IDH1基因在肝内胆管癌细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其初步机制

目的 探讨异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)在肝内胆管癌(iCCA)细胞HuCCT1增殖与迁移中的作用及其可能的分子机制。方法 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IDH1基因敲除的HuCCT1细胞(HuCCT1^IDH1-/-);CCK-8法和克隆形成实验检测IDH1野生型HuCCT1(HuCCT1^WT)细胞和HuCCT1^IDH1-/-细胞的增殖能力;细胞划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力;Western blotting检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、Wnt3a、β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平。生物信息学方法分析上述两种HuCCT1细胞的转录组测序结果,Western blotting验证转录组信息通路相关蛋白的表达。结果 与HuCCT1细胞比较,HuCCT1^IDH1-/-细胞增殖和克隆形成数目明显减少(P<0.05...     

CUL3对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制

目的 探讨泛素连接酶Cullin3(CUL3)对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法基于TCGA数据库分析CUL3在胃癌和癌旁组织中的表达及其与临床预后的关系。采用CUL3 shRNA和空载慢病毒转染HGC-27和BGC-823细胞，构建CUL3敲低胃癌细胞系组(shCUL3组)与空载慢病毒转染组(空载组)。采用CCK-8法、克隆形成实验、EdU染色、划痕实验和Transwell实验检测两组的增殖、迁移和侵袭能力；采用Western blotting检测两组上皮-间质转化(EMT)相关蛋白和PI3K/Akt/GSK3β通路蛋白的表达情况；应用PI3K激动剂740 Y-P后检测shCUL3组细胞迁移和侵袭能力的变化。结果 TCGA数据库中CUL3在胃癌中呈高表达，且与胃癌患者预后不良明显相关。CCK-8、克隆形成实验和EdU染色结果显示，与空载组比较，shCUL3组胃癌细胞增殖能力受到抑制(P<0.05)，且CUL3 shRNA可明显抑制细胞的迁移和侵袭能力(P<0.05)。与空载组比较，shCUL3组E-cadherin蛋白表达升高，波形蛋白、β-caten...     

利用CRISPR／Cas9系统构建H22细胞GP73基因敲除稳定株及功能鉴定

目的：利用CRISPR／Cas9基因编辑系统敲除小鼠源肝癌细胞H22中的GP73基因,构建H22细胞GP73基因敲除的稳定细胞株。方法根据CRISPR／Cas9靶点设计原则,设计2条特异性识别GP73基因启动子的上下游sgRNA,利用载体pX459质粒,构建2对重组真核表达质粒。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染至H22细胞内,使用嘌罗霉素加压筛选稳定敲除GP73的H22细胞株,利用免疫印迹检测重组质粒对内源GP73的敲除效果。MTT实验检测GP73被敲除后对细胞增殖能力的影响,再利用划痕实验检测细胞的迁移能力。结果免疫印迹结果说明敲除GP73基因的小鼠源H22细胞株内无GP73蛋白的表达;并且GP73被敲除后,H22细胞的增殖能力和迁移能力减慢。结论通过CRISPR／Cas9系统获得了靶向GP73基因的重组质粒,并且筛选出了稳定干扰GP73表达的细胞株,从而为探讨GP73在肝癌发生中的作用奠定基础。     

S100A4 siRNA对人胰腺癌BxPc-3细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的观察利用小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）技术下调人胰腺癌BxPc-3细胞中钙结合蛋白S100A4表达后对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法设计合成针对S100A4的特异性siRNA,转染至人胰腺癌BxPc-3细胞,以Western印迹检测转染前后S100A4蛋白表达变化;克隆形成率实验检测转染前后BxPc-3细胞增殖能力;Transwell小室模型检测转染前后BxPc-3细胞迁移和侵袭能力变化。结果 Western印迹结果显示BxPc-3细胞转染S100A4siRNA48h后,S100A4蛋白表达明显下调;Transwell小室验证转染S100A4siRNA后细胞的迁移和侵袭能力明显降低。结论本研究结果表明,S100A4表达下调后可抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,提示S100A4可以作为一个潜在的肿瘤治疗靶标。     

