缺氧条件下大鼠脑微血管内皮细胞对共培养的人间充质干细胞分化的影响

目的 探讨缺氧条件下大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endotheiial cells,BMECs)对人间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化的影响.方法 分离、培养并鉴定人骨髓MSCs和大鼠BMECs,在正常和缺氧两种条件下,分别以间接和直接共培养两种方式对MSCs进行诱导分化,用流式细胞术和免疫荧光细胞化学法观察和分析诱导后MSCs的胎肝激酶-1(fetal liver kinase-1,Flk-1)和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)的表达.结果 正常间接共培养未能诱导MSCs表达vWF和Flk-1蛋白,缺氧间接共培养和正常条件下的直接共培养均能诱导MSCs开始表达Flk-1蛋白,而vWF染色仍为阴性,缺氧条件下直接共培养表达Flk-1蛋白的MSCs比正常条件增多,而且部分Flk-1阳性细胞开始同时表达vWF蛋白.结论 BMECs能够通过细胞直接接触诱导共培养的MSCs开始向内皮分化,缺氧条件下的直接共培养BMECs能诱导更多的MSCs更彻底地向内皮分化.     

微血管内皮细胞对小鼠造血干细胞增殖的影响

目的 探索微血管内皮细胞(MECs)对造血干细胞(HSCs)增殖的影响,以建立一种促进HSCs增殖的方法.方法 选取C57BL/6小鼠和C57系GFP小鼠,处死获取肺叶组织.(1)MECs的分离、培养和鉴定:肺组织经Ⅰ型胶原酶消化获得的细胞在含20％胎牛血清(FBS)、2 ng/mL血管内皮生长因子(VEGF)、100U/mL肝素、0.1 mg/mL青霉素及链霉素的DMEM-F12培养基培养,第8天进行CD31荧光鉴定,“铺路石”细胞用于共培养并以流式细胞仪(FCM)检测八因子相关抗原(vWF)、CD31、CD34、CD45表达率.(2)GFP小鼠HSCs的分离、鉴定:密度梯度离心法和MACs-CD117+磁珠法分选HSCs,FCM检测纯度及CD117 CD34共表达率.(3)MECs促HSCs增殖:设立对照组(HSCs)、共培养组(MECs+ HSCs),培养7d,观察HSCs生长情况并计数、计算扩增倍数;第7天,收集共培养组HSCs,FCM检测CD117 CD34共表达率.结果 (1)肺MECs:第3天形成细胞簇,第6天成“血管样”改变,第14天为“铺路石”外观.培养第8天CD31阳性率为54.5％.vWF、CD31、CD34、CD45阳性率分别为81.39％、45.80％、57.48％、0.17％.(2)平均每只小鼠骨髓经MACs分选后可获约4.7×105个CD117+细胞,纯度为99.51％.(3)随着培养时间的延长,两组HSCs计数均有所增加,但共培养组HSCs扩增倍数大于对照组(P＜0.05).第1～7天共培养组与对照组细胞数相对变化倍数分别为1.21、1.35、1.50、1.72、1.71、1.75和1.78(P＜0.05),第4天变化最明显.共培养7d后HSCs的CD117 CD34共表达率为92.06％.结论 MECs对HSCs增殖有促进作用,共培养第4天促进作用最明显,并且MECs可以促进HSCs CD34的表达.     

氧自由基对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 研究氧自由基诱导豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡及其可能机制.方法 以黄嘌呤氧化酶作用于黄嘌呤而产生氧自由基.不同浓度氧自由基作用于豚鼠耳蜗微血管内皮细胞,用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl-2蛋白表达;用RT-PCR方法检测Bax及Bcl-2 mRNA的表达.结果 氧自由基作用后,与空白对照组相比,各个浓度的氧自由基作用组豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡率均明显升高(均P<0.01),同时,BaxmRNA及蛋白的表达均显著增强(P<0.05或P<0.01),Bcl-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(均P<0.01).结论 氧自由基可诱导豚鼠耳蜗微血管内皮细胞发生凋亡,其发生机制与其调节Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白的表达有关.     

Transwell小室共培养条件下缺氧时视网膜色素上皮细胞对内皮细胞增殖的影响

目的 研究在Transwell小室共培养系统中,缺氧时视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)对血管内皮细胞增殖的影响.方法 培养并鉴定RPE细胞和人脐静脉血管内皮细胞,利用200 μmol/LCoC12造成细胞缺氧、Transwell小室建立细胞共培养模型.实验分为4组:对照...     

