人纤维环细胞与骨髓间充质干细胞Transwell共培养研究

目的探讨人的纤维环（AF）细胞与骨髓间充质干细胞（BMSCs）在Transwell共培养后,对AF细胞的细胞增殖和细胞外基质合成的影响,以及BMSCs是否具有向AF细胞分化的能力。方法分别对5例年龄在40岁以下脊柱手术患者的纤维环组织和骨髓标本进行分离、培养AF细胞和BMSCS,分别吸取第三代的AF细胞和BMSCs,按1 1的细胞比例分别植于Transwell共培养系统中,下室植入BMSCs,上室植入AF细胞。并且建立3个细胞培养组,即BMSCs与AF细胞共培养组（实验组）,BMSCs单独培养组和AF细胞单独培养组作为对照组。培养3周后,运用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化;分别用HE染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和流式细胞仪对两种细胞鉴定;运用荧光定量PCR法检测各细胞培养组蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达变化。结果两种细胞在分离培养后经过鉴定确定为AF细胞和BMSCs。在倒置相差显微镜观察下,共培养组中AF细胞和BMSCs在细胞增殖数量和速度上均高于各自的单独培养组;共培养组中AF细胞和BMSCs的蛋白聚糖Aggrecan、Ⅰ型胶原蛋白mRNA及Sox9的表达均较各自的单独培养组高（P〈0.05）。结论通过BMSCs与AF细胞Transwell共培养,BMSCs可以促进AF细胞增值和细胞外基质的合成;同时通过共培养,BMSCs具有向AF细胞分化的可能。     

生长因子诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化的研究

目的 建立一种体外分离兔骨髓间充质干细胞（MSCs)的方法，诱导其表达软骨细胞表型。方法 抽取兔骨髓，经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs。用生长因子诱导，观察细胞的增殖情况和软骨特异性基质的表达水平。结果 ①纤维粘连蛋白促进MSCs贴壁，可提高细胞分离率；②TGF－β1，IGF－I和维生素C结合可促进MSCs增殖，表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA和基质蛋白多糖成分。结论 ①密度梯度离心结合粘附分离可提高MSCs的分离效率。②TGF－β，IGF－I和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖，表达软骨细胞表型。     

胎儿骨髓间充质干细胞在体外无支架下向软骨组织分化的探讨

目的　探讨骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)无支架条件下在体外向软骨组织定向分化的条件。方法　取引产胎儿骨髓悬液 ,经Percoll密度梯度离心 ,获取单个核细胞 ,细胞贴壁、扩增后 ,再以高糖DMEM(TGF β15ng/ml)进行成软骨细胞预诱导 ,4～ 7d后获得成纤维样单层贴壁的MSCs。以此MSCs为种子细胞 ,2× 10 6个细胞离心成团 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下 ,体外培养 3wk后形成组织团块。经固定、包埋、切片后行甲苯氨蓝染色 ,免疫组化方法测定特异性Ⅱ型胶原。通过图象分析软件检测组织块蛋白多糖和Ⅱ型胶原表达强度 ,并与胎儿正常软骨比较。结果　胎儿骨髓单个核细胞经过预诱导 ,细胞表达特异性Ⅱ型胶原 ,甲苯氨蓝染色蓝染明显增强 ;再经离心成团、体外诱导培养后形成有光泽软骨样组织块 ,其甲苯氨蓝染色呈蓝染 ,特异性Ⅱ型胶原为阳性表达 ,图象分析表明其蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达强度与胎儿正常软骨相似。结论　胎儿骨髓间充质干细胞经高糖DMEM预诱导后可向软骨细胞分化 ;离心成团后 ,在TGF β1与IGF Ⅰ及其它辅助成分的协同作用下具有形成类软骨组织的能力 ,本实验建立的定向诱导培养系统在无支架条件下可使MSCs向软骨样组织分化。     

