灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质的研究

目的 探讨灌注法制备大鼠全肾脏脱细胞基质(ACM)支架的可行性.方法 取12周龄的Wistar大鼠的肾脏,保留输尿管、肾静脉及肾动脉,沿肾动脉插入留置针建立灌注通道.灌注压强为100 cmH2O,依次灌注肝素化PBS溶液,1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液,去离子水,1%TdtonX-100溶液以及含青链霉素的PBS溶液.经脱细胞处理后,采用HE染色法光镜观察及扫描电镜观察支架微观结构,DAPI染色法荧光显微镜观察残留细胞核成分.结果 所有经SDS及TritonX-100联合处理后的脱细胞基质支架在HE染色光镜观察下未发现细胞残留,扫描电镜观察仪见基膜及胶原蛋白等细胞外基质形成网状结构而无细胞,DAPI染色荧光显微镜观察未见DAPI与细胞核结合后所发出的强荧光.结论 灌注法用于制备大鼠全肾脏脱细胞基质支架,简便可靠,该支架无细胞成分残留,是一种理想的细胞支架.     

脱细胞鼠肾生物支架的制备及其体内相容性

目的：制备一种抗原封闭完全,蛋白成分保留完好,生物性能较好的鼠肾脱细胞基质支架,并对其体内生物相容性进行分析。方法：取健康SD大鼠,采用腹主动脉在体灌注去污剂的方法制备全肾脱细胞基质支架,对处理后的支架材料进行形态结构观察,主要成分分析;将其支架进行皮下包埋检测体内细胞相容性。结果：经脱细胞处理后,肾支架形态上具有三维立体空间结构,肉眼可见其内血管脉络;DNA残留量不及正常组3%;HE、透射电镜（TEM）、PAS等观察细胞成分已完全去除,细胞外基质网络结构保留完整;免疫荧光显示细胞外基质成分Ⅳ型胶原（collagen Ⅳ）、层黏连蛋白（laminin）及纤维黏连蛋白（fibronectin） 均呈强阳性表达,未见明显细胞核成分残留;皮下植入结果显示,初期炎症反应明显,随着时间推移,炎症减轻,支架内逐渐有血管长入,基质逐渐降解。结论：经去污剂灌注处理的脱细胞肾基质,可有效清除肾内所有细胞成分,较好地保留细胞外基质支架且形态完好,具有良好的组织相容性。     

人肝组织脱细胞支架的制备

目的探究人肝组织脱细胞支架的制备。方法本研究利用手术切除的人肝血管瘤左外叶组织,经反复冻融,0.01% SDS、
0.1% SDS和1% Triton X-100循环灌注制备人肝组织脱细胞支架,并通过灌注过氧乙酸消毒。将L-02细胞通过门静脉插管种
植于脱细胞支架内进行培养。结果HE、DAPI染色和扫描电镜结果显示脱细胞支架内无细胞成分残留,残余DNA检测为
25.3±14.6 ng/mg干质量,小于新鲜肝脏DNA含量的1%。免疫组化证实支架内保留了Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、弹力蛋白
成分。L-02细胞在支架上生长良好且有增殖,并表达白蛋白及葡萄糖-6-磷酸酶。结论利用手术切除的人肝标本行肝组织脱
细胞支架的制备是可行的,且为构建更适用于临床的组织工程肝脏提供了新思路。
     

选择适宜的灌注去细胞方法应用于全肝脏去细胞支架的制备

目的：对比低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）和1％ Triton X-100对制备大鼠肝脏去细胞支架（DLBS）的影响,建立一种简单且适宜的DLBS的制备方法。方法将低浓度SDS（0．25％、0．50％）和1％ Triton X-100分别加入大鼠肝脏去细胞流程,通过免疫荧光及扫描电子显微镜观察支架结构,并对支架内成分进行定量分析,再通过四氮唑盐比色法（MTT ,Assay）观察支架对C3A的细胞毒性。结果 0．25％ SDS和0．50％ SDS处理组的DNA定量均小于50 ng／mg干质量,并且糖胺聚糖在0．25％SDS和1％ T riton X-100处理组的定量要高于0．50％ SDS处理组。同时,M T T 实验表明3种方法处理后的去细胞支架对于C3A细胞的生长无毒性作用。结论应用0．25％ SDS在5 mL／min灌注流速下去细胞能够制备更为理想且有效的DLBS ,从而为器官再生打下基础。     

