuclein mRNA的表达,流式细胞术检测γ-synuclein蛋白的表达,利用Transwell实验检测转染后Eca-109细胞侵袭力的变化.结果:与正常食管组织相比,食管癌组织中γ-synuclein蛋白阳性表达率明显增强(83.3％ vs40.0％,P＜0.05),Ⅰ-Ⅱ期食管癌患者γ-synuclein表达率明显低于Ⅲ-Ⅳ期(22.2％ vs 76.2％,P＜0.05).pcDNA3.0-γ-synuclein质粒转染后,Eca-109细胞中γ-synuclein mRNA表达水平显著高于空质粒转染组和未转染组[(1.10±0.03)vs(0.42±0.03),(0.45±0.15),P＜0.01],蛋白表达水平也明显增高[(1.05 ±0.061) vs (0.80±0.45),(0.79 ±0.46);P＜0.05],穿膜细胞数明显增加[(167 ±2.51)vs(65 ±2.60),(70±2.50);P＜0.01].结论:食管癌组织高表达γ-synuclein,其表达上调能增强人食管癌Eca-109细胞的侵袭力,提示其在食管癌的转移和恶性发展中发挥重要作用.     

RNA干扰缺氧诱导因子1α对食管鳞癌和胃腺癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对人食管痛及胃癌细胞体外增殖、迁移及血管生成拟态的影响.方法 将HIF-1α shRNA重组质粒pGCsi-shHIF-1 α稳定转染人食管鳞癌细胞Eca-109和胃腺癌细胞SGC-7901,采用Western blot方法检测常氧及缺氧情况下各组转染细胞HIF-1α的抑制效果,采用平板克隆形成实验和四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染细胞的增殖活性,采用Transwell小室检测转染细胞的迁移能力,采用三维培养方法观察Eca-109和SGC-7901细胞能否形成血管网状结构及转染细胞株的管腔形成能力.结果 常氧及缺氧情况下,各转染组细胞HIF-1α蛋白表达量均为0,与未转染组(Eca-109组分别为0.74±0.05和1.11±0.06,SGC-7901组分别为0.60±0.05和0.96±0.07)比较,表达均被显著抑制(均P＜0.01).与空载体组和未转染组相比,转染组细胞的增殖活性显著降低(均P＜0.05),体外迁移能力显著降低(均P＜0.01).Eca-109细胞株各组中,常氧情况下,Eca-109组和Eca-109/shRNA组形成管状结构数目分别为(30.8±3.9)个和(3.7±2.8)个,差异有统计学意义(P＜0.01);缺氧情况下,分别为(34.3±3.4)个和(3.9±2.7)个,差异有统计学意义(P＜0.01).缺氧情况下,Eca-109组形成管状结构数日较常氧时明显增加(P＜0.05).SGC-7901细胞株各组中,常氧情况下,SGC-7901组和SGC-7901/shRNA组形成管状结构数目分别为(26.2±3.4)个和(4.9±3.5)个,差异有统计学意义(P＜0.01);缺氧情况下,分别为(30.1±4.1)个和(5.3±3.6)个,差异有统计学意义(P＜0.01).缺氧情况下,SGC-7901组形成管状结构数日较常氧时明显增加(P＜0.05).结论 Eca-109细胞和SGC-7901细胞均能形成血管生成拟态管状结构.RNA于扰沉默HIF-1α能有效抑制Eca-109细胞和SGC-7901细胞增殖、迁移及体外血管生成拟态管状结构形成.

