shRNA沉默ADAM17基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的 利用shRNA干扰沉默人乳腺癌细胞MCF-7的解聚素-金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17,ADAM17)基因,观察其对细胞增殖的影响.方法 针对ADAM17基因设计合成具有特异性的ADAM17-shRNA,经脂质体LipofectamineTM 2000转染MCF-7细胞.实验设对照组(空白PBS)、干扰组(转染干扰无义序列ADAM17-shNC)、实验组(转染ADAM17-shRNA),采用Reahime PCR检测各组细胞AD-AM17 mRNA的表达水平,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 实验组ADAM17 mRNA的相对表达量显著低于对照组和干扰组,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组的MCF-7细胞增殖活性较其他两组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组的MCF-7细胞进入S期(23.60±1.09)％和G2/M期(6.30±0.82)％的比例降低,绝大多数细胞停留在G0/G1期(65.17±1.35)％,细胞周期延缓,与对照组、干扰组相比较差异具有显著性意义(P＜0.05).结论 ADAM17-shRNA对人乳腺癌细胞MCF-7的ADAM17基因具有沉默作用,从而抑制MCF-7细胞的增殖活性,延缓细胞周期进展.     

ADAM17-shRNA在缺氧条件下对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的：研究在缺氧环境下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17（ADAM17）的短发夹状 RNA（shRNA）对人乳腺癌 MCF-7细胞增殖的影响。方法针对 ADAM17设计4个特异性的 ADAM17-shRNA,经电穿孔法转染 MCF-7细胞。缺氧条件下培养细胞。试验分为：对照组（空白磷酸盐缓冲液）、无义序列组（转染无义序列 ADAM17-shRNA）和 shRNA 转染组（转染 ADAM17-shRNA,选择沉默 ADAM17基因效率最高的 shRNA 用于后续试验）。分别采用实时荧光定量 PCR、iCELLigence、流式细胞仪检测细胞 ADAM17 mRNA 的表达水平、细胞增殖活性和细胞周期变化。结果4个 shRNA 转染组对 MCF-7细胞的 ADAM17基因表达均有沉默作用,与对照组及无义序列组相比,差异具有统计学意义（P ＜0．05）,尤以 shRNA1219抑制率最高（F ＝5．11, P ＜0．01）。shRNA 转染组的细胞生长速度和增殖活性较对照组和无义序列组显著降低,差异有统计学意义（P ＜0．05）。shRNA转染组的绝大多数细胞停留在 G0／G1期（73．35±2．45）,与对照组（62．56±2．35）、无义序列组（62．68±1．20）相比较,差异有统计学意义（P ＜0．05）,细胞周期进展明显延缓。结论 ADAM17-shRNA 在缺氧条件下抑制乳腺癌细胞 MCF-7的增殖。     

ADAM17-shRNA 对MCF-7 乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用研究

目的 观察转染解聚素- 金属蛋白酶17- 短发夹RNA（ADAM17-shRNA）的MCF-7 乳腺癌 细胞在裸鼠体内的生长效果并探索其作用机制。方法 将30 只裸鼠随机分为转染组（接种转染ADAM17- shRNA 的MCF-7 乳腺癌细胞）、空载体组（接种转染shNC 的MCF-7 乳腺癌细胞）及对照组（接种正常 MCF-7 细胞）。分别在各组裸鼠右侧鼷部皮下种植细胞悬液0.2 ml/ 只,观察各组荷瘤裸鼠的生长状态、饮 食及体重变化。第28 天处死裸鼠并取出移植瘤。采用HE 染色观察组织学形态;Western blot 检测肿瘤局 部ADAM17、磷酸化表皮细胞生长因子受体(p-EGFR)、表皮细胞生长因子受体(EGFR)、磷酸化的蛋白激 酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK) 及细胞外调节蛋白激酶(ERK) 的 表达。结果 对照组、空载体组及转染组移植瘤最终体积分别为（639.821±15.429）、（643.350±15.543） 和（240.233±10.536）mm3,3 组不同时间点瘤体体积比较有差异（P <0.05）;不同组别瘤体体积比较有差 异（P <0.05）。HE 染色结果显示,移植瘤组织呈乳腺浸润性导管癌特征,对照组与空载体组无明显差异,转 染组较对照组、空载体组坏死多。转染组肿瘤组织中ADAM17、EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK 及 p-ERK 的蛋白表达水平低于对照组和空载体组（P <0.05）。结论 ADAM17-shRNA 可有效抑制MCF-7 乳 腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长。EGFR-PI3K-Akt 和EGFR-MEK-ERK 信号传导通路参与ADAM17-shRNA 的抑制作用。     