大鼠子宫去细胞化支架的制备和评价

目的：通过去细胞化灌注技术,探讨成功制备天然子宫去细胞化生物支架的理想灌注策略,并通过系统的评价体系,以鉴定其能否作为子宫组织再生工程研究的良好应用载体。方法：选择健康成年雌性SD大鼠,采用子宫动脉入路途径,通过冻融、酶解及曲亚通（TritonX-100）联合十二烷基硫酸钠（SDS）的洗脱灌注等流程,获取子宫去细胞化支架。并通过大体形态观察、美兰染色、HE染色观察、基因组DNA定量分析、EGF、bFGF、TGF-β含量测定、电镜观察、胶原蛋白总量检测及主要胶原成分鉴定等对去细胞化后的子宫支架进行全面的评价。结果：成功建立动脉灌注入路并获得了肉眼透明的子宫去细胞化支架,HE染色和透射电镜观察均表明去细胞化子宫支架内无细胞残留,DNA含量检测表明支架内DNA残留量为（45.6±7.3）ng/mg,不足正常子宫的5%（P＜0.01）,美兰染色和扫描电镜显示子宫支架的脉管网络和空间结构保存完整;而胶原蛋白含量由新鲜子宫组织的（0.57±0.12）μg/mg增加到去细胞化子宫支架的（0.88±0.10）μg/mg,差异有统计学意义（P＜0.05）,结合各型胶原的免疫组织化学定性分析,说明去细胞化后子宫支架的细胞外基质成分保留得较为完整;ELISA结果显示去细胞化子宫支架中细胞因子EGF、bFGF和TGF-β分别保留了66%、85%和54%,表明其仍具备一定的生物活性。结论：本研究方法能够成功制备理想的去细胞化子宫支架,并且支架的基质成分和理化特性完整保留,能够作为子宫组织工程研究的良好载体。     

具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架的制备

目的制备具有良好细胞相容性的脱细胞血管支架材料，为构建组织工程血管奠定基础。方法用含有脱氧胆酸钠、SDS、EDTA的低渗液和等渗液以及核酸酶对猪的胸主动脉进行脱细胞处理．使用HE、Movat五色法、DAPI染色及电镜观察处理结果。以MTT法分析脱细胞溶液的细胞毒性，通过种植内皮和平滑肌细胞，分析支架的细胞相容性。结果上述方法使用的脱细胞溶液细胞毒性低；经该法处理后，血管的细胞成分完全去除，胶原纤维、弹性纤维、糖蛋白等主要基质成分充分保留，组织结构完整，内皮细胞和平滑肌细胞可以在上面黏附生长，形成完整的细胞层。结论利用脱氧胆酸钠、SDS、EDTA和核酸酶联合消化的方法．可制备出基质成分充分保留、细胞相容性优良的脱细胞血管支架．适于构建组织工程血管。     

适用于犬输尿管脱细胞基质制备的灌注系统

目的探讨应用灌注系统制备输尿管脱细胞基质的可行性方案。方法利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制 备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3 个不同的灌注组,单纯SDS 组、单纯TritonX-100 组以及联合组 （TritonX-100+SDS）。利用HE染色,DAPI染色,DNA定量,琼脂糖凝胶电泳评价输尿管脱细胞基质中细胞核的残留情况。采 用Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定、GAG含量测定、扫描电镜和毒性检测等手段评价制备输尿管脱细胞基质 的三维结构和生物活性成分。结果HE染色和DAPI染色显示联合组制备的输尿管脱细胞基质中没有明显的核物质残留, DNA定量和凝胶电泳证实了这一结果。Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定和GAG含量测定显示联合组保留 了输尿管脱细胞基质三维胶原结构和生物活性成分。扫描电镜观察联合组制备的输尿管脱细胞基质表面存在大量的孔隙结 构。毒性测定证实联合组制备的输尿管脱细胞基质无毒性。结论本研究灌注系统可用于输尿管脱细胞基质的制备,筛选出一 套比较理想的脱细胞方案,制备的输尿管脱细胞基质可用于输尿管组织工程再造。     