p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞迁移及体外血管生成的影响

目的 观察p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及体外血管生成的影响,探讨p54nrb基因在血管新生中作用.方法 用含有靶向人p54nrb基因shRNA的慢病毒感染HUVEC 24h后,用嘌呤霉素进行筛选,Western blotting检测HUVEC中p54nrb蛋白的表达,确定p54nrb基因沉默效率,建立稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8法检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞增殖的影响;划痕实验和Transwell迁移实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞迁移的影响;体外血管生成实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC体外血管生成能力的影响.结果 Western blotting结果显示,p54nrb基因沉默的HUVEC细胞中p54nrb蛋白表达显著减少,表明建立了稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8实验结果显示,p54nrb基因沉默轻度地促进了HUVEC细胞增殖;划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,p54nrb基因沉默后HUVEC细胞迁移能力明显下降;体外血管生成实验结果显示,p54nrb基因沉默明显抑制了HUVEC的体外血管生成能力.结论 p54nrb具有促进HUVEC细胞迁移及体外血管生成的作用,可能是一个新的参与血管生成的调控蛋白.     

应用CRISPR/Cas9技术构建MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株

目的 运用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术,构建线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,研究MAVS对细胞生长的影响.方法 针对MAVS基因第一外显子设计小向导RNA(sgRNA),构建pX459-sgRNA重组质粒.然后利用嘌呤霉素筛选ZR-751 MAVS基因敲除的阳性克隆,Western印迹检测MAVS基因敲除情况,提取克隆基因组进行测序鉴定.平板克隆实验检测MAVS被敲除后对细胞增殖的影响,再利用MTS实验检测在DFX培养基刺激下,MAVS对细胞死亡的影响.结果 Western印迹结果说明ZR-751细胞株内MAVS已完全敲除;且在凋亡诱导剂DFX刺激下,MAVS被敲除后促进细胞增殖.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功构建了MAVS基因敲除的ZR-751乳腺癌细胞株,初步实验提示MAVS抑制乳腺癌细胞生长,为后续研究MAVS在肿瘤中的功能奠定了基础.     

内源性MGF在IGF-I Pre-mRNA选择性剪接中的作用

目的利用CRISPR/Cas9敲除小鼠成肌细胞系C2C12机械生长因子(mechano-growth factors,MGF),研究MGF在IGF-I pre-mRNA选择性剪接和C2C12增殖分化中的作用。方法针对IGF-I第五个外显子设计并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒,通过细胞转染并筛选出MGF发生移码突变的细胞株。采用RT-q PCR技术,检测这些细胞株MGF和IGF-IEa表达变化,以及细胞增殖和肌向诱导分化能力的变化。结果成功构建了针对MGF的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并筛选出3株MGF移码突变细胞株。这些细胞株的MGF和IGF-IEa表达上升,细胞增殖活性减弱,在诱导分化过程中,肌细胞标志性基因myogenin、MGF和IGF-IEa表达升高。结论内源性MGF敲除能够影响IGF-I pre-mRNA的选择性剪接以及增殖分化能力。     

MIIP基因对人胶质瘤细胞U87增殖能力与放疗敏感性影响

目的探讨过表达迁移侵袭抑制蛋白(MIIP)基因对人胶质母细胞瘤细胞系U87放疗敏感性的影响。方法采用过表达MIIP基因慢病毒转染U87细胞,通过Western blot实验检测转染效率;MTT实验检测MIIP基因对U87细胞活力的影响;应用平板克隆形成实验,评价放射线照射对MIIP过表达组与对照组克隆形成能力的影响;进一步应用Western blot实验检测RAD51蛋白与BCL2蛋白的表达情况。结果 MIIP基因过表达可以抑制神经胶质瘤细胞U87的增殖能力。上调MIIP基因,抑制U87细胞的克隆形成能力,并提高放疗敏感性。放疗前与放疗后,MIIP基因均抑制RAD51蛋白与BCL2蛋白的表达。结论过表达MIIP基因抑制U87细胞的增殖能力与克隆形成能力;MIIP基因可提高U87细胞放疗敏感性,其机制与RAD51、BCL2信号转导通路相关。     