ADAM17下调影响NK细胞对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)下调对自然杀伤(NK)细胞杀伤作用的影响。方法体外培养人NSCLC A549细胞株,分为正常对照组(未转染)、阴性对照组(转染nonsense siRNA)和ADAM17下调组(转染ADAM17 siRNA)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组A549细胞ADAM17 m RNA表达,Western blotting检测各组A549细胞ADAM17蛋白表达。制备NK细胞,加入各组A549细胞中,检测NK细胞杀伤活性,Western blotting检测各组细胞中γ干扰素(IFN-γ)、颗粒酶B(GraB)、穿孔素(PFP)蛋白表达。结果各组细胞ADAM17 mRNA、蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P <0.05),正常对照组与阴性对照组细胞ADAM17 mRNA、蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05),ADAM17下调组较正常对照组、阴性对照组降低(P <0.05)。各组NK细胞对A549细胞的杀伤活性比较,差异有统计学意义(P <0.05),正常...     

RNAi沉默PRL-1基因对肺癌细胞侵袭能力的影响

目的:探讨RNA干扰(RNAinterference,RNAi)沉默促肝细胞再生磷酸酶1(phosphatase of regenerating liv-er cell-1,PRL-1)基因对肺癌细胞侵袭力的影响。方法:应用PRL-1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理肺癌A549细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和蛋白质印迹检测PRL-1基因mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果:与对照组比较,siR-NA转染组PRL-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P<0.05,P<0.05)。体外试验发现,PRL-1siRNA可有效抑制肺癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关(P<0.05,P<0.05)。结论:PRL-1基因在肺癌侵袭中起着重要的作用,采用PRL-1 siRNA转染可抑制肺癌细胞侵袭。     

ADAM17与HER-2在乳腺癌中表达的意义及相关性

目的探讨解聚素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)和原癌基因人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)在乳腺癌中的表达及相关性,探索新的乳腺肿瘤标记物。方法采用免疫组化法检测ADAM17和HER-2在正常乳腺组织及乳腺癌中的表达情况,并分析其表达与临床病理关系。结果 ADAM17和HER-2在正常乳腺组织中的表达以阴性为主,少部分呈弱阳性表达;而在乳腺癌中表达增高,以阳性表达为主,且强阳性占大部分,差异有统计学意义(P<0.05),两者在乳腺癌中的表达存在正相关性。ADAM17与HER-2表达水平与乳腺癌患者的年龄及肿瘤大小无关,而与腋窝淋巴结转移有关。结论 ADAM17和HER-2在乳腺癌中的表达增高,且两者的表达水平均可反映癌细胞的淋巴结转移能力,因此ADAM17可成为一个乳腺癌靶向治疗的新靶点。     