模拟失重对肺微血管内皮细胞凋亡的影响

目的：观察回转模拟失重对肺微血管内皮细胞凋亡的影响。方法：组织块贴壁法原代培养肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cells,PMVEC）,采用回转器模拟失重效应。PMVEC回转培养48h,同时设1g对照静置培养。采用Hoechst33258染色,荧光显微镜观细胞凋亡的形态学改变;采用Annexin V—FITC试剂盒对细胞染色,以流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果：回转模拟失重48h后,Hoeehst33258染色结果发现细胞凋亡明显增加;流式细胞仪定量结果表明回转48hPMVEC的凋亡率为19．85％,显著高于同步对照组PMVEC的凋亡率13．72％（19．85％±1．29％vs13．72％±1．15％,P〈0．01）。结论：48h回转模拟失重可明显诱导PMVEC发生凋亡。     

无血清培养对小鼠脑微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的　研究无血清培养诱导小鼠脑微血管内皮细胞凋亡及其可能机制。方法　培养用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd .3。用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl- 2蛋白表达;用WesternBlot检测caspase 3蛋白表达。结果　bEnd .3细胞经无血清饥饿体外培养12 ,2 4 ,36h后细胞凋亡率明显增加,分别为(13.79±0 .99) % ,(17.80±1.39) % ,(2 0 .5 1±0 .5 5 ) % ,与各自正常血清培养的对照组凋亡率相比,P <0 .0 1。Bax表达明显增强,Bcl -2表达明显减弱,caspase 3明显增强。结论　无血清饥饿培养可诱导bEnd .3细胞发生凋亡,其发生机制与Bax/Bcl 2的变化及caspase 3的激活有关。     

正常和缺氧条件下磁场对人脑微血管内皮细胞增殖的影响

[目的] 观察不同强度的永磁磁场对正常和缺氧条件下人脑微血管内皮细胞（HBMEC）增殖的影响。[方法] 采用正常和缺氧两种条件体外培养HBMEC,实验分为10组,即对照组、药物组（银杏叶注射液350 mg/L）、不同强度磁场组（3.4、5.6、13.8、27.8、52.6、107.0、178.9、292.2 mT）,各组细胞于磁场作用48 h后收集样本,用四甲基偶氮唑盐法（MTT法）检测细胞增殖。[结果] 正常和缺氧条件下,与对照组相比较,药物组有统计学意义（P<0.05）,各磁场组差异均无统计学意义（P>0.05）;磁场组组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）.[结论] 正常和缺氧条件下,磁感强度3.4、5.6、13.8、27.8、52.6、107.0、178.9、292.2 mT的磁场对人脑微血管内皮细胞的增殖无影响。     

孕激素对成骨细胞增殖和凋亡的影响

绝经后骨质疏松症（osteoporosis，OP）采用孕激素替代治疗可促进骨形成，减少骨丢失，其机制尚未完全阐明。研究发现，成骨细胞的增殖和凋亡在骨重建过程中起重要作用。我们观察了孕酮（progesterone，P）对人成骨细胞（human osteoblast cells，hOB）增殖和凋亡的影响，旨在探讨孕激素治疗绝经后OP的作用机制。     

大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型的建立

[目的]建立大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型。[方法]采用原代培养脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养方法建立血脑屏障体外模型。[结果]星形胶质细胞与脑微血管内皮细胞共培养可提高血脑屏障特异性酶——γ-谷胺酰胺转肽酶、碱性磷酸酶的表达,提高脑微血管内皮细胞跨细胞间电阻。[结论]成功建立脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养血脑屏障体外模型,而且较单层内皮细胞模型更接近在体状态。     

软脂酸诱导胰岛微血管内皮细胞凋亡的研究

[摘要] 目的 观察软脂酸对胰岛内皮MS-1细胞株增殖率的影响,不同浓度软脂酸作用于MS-1细胞,观察不同时间细胞发生凋亡的情况,以研究游离脂肪酸对胰岛内皮细胞的作用,探讨微血管病变发生的可能机制。方法 体外培养胰岛内皮MS-1细胞株,设置对照组和试验组,分别用含0.1%BSA的DMEM培养液和含不同浓度软脂酸和0.1%BSA的DMEM培养液处理,1）MS-1细胞用不同培养液培养24小时,MTT法检测各组细胞增殖率;2）将软脂酸处理的MS-1细胞用Annecin V- FITC/PI双染色后荧光显微镜下观察细胞凋亡;3）各组细胞用不同浓度软脂酸作用12小时、24小时,Annexin V- FITC/PI双染色后,上流式细胞仪检测细胞凋亡率。数据行统计学分析。 结果 24小时培养后,与对照组细胞增殖率（1.000±0.202）相比,培养液软脂酸浓度升高MS-1细胞增殖率随之显著降低（0.5mM组0.763±0.154,P<0.01; 1.0mM组 0.433±0.142,P<0.01）;软脂酸作用于MS-1细胞后荧光显微镜下可见散落分布的表面显示绿色荧光的早期凋亡细胞,以及表面显示绿色荧光、胞核显示红色荧光的晚期凋亡细胞和坏死细胞;流式细胞仪分析显示,与对照组凋亡率（6.27%±2.12%）比较, 0.5mM、1.0mM软脂酸作用适当时间均可显著升高MS-1细胞凋亡率（1.0mM*12h组13.72%±1.60%, P<0.01; 0.5mM*24h组17.18%±1.48%,P<0.01;1.0mM*24h组27.08%±2.16%, P<0.01）。结论 高水平软脂酸可显著降低胰岛内皮细胞增殖率,并促进细胞发生凋亡,其凋亡率随着软脂酸浓度和作用时间而升高。     