淋巴结脱细胞支架的构建及效果评价

目的 对小鼠淋巴结脱细胞和卵巢脱细胞支架进行比较,为人工卵巢的制作提供组织工程材料。方法使用表面活性剂(0.5%SDS)振荡清洗方法脱细胞,再用去离子水(ddH₂O)清洗其内残留SDS,获得脱细胞支架。HE染色观察脱细胞的形态,DAPI染色观察细胞的残留情况,Masson染色观察胶原纤维,阿尔新蓝染色(Alician Blue)观察糖胺聚糖,透射电镜观察支架超微结构,并测定DNA和羟脯氨酸含量。结果 与新鲜淋巴结及卵巢相比,脱细胞后大体观察组织体积稍缩小,颜色变淡,呈毛玻璃状。HE染色未见明显细胞残留,可见交织成网的纤维结构。Masson染色显示淋巴结和卵巢脱细胞支架胶原纤维形态保留完整。Alcian Blue染色显示卵巢脱细胞支架中蓝色条带较细,淋巴结脱细胞支架中有稍粗不定形基质样结构。DAPI染色未见明显细胞核。扫描电子显微镜见密集分布的大量纤维以及与纤维相连的较小的片状细胞外基质成分,相互连接成3D网架结构。DNA定量分析得出淋巴结及卵巢脱细胞支架仅残留7.45%及11.96%(P<0.05),卵巢脱细胞后羟脯氨酸含量减少(P<0.05)。结论 ...     

去细胞化技术在全肝生物支架建立中的应用

目的 通过去细胞化技术建立保留细胞外基质的完整肝脏支架,并对支架进行形态结构和保留成分鉴定.方法 通过门静脉插管,依次灌注去垢剂曲拉通X-100(Triton X-100),十二烷基硫酸钠(SDS),并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱残留去垢剂,对所得支架进行HE染色、门静脉及月日道铸型、扫描电镜、纤维成分染色鉴定等形态学观察.并将支架切成50 μm的厚度后与C3A细胞系共培养,进行生物相容性验证.结果 经本实验方案得到肝脏生物支架的成功率为75%.肝脏生物支架包膜完整,肉眼可见肝脏内Gllisson管道结构.HE染色示无细胞及胞核残存.管道铸型见胆道、门静脉完整,无铸型液溢出.扫描电镜示大量纤维网状结构存在.纤维成分染色见大量胶原纤维、弹力纤维存在.生物相容性实验初步显示该支架具备较好的生物相容性,可以作为生物支架材料应用.结论 经本实验去细胞化过程,肝组织细胞可从细胞外基质中完全洗脱下来,并保留比较完整的肝脏管道系统.本研究获得全肝生物支架可以作为肝脏器官培养的基础支架.     

脱细胞神经基质的制备及成分分析

目的:制备脱细胞神经基质,通过测定细胞核和DNA残留评价脱细胞程度,并对所制备的脱细胞神经基质进行成分分析,为开发新型神经修复生物材料提供研究基础。方法:1依次采用0.5%胰蛋白酶-3%曲拉通X-100-0.1%SDS-PBS溶液-水振荡漂洗的方法对异种动物的外周神经进行脱细胞处理。2冰冻切片并经苏木素-伊红染色观察细胞核残留。3微量样品DNA提取试剂盒提取脱细胞神经基质的DNA,超微量蛋白核酸分析仪检测其残留DNA含量。4免疫组织化学法分析脱细胞神经基质成分。结果:经脱细胞处理制备的神经基质呈乳白色;脱细胞神经基质经冰冻切片和苏木素-伊红染色后观察,未见有完整细胞核残留;脱细胞神经基质的DNA残留为6.6ng/mg;经免疫组织化学染色分析,脱细胞神经基质的主要成分为Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和层粘连蛋白。结论:采用本法制备的脱细胞神经基质,有效去除了神经组织中的细胞成分,保留了神经组织细胞外基质的主要成分,可以作为神经修复的新型生物材料。