LIMK1在结肠癌中表达与沉默对人结肠癌细胞迁移与侵袭的影响

目的探讨LIMK1在结肠癌中的表达与临床病理参数的关系和沉默LIMK1对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的影响。方法免疫组化检测LIMK1在结肠癌表达;RNA干扰建立LIMK1-miR/SW480细胞株;RT-PCR与Western blot分别检测LIMK1 mNRA与蛋白及磷酸化LIMK1表达;划痕实验和侵袭实验检测沉默LIMK1对SW480细胞迁移与侵袭的影响。结果免疫组化显示,LIMK1在结肠癌中表达明显高于结肠正常组织,高分化腺癌表达明显低于中分化与低分化腺癌,而低分化高于中分化腺癌;<5.0 cm的结肠癌表达明显低于≥5.0 cm;淋巴结转移显著高于无转移;Dukes分期A+B组表达明显低于C+D组（P<0.05）。RT-PCR与Western blot显示,LIMK1-miR/SW480细胞LIMK1 mNRA与蛋白表达明显下调,表明成功构建稳定沉默LIMK1基因的SW480细胞。免疫细胞化学证实,沉默组LIMK1表达较未转染组与空载体组明显降低。Western blot显示,沉默组LIMK1和磷酸化LIMK1较未转染组与空载体组明显下调(P<0.05)。划痕实验显示,沉默组癌细胞迁移率（22.53%）较对照组（76.50%）与空载体组（72.14%）明显降低（P<0.05）。侵袭实验发现,沉默组穿膜细胞（43.67±1.51个）较未处理组（143.33±1.52个）与空载体组（136.34±1.53个）明显减少（P<0.05）。结论LIMK1表达与结肠癌发生、大小、淋巴结转移及Dukes分期有关。沉默LIMK1基因可抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭。     

RNAi沉默HPC2对鼻咽癌细胞迁移侵袭的影响及分子机制

目的 探讨HPC2在鼻咽细胞迁移侵袭中的作用及机制。方法 选取鼻咽癌5-8F细胞,采用小RNA干扰技术沉默HPC2的表达后,分3组进行功能实验,即Scrambled阴性对照组、#1 siRNA-HPC2组和 #2 siRNA-HPC2组,运用划痕实验比较细胞迁移愈合速率,Transwell检测比较各组细胞侵袭能力,Western blot法检测EMT通路关键分子的变化。结果 与对照组比较,HPC2沉默组的细胞迁移愈合速率及侵袭能力降低,差异有统计学意义(P<0.05)。从机制研究上发现,HPC2沉默后,Snail下调,MMP9下调。结论 沉默HPC2表达能降低鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力,机制上可能通过HPC2/snail/MMP9轴发挥作用。     

siRNA沉默S100A4基因表达抑制甲状腺癌细胞侵袭的研究

目的 探讨S100A4基因对甲状腺癌细胞侵袭的影响和可能机制.方法 采用S100A4基因小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转染处理人甲状腺癌ARO细胞后,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测S100A4基因和基质金属蛋白酶-2mRNA和蛋白水平;分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力.结果 siRNA转染组S100A4基因mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度依赖性（P＜0.000 1）.siRNA转染组软琼脂集落形成数和穿过滤膜的细胞数均明显下降,且呈浓度依赖性（P＜0.005;P＜0.005）.S100A4转染组MMP-2基因mRNA和蛋白水平明显下调.结论 采用S100A4 siRNA转染可抑制甲状腺癌细胞侵袭转移,其机制可能与下调MMP-2表达有关.     

缺氧条件下沉默解聚素-金属蛋白酶17基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的  探讨在缺氧条件下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17（ADAM17）基因的短发夹RNA（shRNA）对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用机制。方法  针对ADAM17基因设计具有特异性ADAM17-shRNA,经电穿孔转染MCF-7细胞。依据细胞培养条件（常氧和缺氧）和细胞转染因素（空白PBS、转染无义序列ADAM17-shNC、转染ADAM17-shRNA）,实验分为常氧对照组、常氧shNC组、常氧shRNA组、缺氧对照组、缺氧shNC组和缺氧shRNA组。通过充入1%氧O2、5%二氧化碳CO2和94%氮N2的混合气体培养箱模拟缺氧环境,分别采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、iCELLigence系统、流式细胞仪检测MCF-7细胞的ADAM1基因的表达水平、细胞生长曲线、增殖活性和细胞周期。结果  靶向针对ADAM17基因的ADAM17-shRNA在缺氧条件下可以有效沉默人乳腺癌MCF-7细胞ADAM17基因的表达（缺氧shRNA组2-△△CT=0.55±0.16）。从而导致MCF-7细胞生长速度减慢,细胞增殖能力降低,细胞周期延缓。结论  ADAM17 shRNA和缺氧存在协同作用,共同抑制肿瘤细胞的增殖。

