顺铂对耳蜗单离听觉细胞─氧化氮合酶表达的影响

目的 探讨顺铂对耳蜗单离听觉细胞诱导型─氧化氮合酶（ｉＮＯＳ／ＮＯＳⅡ）表达的影响。方法 以单 离毛细胞和单离螺旋神经节神经元为模型，用免疫组化方法（ＡＢＣ法）研究顺铂对细胞内ＮＯＳⅡ表达的影响。结果 在１ｍＭ顺铂平衡盐溶液中室温下培养两小时的外毛细胞及培养半小时的单离螺旋神经元与对照组相比显示了 对ＮＯＳⅡ抗体较强的免疫反应。结论 提示顺铂诱导了单离外毛细胞及单离螺旋神经元内ＮＯＳⅡ的合成增加，ＮＯ 可能参与了顺铂的耳毒作用。     

诱生型一氧化氮合酶在顺铂所致豚鼠耳蜗损伤中的表达

目的：检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）在顺铂所致豚鼠耳蜗损伤中的表达。方法：实验组豚鼠腹腔注射顺铂造成耳蜗损伤，对照组豚鼠腹腔注射等量生理盐水。用免疫组织化学的方法检测iNOS在耳蜗中的表达。结果：iNOS在实验组耳蜗的表达呈阳性，在对照组耳蜗的表达呈阴性。结论：iNOS在顺铂损伤耳蜗中呈阳性表达，iNOS催化产生大量NO而致耳蜗损伤。     

顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞毒性作用及机制

目的通过透射电镜及免疫组化法观察顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞的毒性作用。方法16只豚鼠随机均分为2组。顺铂组连续5天腹腔注射顺铂2mg/kg/d;对照组连续5天腹腔注射生理盐水2mg/kg/d;用药前后测试听力,处死动物后制作耳蜗标本,透射电镜观察及免疫组化法测定诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的表达。结果ABR:顺铂组听力下降明显,阈值显著升高(P<0.01)。透射电镜观察:顺铂组螺旋神经节细胞的细胞器损伤严重,核变形,线粒体肿胀,大量空泡样变,粗面内质网增多,有髓神经纤维的髓鞘增厚;对照组螺旋神经节细胞核无变形,核仁基本居中,线粒体结构正常。免疫组织化学显示:顺铂组螺旋神经节有iNOS阳性反应显色,灰度值降低,iNOS活性升高,与对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。结论顺铂可致耳蜗螺旋神经节细胞损伤并呈iNOS阳性表达,导致听力下降。     

银杏叶提取物对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用

目的 研究银杏叶提取物对顺铂耳毒性的拮抗作用。方法 杂色健康豚鼠27只，随机分为生理盐水组、顺铂（CDDP）组、银杏叶提取物（Egb CDDP）组，动态观察动物听阈变化及耳蜗外毛细胞形态学改变，并在损伤6天后，观察外毛细胞损伤率、耳蜗毛细胞凋亡情况。结果 CDDP组听阈及外毛细胞损伤率显著性升高，凋亡现象明显；Egb CDDP组外毛细胞的损伤率及听阈损伤均明显减轻，仅出现早期凋亡表现；生理盐水组各项指标均无明显变化。结论 Egb对顺铂所致的耳毒性具有明显拮抗作用。     

顺铂对豚鼠耳蜗毛细胞的损伤

目的观察顺铂中毒后豚鼠耳蜗毛细胞损伤特点,并探讨半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(caspase-3)在耳蜗毛细胞凋亡过程中的作用机制。方法健康豚鼠随机分为实验组和对照组各10只,实验组顺铂2mg·kg~(-1)·d~(-1),腹腔注射,连续6天：对照组用生理盐水等量腹腔注射,连续6天。动物实验期间每天测体重以调整药量,用药前及用药后第7天检测DPOAE,第7天处死豚鼠。左耳冰冻连续切片,免疫组织化学方法检测细胞中Caspase-3的表达;右耳冰冻连续切片,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法检测毛细胞凋亡。结果实验组中毛细胞受损,在细胞内观察到Caspase-3免疫阳性反应,并见凋亡细胞;对照组中未见毛细胞损伤,未见Caspase-3表达,未见凋亡细胞。结论顺铂可以通过诱导凋亡造成耳蜗毛细胞损伤,同时Caspase-3的表达,提示Caspase家族参与了耳蜗毛细胞凋亡过程。     