软骨细胞与骨髓间充质干细胞隔离共培养构建组织工程化软骨

目的探讨隔离共培养条件下,软骨细胞诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞分化并形成软骨组织的能力。方法分别提取并培养兔BMSCs和耳软骨细胞,以5．0×10^7／ml的终浓度接种于聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架上并置于Transwell室内。实验组Transwell下方为贴壁软骨细胞,对照组Transwell下方为DMEM培养液（含10％胎牛血清）。两组BMSCs-支架复合物体外培养8周后植入裸鼠皮下,继续培养6周后取材。通过大体观察、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测、组织学及免疫组织化学等相关检测对新生组织进行评价。结果体外培养期间,实验组和对照组BMSCs在支架上黏附良好并能分泌细胞外基质,RT-PCR检测示实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖有较强的表达,而对照组两者的表达较低或检测不到。裸鼠皮下培养6周,实验组BMSCs-支架复合物能基本保持原形,组织学染色及免疫组织染色显示新生组织有明显的软骨陷窝形成并表达软骨特异性细胞外基质。对照组BMSCs-支架复合物逐渐皱缩变形,未见形成软骨样组织。结论采用Transwell隔离共培养的方法,软骨细胞能够诱导BMSCs向软骨细胞分化。     

微环境诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮样细胞

目的通过观察人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与成熟内皮细胞非接触共培养表达特异性内皮细胞标志物的情况,探讨微环境依赖性的、体外非接触共培养方法对MSCs向内皮样细胞分化的影响。方法密度梯度离心法分离纯化培养的hMSCs与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在Transwell内共培养,通过流式细胞术检测hMSCs表型,RT—PCR鉴定诱导后hMSCs的CD31、VWF、VE—CadherinmRNA的表达,免疫组化鉴定诱导后hMSCs特异性内皮细胞标志物VCAM1和CD31的表达,透射电镜观察诱导后hMSCs的超微结构。结果细胞培养第2周,开始出现形态学改变,胞体回缩,呈多角形改变。细胞培养第3周,细胞增生速度明显加快,形态学上呈卵圆形或“铺路石”样改变;在基因水平上,RT—PCR显示经典内皮细胞标志物CD31、VWF、VE—cadherin mRNA的高表达;在蛋白水平上,免疫荧光染色CD31、和VCAMl表达阳性;透射电镜下诱导后细胞显示内皮细胞特有的Weibel—Palade小体。结论hMSCs在共培养的微环境中,可以分化成内皮细胞表型,其机制是通过内皮细胞的旁分泌作用,而不需要hMSCs与内皮细胞的直接接触。转化的内皮细胞在形态上、基因、蛋白表达、超微结构等方面均显示了内皮细胞的特征。     

骨髓间充质干细胞向软骨分化的研究进展

在胚胎发育过程中,中胚层细胞可分化成为脂肪、软骨和髓基质等多种间充质组织,这些中胚层前体细胞具有干细胞特性,分化能力极强。而骨髓间充质干细胞是骨髓中的非造血干细胞,在不同的条件下能被诱导分化为软骨细胞、脂肪细胞等[1,2]。软骨细胞属于终末分化细胞,其增生能力极弱,破坏后难以再生。因此软骨创伤后的修复是医学上的     

骨髓间充质干细胞对INS-1细胞凋亡的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对过氧化氢(H2O2)诱导胰岛β细胞凋亡的影响。方法以H2O2作用于大鼠胰岛瘤细胞INS-1细胞构建凋亡模型,通过Transwell装置实现INS-1细胞与BMSCs共培养。实验分为4组:单独INS-1细胞培养组(A组);INS-1+H2O2处理组(B组);BMSC+INS-1Transwell共培养组(C组);BMSC+INS-1+H2O2Transwell共培养组(D组)。MTT法检测细胞存活率,Annexin-V/PI染色流式细胞技术检测细胞凋亡水平。结果 H2O2显著降低INS-1细胞存活率,引起INS-1细胞凋亡,且呈剂量依赖性,通过Tran-swell与BMSCs共培养后,由H2O2诱导的INS-1凋亡细胞比例下降,与单独H2O2刺激组相比,细胞凋亡率下降了约26.3%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BMSCs通过Transwell共培养显著抑制H2O2诱导的INS-1细胞凋亡,其作用机制可能与BMSCs旁分泌作用有关,为进一步利用BMSCs防治糖尿病提供了理论依据。     