     

FBXO22对结肠癌细胞侵袭迁移的影响及相关机制

目的： 探讨结肠癌细胞FBXO22基因表达沉默后对细胞侵袭迁移的影响及其相关分子机制。方法：利用siRNA-Ctrl和siRNA-FBXO22小干扰片段转染结肠癌SW620和HCT116细胞,干扰FBXO22基因表达,Western blot 检测细胞转染效率,Transwell细胞迁移实验分析干扰FBXO22对细胞侵袭迁移的影响,Western blot检测细胞侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9和MDM2水平的变化。结果：转染FBXO22 siRNA后,结肠癌SW620和HCT116细胞FBXO22的表达量明显下降、细胞侵袭转移能力降低,MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低,而MDM2蛋白表达水平上调。结论： FBXO22与结肠癌细胞侵袭迁移相关,其机制可能通过调节MMP-2和MMP-9表达而实现。     

姜黄素抑制结肠癌SW620细胞侵袭的体外实验研究

目的：观察姜黄素对结肠癌SW620细胞侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法：应用姜黄素处理人结肠癌细胞系SW620后,采用软琼脂集落培养试验检测锚着不依赖性增殖,采用Boyden小室模型试验检测癌细胞的侵袭性,采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEI,检测癌细胞失巢凋亡。结果：姜黄素可有效抑制结肠腺癌细胞集落生长和穿膜侵袭能力,且与浓度相关。琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果显示,姜黄素可诱导结肠癌细胞失巢凋亡,且与浓度和时间相关。结论：姜黄素呵抑制人结肠癌细胞侵袭,诱导失巢凋亡是其机制之一。     

辛伐他汀对HT29细胞的促凋亡作用及可能机制

目的:研究辛伐他汀对HT29细胞的促凋亡作用,以及可能存在的调控机制.方法:将人结肠癌HT29细胞在不同浓度辛伐他汀的培养基中培养24、48、72 h,观察细胞的增殖情况,MTT法检测其抑制率;流式细胞术检测不同浓度辛伐他汀对HT29细胞凋亡率的影响,RT-PCR法观察HT29细胞Bcl-2、Bax mRNA水平,蛋白质印迹法观察HT29细胞Bcl-2、Bax蛋白表达情况.结果:不同浓度辛伐他汀对HT29细胞增殖有抑制作用,且其抑制作用同时存在浓度及时间效应(P＜0.01);辛伐他汀对HT29细胞有促凋亡作用,抑制率随药物浓度增大而增加(P＜0.05);PCR、蛋白质印迹法检测表明辛伐他汀可分别在基因及蛋白水平下调Bcl-2的表达及上调Bax的表达.结论:辛伐他汀可显著抑制HT29细胞的增殖,促进其凋亡,其可能与下调Bcl-2基因、上调Bax基因的表达有关.     

CDH17 对那可丁耐药性结肠癌细胞 裸鼠移植瘤模型的影响

目的 研究下调肝肠钙黏连蛋白（CDH 17）基因对那可丁耐药的结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型的 影响。方法 以结肠癌细胞为研究材料,复制结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型。同时构建干扰质粒,从基因和 蛋白水平对CDH17 进行干扰,成功构建慢病毒载体。通过转移酶介导的末端标记法（TUNEL）检测下调 CDH 17 基因对结肠癌细胞的影响。结果 实时聚合酶链反应和Western blot 检测证实成功构建CDH17 的干 扰表达载体;TUNEL 检测表明下调CDH 17 基因可以促进对那可丁耐药的结肠癌细胞裸鼠移植瘤模型细胞凋 亡。结论 下调CDH 17 基因可以促进那可丁耐药性结肠癌细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖。     