噪声刺激对耳蜗一氧化氮合酶的影响

目的：探讨一氧化氮（ＮＯ）在噪声性聋发病中的作用。方法：用中高频连续稳态噪声制作噪声性聋的动物模型,用ＮＡＤＰＨ－黄递酶组织化学、原位杂效和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法,观察噪声刺激对耳蜗一氧化氮合酶（ＮＯＳ）表达的影响。结果：组织化学法显示ＮＯＳ主要分布于内外毛细胞、螺旋神经节细胞和血管纹边缘细胞;原位杂效法发现ＮＯＳｍＲＮＡ在内外毛细胞、螺旋神经节细胞胞浆内均可见阳性染色,但血管纹边缘细胞无阳性染色     

EGCG对阿米卡星诱导大鼠螺旋神经元诱导型一氧化氮合酶表达的影响

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯［(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG］对阿米卡星（amikacin,Amk）诱导的大鼠耳蜗螺旋神经元(spiral ganglion neuron;SGN) 诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）表达的影响。方法将30只SD大鼠分为生理盐水对照组、Amk（450?mg/kg·d×14d）损伤组和Amk加EGCG（50?mg/kg·d×14d）保护组。各组动物均经深度麻醉后,半身灌注固定处死,取右侧耳蜗标本固定、脱钙、石蜡轴位包埋、轴位切片,近中轴位切片行iNOS免疫组化染色,光学显微镜下检测耳蜗SGN表达情况,并通过切片图像分析进行半定量处理比较。结果对照组SGN胞浆及细胞核基本上不着色（SGN iNOS染色平均灰度值为111.04±3.15）,损伤组SGN部分神经元胞浆内有棕黄色或黄色颗粒或斑片（SGN iNOS染色平均灰度值为90.32±5.26）,保护组胞浆及细胞核无明显着色（SGN iNOS染色平均灰度值为109.35±4.89）,图像分析结果显示,损伤组与对照组、损伤组与保护组之间的SGN iNOS染色平均灰度值差异有统计学意义。结论iNOS参与Amk耳中毒时耳蜗螺旋神经元的氧化损伤,EGCG可以减弱Amk耳中毒时耳蜗螺旋神经元iNOS的表达,从而减轻Amk耳毒性。     

顺铂对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响

目的探讨耳毒性药物顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞延迟整流钾电流的影响,了解顺铂耳毒性的离子机制。方法选择状态良好培养2—14d的耳蜗螺旋神经节细胞在电压钳制条件下记录的钾电流作为对照组,浴液中分别加入100,500,1000,5000μM不同浓度的顺铂溶液后记录的电流为实验组,观察其对钾通道电流电生理学特性的影响,并观察冲洗后电流的恢复情况。结果实验显示耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性受不同浓度顺铂溶液的影响,并具有浓度依赖性,表现在其活化动力学和电流幅度的改变。本实验中顺铂的50％的电流被抑制时的浓度（IC50）为294μM,冲洗后钾通道电流逐渐恢复。结论顺铂可以改变耳蜗螺旋神经节细胞钾通道电流的电生理学特性,这种变化在短期内可逆,揭示其耳毒性的形成具有一定的离子机制。     

顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶表达的影响

目的：观察顺铂对离体培养小鼠耳蜗毛细胞钙蛋白酶（calpain ）表达的影响,探讨顺铂致耳蜗毛细胞凋亡的机制。方法取出生后3 d的昆明小鼠300只（600耳）,分离出耳蜗基底膜600条,体外培养24 h后,随机分为对照组和4、8、16μg／ml顺铂组,每组150条;对照组加入2ml新鲜培养基,顺铂组分别加入2 ml含不同浓度顺铂（4、8、16μg／ml）的新鲜培养基,再继续培养24 h后,应用Hoechst 33258荧光染色观察耳蜗毛细胞凋亡情况,并应用免疫荧光染色和免疫印迹（Western blot）技术检测calpain 1（μ－calpain）和calpain 2（m －calpain）在耳蜗毛细胞的表达。结果4、8、16μg／m l顺铂组耳蜗毛细胞凋亡率分别为15．63％±0．20％、38．40％±2．64％和64．24％±0．05％,均高于对照组（5．55％±0．12％）,呈现明显的量效关系;不同浓度顺铂组μ－calpain和m －cal‐pain的表达均较对照组明显增强（ P＜0．01）,且m －calpain的表达随顺铂浓度的增高而明显增强（ P＜0．01）。结论顺铂可通过calpain通路诱导小鼠耳蜗毛细胞凋亡,从而发挥毒性效应。     

顺铂致豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3活化的研究

目的：探讨顺铂的耳毒性作用与螺旋神经节细胞（sprial glanglion cell,SGC)凋亡的关系，及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase-3信号转导有关。方法：取40只听力正常的豚鼠，随机分为顺铂1、2、4天组和对照组，每天检测听性脑干反应（ABR）和40Hz相关电位以观察豚鼠高，低频的听阈变化，并用TNEL法检测凋亡细胞数量变化，免疫组化检测SGC中Caspase-3p20活性片段的表达。结果：随着注射顺铂时间的延长，豚鼠听力逐渐下降，同时SGC的TUNEL染色明显增强，Caspase-3p20活性片段的表达增高，与对照组比较均有显著性差异（P＜0．01），结论：顺铂的耳毒性损害机制与SGC的凋亡有关；顺铂所致的SGC凋亡过程中有Caspase-3p20的激活。     

诱导型一氧化氮合酶mRNA在分泌性中耳炎中表达的意义

目的探讨分泌性中耳炎(secretory ototis media，SOM)患者中耳积液及外周血白细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)mRNA表达及在SOM发病过程中的意义，以及与细菌感染和免疫介导的关系。方法随机取45例SOM患者及30例健康人的外周血白细胞，并抽取SOM患者患耳中耳积液，用原位杂交方法检测iNOS—mRNA。结果健康人外周血白细胞未见iNOS—mRNA表达。SOM患者外周血白细胞iNOS—mRNA表达：急性组阳性率为63．64％，镜下阳性细胞率为60．3％；亚急性组阳性率为8．7％，镜下阳性细胞率为72．5％；SOM患者中耳积液iNOS—mRNA表达：急性组阳性率为45．45％，镜下阳性细胞率为80％；亚急性组阳性率为52．17％，镜下阳性细胞率为84％。SOM患者外周血白细胞及中耳积液中iNOS—mRNA表达高度增强，其中在急性组外周血白细胞中表达显著高于亚急性组，而中耳积液iNOS—mRNA表达阳性率及阳性细胞率在急性组与亚急性组中表达强度无显著性差异。结论诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及诱导型一氧化氮合酶——氧化氮(iNOS—NO)通路在SOM的发病、中耳积液的形成过程中可能起着重要作用。     

大鼠耳蜗一氧化氮合酶的分布和表达

目的 本实验先用组织化学法，通过观察还原型辅酶Ⅱ－黄递酶（NADPH－黄递酶）的性了解一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）在大鼠耳蜗内分布。再用亲合免疫细胞组织化学技术，研究大鼠耳蜗内神经元型NOS（neuronal NOS,nNOS）与内皮型NOS（endthelial NOS,eNOS）的表达。方法 组化组大鼠耳蜗切片用辅酶Ⅱ孵育液在37℃条件下孵育1小时。免疫组化组大鼠耳蜗切片经消除内源性过氧化物酶，3％山羊正常血清封闭非正常结合点后，用兔抗nNOS抗体、兔抗eNOS抗体，室温下孵60发钟，再用生物素标记的山羊抗兔第二抗体孵育、滴加ABC试剂，以DAB试剂显色。结果 大鼠耳蜗血管球内皮细胞有明显NADPH－黄递酶活性，血管纹及螺旋神经节细胞也有NADPH－黄递酶活性反应。大鼠耳蜗内、外毛细胞、螺旋神经节细胞nNOS、eNOS的表达呈阳性。血管纹细胞处有阳性nNOS、eNOS的表达。耳蜗血管球的内皮细胞无nNOS的表达，但eNOS的表达呈强阳性。结论 由nNOS及eNOS合成的NO在维持耳蜗正常神经传导及耳蜗毛细血管张力和正常血液供应中起着重要作用。     