内源性MGF在IGF-Ⅰ Pre-mRNA选择性剪接中的作用

目的 利用CRISPR/Cas9敲除小鼠成肌细胞系C2C12机械生长因子(mechano-growth factors,MGF),研究MGF在IGF-Ⅰ pre-mRNA选择性剪接和C2C12增殖分化中的作用.方法 针对IGF-Ⅰ第五个外显子设计并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒,通过细胞转染并筛选出MGF发生移码突变的细胞株.采用RT-qPCR技术,检测这些细胞株MGF和IGF-IEa表达变化,以及细胞增殖和肌向诱导分化能力的变化.结果 成功构建了针对MGF的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并筛选出3株MGF移码突变细胞株.这些细胞株的MGF和IGF-IEa表达上升,细胞增殖活性减弱,在诱导分化过程中,肌细胞标志性基因myogenin、MGF和IGF-IEa表达升高.结论 内源性MGF敲除能够影响IGF-Ⅰ pre-mRNA的选择性剪接以及增殖分化能力.     

过表达迁移侵袭抑制蛋白基因对人巨细胞病毒转染U87细胞特性影响

目的探讨过表达迁移侵袭抑制蛋白(MIIP)基因对人巨细胞病毒(HCMV)感染的神经胶质母细胞瘤U87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法采用过表达的MIIP基因慢病毒转染HCMV感染的U87细胞,通过Western-blot检测其转染效率,并将细胞分为为实验组(U87+HCMV/MIIP)、对照组(U87+HCMV/CMV4)和空白组(U87+HCMV)。采用CCK-8检测过表达的MIIP基因对HCMV转染的U87细胞增殖情况的作用;采用Transwell迁移实验检测对细胞迁移情况的影响;采用Transwell体外侵袭实验检测对细胞侵袭能力的影响。结果实验组细胞的MIIP蛋白表达量与对照组和空白组比较,明显上调(P<0.05);细胞的增殖能力与对照组和空白组比较,明显降低(P<0.05);细胞的侵袭力与对照组和空白组比较,明显减弱,且细胞数显著下调(P<0.05);迁移能力与对照组和空白组比较,显著降低(P<0.05)。结论 HCMV感染的U87细胞在MIIP基因过表达后增殖、侵袭及迁移能力均受抑制。     

METTL3对肝内胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨m6A甲基转化酶样蛋白3(METTL3)对肝内胆管癌细胞系QBC939和RBE细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,以及可能的分子机制.方法 通过嘌呤霉素筛选的方法将携带METTL3基因的重组质粒转染肝内胆管癌细胞系QBC939和RBE,得到稳定过表达METTL3的肝内胆管癌细胞系;采用小干扰RNA(siRNA)瞬时敲低肝内胆管癌细胞系中的METTL3;采用Western印迹检测肝内胆管癌细胞系中METTL3蛋白的表达水平,验证过表达和敲低METTL3的效果;采用细胞增殖实验(CCK-8法)检测METTL3对肝内胆管癌细胞系增殖能力的影响,Transwell法验证METTL3对肝内胆管癌细胞系迁移和侵袭能力;采用Western印迹检测过表达或敲低METTL3后p-ERK蛋白的表达水平,Log-rank检验比较METTL3高表达组和低表达组胆管癌患者的生存期差异.结果 过表达METTL3可显著促进QBC939和RBE细胞的增殖、迁移及侵袭能力,而敲低METTL3显著抑制QBC939和RBE细胞的增殖、迁移及侵袭能力.过表达METTL3促进磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)的蛋白表达水平,而敲低METTL3则抑制p-ERK的蛋白表达水平.METTL3在肝内胆管癌组织中上调表达,且其高表达与胆管癌患者的不良预后可能相关.结论 METTL3通过促进肝内胆管癌细胞系的增殖、迁移及侵袭能力而发挥癌基因的功能.     

利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果.使用高通量测序的方法进行基因表达分析.用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖.结果 成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响.结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能.     