重组人白细胞介素17A对结肠癌细胞生长的影响及其作用机制

目的：探讨重组人白细胞介素17A （IL-17A）对结肠癌细胞生长的影响,并阐明其作用机制。方法：将结肠癌SW480细胞分为对照组和实验组,对照组细胞未经处理,实验组细胞加入50 μg·L^-1重组人IL-17A。采用CKK-8法检测2组SW480细胞增殖活性,采用ELISA法检测2组细胞中IL-17A水平,Western blotting法检测2组SW480细胞中信号传导及转录激活因子3（STAT3）和磷酸化信号传导及转录激活因子3（p-STAT3）蛋白表达水平。结果：与对照组比较,实验组细胞增殖活性明显升高（P<0.05）。与对照组比较,实验组SW480细胞中IL-17A水平、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。结论：重组人IL-17A可刺激结肠癌细胞SW480细胞的生长,其作用机制可能与激活STAT3信号通路有关。     

IL-13对人结肠癌LS174T细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:探讨细胞因子IL-13对人结肠癌LS174T细胞增殖和侵袭能力的影响?方法:在正常培养的人结肠癌LS174T细胞培养液中加入终浓度为20 ng/ml的重组人IL-13,分别应用MTT法?Transwell小室实验检测肿瘤细胞增殖?侵袭能力的变化?结果:MTT实验显示,IL-13处理组细胞72?96 h的OD值明显高于对照组(P < 0.05)?Transwell小室实验中,IL-13处理组细胞穿过Matrigel胶的细胞数量明显多于对照组(P < 0.05)?结论:一定浓度的重组人IL-13可以诱导人结肠癌LS174T细胞的增殖和侵袭能力增加?     

NLE1在结肠癌中的表达及其对HT29细胞增殖凋亡的影响

目的 验证Notchless同源物1(Notchless homolog 1,NLE1)在结肠腺瘤及腺癌组织中的表达水平,评价其可能作用及机制。方法 通过免疫组化及实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法评价NLE1在结肠正常黏膜、腺瘤组织及腺癌组织中的表达水平。通过慢病毒转染,评价NLE1沉默对HT29细胞增殖、凋亡的影响及可能机制。结果 免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色显示,NLE1在结肠正常黏膜、腺瘤及腺癌组织中的高表达率分别为14.3% (15/105),44.0% (11/25)及68.6% (72/105),在腺癌中明显高于腺瘤(P<0.05),在腺瘤中明显高于正常黏膜(P<0.001)。实时荧光定量PCR显示,结肠正常黏膜、腺瘤及腺癌组织三组的NLE1 mRNA表达分别为1.38±0.82,5.04±2.09,7.57±1.25。腺癌组织中NLE1表达水平明显高于腺瘤(P<0.05),腺瘤组织中明显高于正常黏膜(P<0.01)。NLE1沉默显著抑制HT29细胞增殖(P<0.05)及克隆形成能力(P<0.05),促进其凋亡(P<0.05),并可促进Bax及Fas的表达。结论 结肠腺癌中高表达的NLE1可能通过影响肿瘤细胞增殖凋亡从而发挥促进肿瘤发生的作用。     

结肠癌HT29多细胞球的培养及其结构与生物学特性的观察

目的 建立结肠癌体外三维细胞培养模型HT29多细胞球,鉴定并检测其基本生物学特性.方法 琼脂糖抑制细胞贴壁、水平回旋振荡法培养HT29多细胞球;扫描电镜、HE染色、免疫组化检测多细胞球的组织病理学性质;透射电镜检测细胞超微结构;Cell counting kit-8检测药物敏感性.结果 成功培养由细胞相互黏附形成的多层细胞构成的结肠癌多细胞球模型;多细胞球内细胞接触广泛而紧密,可见大量细胞连接;多细胞球局部可见腺腔样结构,细胞角蛋白表达强弱与腺腔样结构有关;多细胞球药物敏感性显性降低,在500μg/L奥沙利铂处理48 h条件下,单层细胞生存分数为(9.3±2.0)%,而多细胞球则为(42.9±4.0)%,二者相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功建立了结肠癌多细胞球模型,此模型是研究体内无血管的微小结肠癌及结肠癌无血管区的较理想模型.