黄芪对顺铂耳毒性保护作用的实验研究

目的探讨黄芪是否对顺铂的耳毒性具有保护作用。方法健康SD大鼠40只随机分成4组,每组10只。对照组：生理盐水2ml／d腹腔注射6天;黄芪组：黄芪注射液5g&#183;kg^-1&#183;d。腹腔注射6天;顺铂组：顺铂4mg&#183;kg^-1&#183;d^-1腹腔注射6天;顺铂加黄芪组：腹腔注射黄芪5g&#183;kg^-1&#183;d^-1加顺铂4mg&#183;kg^-1&#183;d^-16天。用药前及用药后第7天行畸变产物耳声发射（DPOAE）检测,然后处死大鼠。每组半数动物冰冻连续切片,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测毛细胞凋亡;半数动物扫描电镜观察毛细胞形态。结果顺铂组用药后DPOAE幅值下降,毛细胞受损,并可观察到凋亡细胞,与对照组及黄芪组比较差异具有显著统计学意义（P〈0．01）。顺铂加黄芪组用药后DPOAE幅值上升,毛细胞受损减轻,凋亡细胞数量减少,与顺铂组比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论黄芪能有效保护耳蜗免受顺铂的耳毒性损伤。     

连翘酯苷对顺铂作用后豚鼠耳蜗c-jun表达的影响

目的：研究连翘酯苷对顺铂作用后豚鼠耳蜗c—jun表达的影响。方法：将30只豚鼠随机分为对照组（10只）,顺铂组（10只）和连翘酯苷组（10只）。腹腔注射顺铂溶液（8mg／kg）,1次／d,连续7d,建立顺铂耳毒性模型;连翘酯苷组在每次注射顺铂溶液30rnin前腹腔注射连翘酯苷25．0mg／kg／d,连续7d;对照组以生理盐水代替顺铂溶液注射,连续7d。实验动物被处死前,检测其DPOAE幅值变化;采用蛋白质印迹杂交（Western Blotting）检测各组豚鼠耳蜗c—jun蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应检测各组豚鼠耳蜗c—jun基因mRNA的表达。结果：顺铂组DPOAE幅值明显低于对照组（P〈0．01）;相比于顺铂组,连翘酯苷组DPOAE幅值明显升高（P〈0．05）。顺铂组豚鼠耳蜗c—jun蛋白与mRNA表达水平均显著高于对照组（P〈0．01）;相比于顺铂组,连翘酯苷组C-jun蛋白与mRNA表达水平明显降低（P〈0．05）。结论：连翘酯苷能够通过降低c—jun的表达防护顺铂所致的耳蜗损伤。     

豚鼠耳蜗一氧化氮合酶的分布

目的 用组织化学法,通过观察NADPH-黄递酶的活性了解一氧化氮合酶在豚鼠耳蜗内分布。方法 经4％多聚甲醛心脏灌注固定后,取出耳蜗,经3％依地酸脱钙后,作厚10μm冰冻切片,用辅酶Ⅱ孵育液在37℃条件下孵育l小时。结果 发现在耳蜗内、外毛细胞底部与耳蜗神经末梢接头处及毛细血管球内皮细胞有明显NADPH-黄递酶活性,此外在内、外柱细胞、支持细胞、血管纹及螺旋神经节细胞也有NADPH-黄递酶活性反应。结论 NO在维持耳蜗正常神经传导及毛细血管张力中起着重要作用。