Abstract：

Objective To investigate the effect of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) on the proliferation, migration and vasculogenic mimicry(VM ) in human esophageal squamous cell carcinoma cell line Eca-109 and gastric adenocarcinoma cell line SGC-7901 in vitro.Methods The recombinant plasmid pGCsi-shHIF-1α was transfected into Eca-109 and SGC-7901 cells by LipofectamineTM 2000.The inhibitory effect of HIF-1α was measured at protein level by Western blot under normoxia and hypoxia.The cell proliferation was detected by colony formation and MTT assays.The migration of transfected cells was assayed using Transwell chambers.Whether Eca-109 and SGC-7901 cells could form the capillary tube-like structures (TLSs) was observed by 3-dimensional culture, and the tube formation of transfected cells was detected by tube-like structure formation assay.Results The expression of HIF-1α protein in each group of transfected cells was significantly suppressed under normoxia and hypoxia ( Eca-109: 0.00, 0.74 ± 0.05;0.00, 1.11±0.06; SGC-7901: 0.00, 0.60 ±0.05; 0.00, 0.96 ±0.07, P＜0.01).Colony formation and MTT assays showed that the cell proliferation of the pGCsi-shHIF-1α transfected cells was slower than that of the control groups (104.7±9.6, 151.7±4.5; 88.3±5.1, 128.3±6.7, P＜0.05).The migration of the recombinant plasmid-transfected cells was significantly suppressed compared with that of cells transfected with empty vector (55.5 ± 11.2, 121.9 ± 17.3; 64.7 ± 10.8, 132.3 ± 16.0, P ＜ 0.01 ).Both the Eca-109 and SGC-7901 cells could form TLSs when cultured on matrigel, and the number of tubules was significantly increased under hypoxia (30.8 ± 3.9, 34.3 ± 3.4;26.2±3.4,30.1±4.1,P＜0.05),the tubule-forming ability of transfected groups was significantly inhibited under normoxia and hypoxia ( Eca109: 3.7±2.8, 30.8±3.9; 3.9 ±2.7, 34.3 ±3.4; SGC-7901: 4.9 ±3.5, 26.2 ±3.4; 5.3 ±3.6,30.1 ±4.1, P＜0.01 ).Conclusions Both the esophageal squamous cell carcinoma cell line Eca-109 and gastric adenocarcinoma cell line SGC-7901 are capable of forming vasculogenic mimicry structures in vitro.The recombinant plasmid pGCsi-shHIF-1α can efficiently suppress their proliferation, migration and vasculogenic mimicry formation.     

食管鳞癌细胞外泌体中miR-130a对血管新生的作用及其机制

目的 探讨食管鳞癌细胞外泌体中的miR-130a对血管新生的作用及其机制.方法 提取食管上皮细胞HEEC、食管鳞癌细胞TE-13和Eca-109所分泌的外泌体及转染miR-130a mimic、miR-130a inhibitor及其阴性对照(NC)后的Eca-109细胞外泌体,并与人脐静脉血管内皮细胞HUVEC共孵育...     

宝藿苷-I联合5-FU对食管癌Eca-109细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究宝霍苷-I与5-FU联合应用对食管癌Eca-109细胞增殖和凋亡的影响。方法：实验设联合用药组（12.5mg/L宝霍苷-I＋12.5mg/L5-FU）、阴性对照组（0.1%DMSO）、25mg/L宝藿苷-I组和12.5mg/L5-FU组,共4组,每组均设3个复孔,每孔100μl（含Eca-109细胞数为1×10~4个）。作用24、48、72h时,采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法分别检测各组Eca-109细胞的增殖;并在作用48h后,用流式细胞术检测Eca-109细胞凋亡率;用Western blot技术检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：宝霍苷-I、5-FU单用及其联合应用在24、48和72h时均可明显抑制Eca-109细胞的增殖,与阴性对照组比较,差异均有统计学意义（P均〈0.05）,联合应用的抑制作用显著优于单独应用（P〈0.05）。宝霍苷-I、5-FU单独及其联合作用48h后,均可诱导Eca-109细胞凋亡,均可下调Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白的表达,与对照组相比差异均有统计学意义（P均〈0.05）,且联合用药组较单独用药组作用明显（P〈0.05）。结论：宝霍苷-I与5-FU联合应用对Eca-109细胞的增殖抑制和凋亡诱导有协同作用,可能与下调Bcl-2蛋白的表达、上调Bax蛋白的表达有关。