兔骨髓间充质干细胞体外软骨向诱导的实验研究

目的:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞(MSCs),并定向诱导其向软骨细胞表型分化。方法:抽取兔股骨骨髓,经密度梯度离心与贴壁培养分离得到MSCs。用含有TGF-β、b-FGF、胰岛素、维生素C、转铁蛋白等的DMEM/Ham′s-F12培养基进行软骨向诱导。通过形态学观察,阿辛蓝-PAS特染及Ⅱ型胶原免疫组化染色,鉴定经过诱导后细胞的软骨细胞的表型。结果:兔MSCs原代细胞呈梭形,克隆样生长,经过诱导培养7d后,细胞形态由梭形、多角形变为椭圆形,胞浆丰富,细胞核和核仁清晰可见。阿辛蓝-PAS和Ⅱ型胶原染色阳性。结论:密度梯度离心与贴壁培养两种方法相结合可获得相对高纯度的MSCs,该细胞经诱导后可向软骨细胞分化。     

维甲酸和甲状腺激素在骨髓间充质干细胞软骨分化中的作用

目的 探讨甲状腺素(thyroxine, T3)和维甲酸(retinoic acid, RA)对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)软骨形成的影响。方法 在3种条件培养基中培养和诱导猪BMSCs成软骨分化：对照组使用软骨生成培养基(含10^-7 mol/L地塞米松和10 ng/mL转化生长因子β1),RA组采用软骨生成培养基加1μmol/L RA,T3组采用软骨生成培养基加100 nmol/L T3。采用MTT法单层检测BMSCs的增殖情况。收获第3代BMSCs,离心形成细胞颗粒,分为3组分别进行软骨细胞诱导。4周后采集3组的细胞颗粒,通过组织学染色和半定量基因表达分析进行软骨形成评估。结果 T3组BMSCs增殖高于对照组(P<0.05);RA组BMSCs增殖低于对照组(P<0.05);对照组BMSCs颗粒中观察到软骨特征的类腔隙结构和甲苯胺蓝阳性染色,RA组未见;RA组软骨发生标志基因ColⅡ、蛋白聚糖(aggrecan)和Sox9的表达与对照组相比显著降低,而肥大标志基因ColX的表达...     

骨髓间充质干细胞对体外损伤心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在体外共培养条件下对多柔比星(doxorubicin, DOX)损伤心肌细胞凋亡的影响及可能机制.方法:贴壁法分离、培养骨髓间充质干细胞,第3代MSCs用于实验.原代培养3天的SD乳鼠心肌细胞,1.0 mg/L浓度的DOX处理4 h,建立心肌细胞损伤模型.将心肌细胞分为正常对照组、DOX损伤组、DOX损伤+MSCs共培养组.ELISA法检测细胞条件培养基内胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)的浓度.MTT检测MSCs条件培养基对DOX损伤心肌细胞活性的影响.并检测各组心肌细胞caspase-9,caspase-3活性及各组心肌细胞凋亡率.结果:第3代MSCs及原代心肌细胞均有IGF-1分泌,但MSCs条件培养基内IGF-1的浓度明显高于心肌细胞.MSCs共培养组心肌细胞活性高于DOX损伤组,但低于正常对照组(P<0.05).DOX损伤+MSCs共培养组caspase-9,caspase-3活性及心肌细胞凋亡率低于DOX损伤组,但高于正常对照组(P<0.05).结论:MSCs对多柔比星诱导的心肌细胞凋亡有保护作用,这种保护作用与旁分泌机制有关.     