YAP1基因促进人甲状腺癌细胞生长与迁移

目的 构建带myc标签的人Yes相关转录调节蛋白1(YAP1)基因的真核表达载体,探讨YAP1对甲状腺癌BCPAP细胞增殖和迁移的影响.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增YAP1的编码区序列,将其插入到pXJ40-myc载体中,构建pXJ40-myc-YAP1重组质粒并鉴定;质粒转染人甲状腺癌BCPAP细胞,Western印迹鉴定融合蛋白表达,细胞增殖实验(CCK-8法)、克隆形成实验、划痕实验检测细胞的生长、增殖和迁移能力的变化.结果 pXJ40-myc-YAP1质粒构建成功;转染BCPAP细胞后重组融合蛋白表达成功;细胞增殖实验、克隆形成及划痕实验证明YAP1可促进甲状腺癌细胞BCPAP的增殖和迁移.结论 带myc标签的人YAP1基因能在人甲状腺癌BCPAP细胞中表达,且可促进该细胞的增殖和迁移,为进一步研究YAP1在甲状腺肿瘤中的功能奠定了基础.     

HepG2肝癌细胞中p24β1水平对高尔基体结构的影响

目的 通过改变人肝癌细胞HepG2中p24β1表达水平,研究该细胞中p24β1表达水平是否对高尔基体产生影响。方法 利用RNA干扰实验敲低HepG2细胞中p24β1表达（HepG2-KD）,通过Western印迹检测蛋白干扰效率,实时荧光定量PCR(qPCR)验证转录水平;通过CRISPR/Cas9基因编辑系统构建同源染色体双敲除p24β12基因的HepG2细胞系（HepG2-KO）,在基因组测序和Western印迹检测敲除表型后,通过CCK-8实验和克隆形成实验比较HepG2-KO与HepG2的细胞增殖活性;利用细胞免疫荧光实验分析高尔基体标志物α-N-乙酰半乳糖胺残基在细胞中的分布是否受p24β1水平影响。结果 RNA干扰后能使HepG2细胞中p24β1基因的表达下调;成功构建了同源染色体双敲除p24β1的HepG2-KO细胞系,其细胞增殖活性较HepG2无明显差异;在HepG2-KD和HepG2-KO细胞中,高尔基体呈弥散分布,并伴随片层状顺式高尔基体形态改变。结论 在肝癌细胞HepG2中,p24β1水平对于稳定高尔基体的结构至关重要,提示其对高尔基体功能具有重要调控作用。     

长链非编码RNA GAS5对胰腺癌AsPC-1细胞凋亡、迁移及侵袭能力调控作用

目的 探讨长链非编码RNA GAS5(lncRNA GAS5)对胰腺癌AsPC-1细胞凋亡、迁移及侵袭能力的调控作用。方法 在胰腺癌细胞系AsPC-1中通过转染质粒过表达lncRNA GAS5,将转染pcDNA3质粒的AsPC-1细胞组设为对照组,将转染pcDNA3-GAS5质粒的AsPC-1细胞组设为实验组。通过实时定量PCR、流式细胞学、细胞划痕实验、Transwell实验等方法检测lncRNA GAS5对胰腺癌细胞凋亡、迁移及侵袭能力的调控作用。结果 实时定量PCR结果显示,实验组AsPC-1细胞系中GAS5表达升高。流式细胞学检测显示,与对照组比较,转染GAS5对胰腺癌细胞凋亡影响不显著。细胞划痕实验显示,转染GAS5对胰腺癌细胞迁移能力抑制明显。Transwell实验结果显示,转染GAS5对胰腺癌细胞侵袭能力抑制明显。结论 lncRNA GAS5可能通过抑制胰腺癌细胞的迁移及侵袭功能发挥调控作用。     