骨髓间质干细胞体外增殖及诱导分化成肌样细胞实验研究

目的比较SD大鼠、Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠骨髓间质干细胞在体外的增殖及在体外将骨髓间质干细胞诱导分化成肌样细胞的情况。方法体外分离成年SD大鼠、Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠的骨髓干细胞,培养增殖,用5-氮杂胞苷诱导分化,使其向肌细胞定向分化。结果SD大鼠和Wistar大鼠的原代骨髓间质干细胞约10 d可达90%以上融合,平均3 d左右传代,C57BL/6J小鼠的骨髓间质干细胞在1周内可迅速增殖,1周后基本处于停滞状态,且细胞集落很少,难传代。SD大鼠的骨髓间质干细胞在含5-氮杂胞苷、两性霉素B和5%马血清的分化培养基作用下,可以分化为肌肉特异性抗原desmin和-αsarcomeric actin染色阳性反应的肌样细胞。结论不同种系的骨髓干细胞在体外用相同的培养基培养,可以具有截然不同的增殖能力;5-氮杂胞苷可以促使骨髓干细胞定向分化为肌样细胞。     

低氧对人骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的 探讨二氯化钴(CoCl2)诱导的化学性低氧对人骨髓间充质干细胞(hBMSC)增殖的影响.方法 采用密度梯度离心法分离、培养hBMSC;用流式细胞仪检测其表面标志物;用CoCl2建立化学性缺氧模型,分别采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪检测hBMSC在不同CoCl2浓度(0、100、150、300 μmol/L)和不同时间(0,12 h及1、2、4、6、7 d)的增殖情况,0 μmol/L CoCl2组为常氧组,后3个浓度组为低氧组.结果 化学缺氧12 h内,hBMSC增殖被抑制;1、2、4 d时各低氧组细胞增殖均高于常氧组,但300 μmol/L CoCl2组与常氧组比差异无统计学意义(P＞0.05);而100μmol/L CoCl2组(0.139±0.003、0.178±0.005、0.224±0.005)和150 μmol/L CoCl2组(0.202±0.020、0.224±0.019、0.263±0.004)增殖明显高于常氧组(0.134±0.005、0.167±0.004、0.206±0.005),其中150μmol/L CoCl2组1 d时增殖最显著(均P＜0.05).6 d时100、150 μmol/LCoCl2组细胞增殖(0.258±0.020、0.264±0.008)仍高于常氧组(0.248±0.004),但优势逐渐减弱(P＜0.05).7 d时这种低氧促增殖的效应消失.结论 CoCl2诱导的化学性缺氧可以促进hBMSC增殖.     

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入10-6mol/L淫羊藿苷培养基,对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面标志,碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性,组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果:体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成,而对照组未见钙化结节形成。结论:淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,可视为一种良好的骨诱导活性因子。     

Effect of Electromagnetic Fields on Proliferation and Differentiation of Cultured Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Previous clinical observations and animal ex periments showed that EMFs could stimulate newbone formation of the fractures and increase thebone mineral density[1], but the manner in whichEMFs influence the behavior of bone remains poor ly understood. Recent studies[2] found that signaltransduction system plays an important role in thebiological effect of EMFs. Intracellular cAMP wasan important second messenger in signal transduc tion pathway. The cellular proliferation …     

骨髓间充质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化

骨髓由非贴壁的造血细胞和贴壁的基质细胞部分组成.这些贴壁的基质细胞部分包括多能间充质干细胞和分化的骨髓间充质基质细胞.间充质干细胞(mesenchymal stemce lls,MSCs)系统依靠增殖来自我更新,但是能够保持其干细胞的表型而引起成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、成纤维细胞的分化[1].     

兔骨髓间充质干细胞向神经元的诱导分化

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (bonemarrowmesenchymalstemcells ,BM -MSCs)向神经元定向诱导分化及分化前后体外培养的条件。方法 :无菌条件下收集兔股骨骨髓 ,用相对密度为 1 0 77的淋巴细胞分离液分离出白膜层细胞群 ,贴壁法筛检其中的MSCs ,用DMEM H条件培养基进行原代及传代培养。分别取 5和 10代的MSCs向神经元定向诱导。诱导后更换为神经培养基继续培养 ,并在 1～ 2 0d用免疫细胞化学方法检测分化细胞的特异性表面标志。结果 :兔骨髓MSCs在DMEM H条件培养基中建立高纯度的细胞培养 ,能够稳定地连续传代达 10代以上。不同代数的MSCs诱导后均表达巢蛋白 (nestin)和神经特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE)。诱导后NSCs在神经培养基中继续存活 2 0d以上 ,但未见扩增。结论 :兔骨髓MSCs能够诱导表达神经元特异性标志 ,且诱导前后的MSCs均可在体外培养条件下存活。     

低氧增强骨髓间充质干细胞增殖维持分化潜能

目的观察低氧增强人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外增殖并维持其多向分化潜能的作用。方法分离10例骨髓血标本BMMSCs,分别进行低氧(低氧组)及常氧(常氧组)培养,观察BMMSCs的形态、增殖能力及成骨、成脂分化能力。结果低氧组BMMSCs保持其长梭形,鱼群样分布,增长状态良好,常氧组BMMSCs形态呈多角形或扁平状,低氧组BMMSCs数量及生长速率较常氧组增加(P0.05),且低氧组BMMSCs具有成骨、成脂分化能力。结论低氧能促进BMMSCs的体外增殖且维持其多向分化潜能。     

姜黄素促进大鼠骨髓间充质干细胞的体外增殖及成骨分化

目的：研究姜黄素对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cell,rBMSC）生物学行为的影响。方法：将含不同浓度梯度姜黄素溶液的完全培养基与rBMSC共培养,通过CCK?8法检测细胞增殖情况,确定姜黄素溶液的最适浓度;将rBMSC与4 μg/mL姜黄素共孵育,0 μg/mL姜黄素处理组作为对照,通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和活性检测评估其早期成骨分化水平;使用茜素红染色评估成骨分化晚期细胞外基质矿化情况;利用实时荧光定量逆转录PCR检测细胞成骨诱导7、14 d时成骨指标骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein?2,Bmp2）、核心结合因子α1（core binding factor alphal α1,Runx2）、骨钙素（osteocalcin,Ocn）、骨桥蛋白（osteopontin,Opn）、成骨细胞特异基因（osterix,Osx）的表达。结果：CCK?8结果显示含不同浓度姜黄素溶液的培养基中的rBMSC均能持续增殖,4 μg/mL姜黄素组对rBMSC增殖的促进作用最为显著（与对照组相比,P < 0.001）;ALP活性检测及染色结果显示姜黄素组细胞的ALP活性高于对照组（P < 0.001）;茜素红染色结果显示姜黄素组的细胞外基质矿化水平高于对照组;实时荧光定量逆转录PCR结果显示姜黄素组细胞的相关成骨基因Bmp2、Runx2、Ocn、Opn、Osx的表达均高于对照组（P < 0.05）。结论：姜黄素能够促进rBMSC的体外增殖及成骨分化。     

支架荷载的骨髓间充质干细胞的分化实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架上向表皮干细胞分化的可行性。方法体外诱导改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠骨髓间充质干细胞向表皮干细胞分化,免疫组织化学法检测表皮干细胞标志物CK19和整合素β1的表达。结果诱导液作用2周后,免疫组织化学法检测到改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs中大量阳性双表达CK19和整合素β1。结论改性聚乳酸-Ⅰ型胶原复合支架荷载的大鼠BMSCs仍具有向表皮干细胞分化的潜能,此支架具备作为组织工程皮肤支架材料的条件。     

地塞米松对兔骨髓间充质干细胞存活增殖成骨的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)的持续生存能力及地塞米松对其存活、增殖、成骨分化能力的影响。方法:提取兔BMSCs,予不同浓度(0、10-9、10-8、10-7、和10-6mol/L)地塞米松,分别于1、3、5、7 d时观察地塞米松对BMSCs增殖的影响,作用1～4周后检测碱性磷酸酶水平;分别饥饿0～7 d,复苏1、3和7 d后,观察BMSCs的持续生存能力。结果:培养1 d地塞米松10-6mol/L组测得的OD值结果最高,而对照组结果最低,培养3、5、7 d时,地塞米松10-9mol/L组测得的OD值最高;同时,在2～4周10-9mol/L组增加碱性磷酸酶活性最明显;复苏1和3 d,对照组与饥饿1～7 d之间差异有统计学意义(均P<0.05),复苏7 d,各组两两之间差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:BMSCs具有较强的持续生存能力,地塞米松对BMSCs有增加存活、促进增殖、成骨分化的作用。