Apak稳定敲除细胞系的建立及其p53活性和凋亡水平的变化

目的：利用CRISPR／Cas9慢病毒系统在人结肠癌细胞（ HCT116细胞）中建立稳定及永久性Apak敲除细胞系,检测Apak敲除后细胞部分生物学活性、p53活性和凋亡水平的变化。方法构建lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒,进行慢病毒包装,感染HCT116细胞,嘌罗霉素筛选出阳性克隆。通过蛋白质免疫印迹检测Apak蛋白水平,筛选得到Apak稳定敲除细胞系。分别通过报告基因实验、流式细胞术和克隆形成实验测定Apak稳定敲除细胞系中p53活性、细胞凋亡率和克隆形成能力。结果通过测序证明lentiCRISPR v2－sgRNA Apak敲除质粒正确,蛋白质免疫印迹证实Apak敲除细胞系中Apak表达缺失。在Apak敲除细胞系中p53的转录活性增强,Apak敲除细胞凋亡增加、克隆形成能力降低。结论获得Apak稳定敲除细胞系,便于后期Apak功能的研究。     

肌微管素相关蛋白7在小鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用及机制

目的 探究肌微管素相关蛋白7（Mtmr7）在小鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖和迁移中的作用及其机制。方法 培养小鼠主动脉平滑肌细胞系（MOVAS）,用30 ng/ml血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）诱导小鼠VSMCs体外增殖和迁移,采用q RT-PCR和Western blotting分别检测PDGF-BB干预后Mtmr7 m RNA和蛋白表达水平的变化。为探究Mtmr7对小鼠VSMCs增殖和迁移的作用,用Mtmr7基因过表达腺病毒（Ad-Mtmr7）感染VSMCs促使Mtmr7过表达,将MOVA S分为对照组、Ad-Mtmr7组、PDGF-BB组、Ad-Mtmr7+PDGF-BB组4组,采用Ki-67细胞免疫荧光染色、CCK-8法检测VSMCs增殖能力,划痕实验检测VSMCs迁移能力,Western blotting检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）下游靶标蛋白水平。用5 mg/L胰岛素（insulin）恢复mTORC1活性,将MOVA S分为PDGF-BB组、Ad-Mtmr7+PD GF-BB组、Ad-Mtmr7+PD GF-BB+insulin组3组,...     

利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除BMDM巨噬细胞系

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建Nedd4基因敲除骨髓衍生巨噬细胞系(BMDM),为研究Nedd4在巨噬细胞中的作用和机制奠定基础.方法 利用在线软件筛选了评分较高的3个针对Nedd4基因的单向导RNA(sgRNA),然后将合成的sgRNA序列插入到PX330质粒中;将重组质粒转入BMDM细胞,通过有限稀释法获取单克隆,采用Western印迹检测单克隆细胞中NEDD4蛋白水平;通过序列测定确认单克隆细胞的DNA序列.结果 通过Western印迹检测获取1株NEDD4蛋白缺失的BMDM细胞;测序结果表明该细胞系中Nedd4基因发生了16 bp的缺失突变.结论 利用CRISPR/Cas9技术构建的Nedd4敲除BMDM细胞系将成为研究Nedd4在巨噬细胞中的功能和机制的有力工具.     

利用CRISPR/Cas9系统构建Slc35c1敲除细胞株及其抗蓖麻毒素效应研究

目的 构建稳定敲除小鼠Slc35c1基因的单克隆细胞株,为研究Slc35c1基因抗蓖麻毒素毒性效应奠定实验基础.方法 根据Slc35c1基因序列设计2对sgRNA插入载体lentiCRISPRv2中,构建lentiCRISPRv2-sgRNA质粒;慢病毒包装并感染NIH/3T3细胞,加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;T7E1酶切鉴定sgRNA切割效率;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行RT-qPCR检测及基因组PCR产物测序,确认Slc35c1敲除成功的细胞株;最后通过CCK-8试剂检测蓖麻毒素对野生型和Slc35c1敲除细胞对的抗毒效应差异.结果 测序结果显示sgRNA成功插入载体质粒中,T7E1酶切结果表明两对sgRNA均可高效切割基因组DNA.RT-qPCR及基因组PCR产物测序鉴定出Slc35c1敲除的纯合子细胞株.CCK-8实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除Slc35c1使毒素作用NIH/3T3细胞24 h的IC50值由0.45×10-10 mol/L升至2.1×10-10 mol/L.结论 利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除了NIH/3T3细胞中的Slc35c1基因并筛选获得纯合子细胞株,该细胞株可用于抗蓖麻毒素效应的研究.