补阳还五汤含药血清对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响

目的观察不同浓度补阳还五汤(BYHWD)含药血清对人脑微血管内皮细胞(HBMECs)增殖和迁移影响。方法补阳还五汤灌胃SD大鼠后腹主动脉取血,制备含药血清;体外培养人脑微血管内皮细胞(HBMECs),随机分为空白组(正常大鼠血清)及补阳还五汤含药血清组,血清浓度分为5%、10%和20%3个浓度,共6组;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测HBMECs增殖;细胞划痕法检测HBMECs迁移的相对距离。结果与空白组比较,5%、10%和20%含药血清均显著促进HBMECs增殖,差异有统计学意义(0.71±0.03比0.65±0.03、0.84±0.05比0.75±0.03、0.71±0.05比0.67±0.05,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞增殖显著减少,差异有统计学意义(0.71±0.03、0.71±0.05比0.84±0.05,P0.05)。与空白组比较,各含药血清组细胞迁移的相对距离均显著增加,差异有统计学意义(0.58±0.03比0.50±0.01、0.63±0.03比0.45±0.05、0.53±0.05比0.45±0.04,P0.05);与10%含药血清组比较,5%含药血清组和20%含药血清组细胞迁移的相对距离显著减小,差异有统计学意义(0.58±0.03、0.53±0.05比0.63±0.03,P0.05)。结论补阳还五汤含药血清可促进HBMECs增殖和迁移,10%含药血清作用最佳。     

重组Shh因子对海水浸泡肺微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响研究

目的 观察不同剂量重组Shh(recombinant sonic hedgehog,rShh)因子对海水浸泡肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC)的促进增殖及抗凋亡作用.方法 组织块法原代培养大鼠PMVEC,建立大鼠PMVEC海水浸泡模型,加入不同剂量重组Shh因子,采用TUNEL法检测PMVEC凋亡率.采用2,3-苯基溴化四唑(MTT)染色计数法测定细胞增殖活性.结果 海水浸泡可导致PMVEC损伤,表现为PMVEC细胞增殖受到抑制以及凋亡发生率增加.重组Shh能降低海水所致PMVEC增殖抑制率和其凋亡率,在实验剂量范围内,其促增殖和抗凋亡作用呈剂量依赖性.结论 重组Shh可促进海水浸泡PMVEC增殖和抑制其凋亡.     

球状脂联素对卵巢微血管内皮细胞增殖、迁移及管状结构形成的影响

目的 分离并鉴定小鼠卵巢微血管内皮细胞,并利用卵巢微血管内皮细胞研究球状脂联素对小鼠卵巢血管新生的影响.方法 采用Percoll密度梯度离心法分离纯化小鼠卵巢微血管内皮细胞,并采用免疫荧光检测细胞表面的卵泡刺激素受体、黄体生成素受体以及血管内皮细胞标记vWF;通过血管生成因子(VEGFA)处理检测卵巢微血管内皮细胞在Matrigel上的毛细管形成特性.重组的球状脂联素蛋白处理卵巢微血管内皮细胞,通过MTS检测细胞增殖;细胞划痕愈合法检测细胞迁移;Matrigel基质胶的血管形成,Western blot检测单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化激活.结果 分离出的细胞表现为卵泡刺激素受体阴性,黄体生成素受体阳性,vWF阳性,且VEGFA能够促进血管生长,具有卵巢特异的血管内皮生长特性.高剂量浓度(1 μg/mL和3μg/mL)的重组的脂联素球状结构域蛋白处理后卵巢微血管内皮细胞数量分别增加(158.72± 14.50)％和(186.50±4.20)％,促进细胞增殖(P＜0.01);高剂量浓度(1μg/mL和3μg/mL)的重组的脂联素球状结构域蛋白处理后卵巢微血管划痕愈合率分别为(49.43±3.43)％(P＜0.05)和(69.67±1.2)％(P＜0.01);3μg/mL的脂联素处理卵巢微血管内皮细胞形成的毛细管状长度为对照组的7.63±0.66倍(P＜0.01).3μg/mL的球状脂联素蛋白处理饥饿处理后的卵巢微血管内皮细胞培养15 min后pAMPK/AMPK、30 min后pAMPK/AMPK显著高于未加入蛋白处理的对照(P＜0.01).Compound C抑制了球状脂联素促进的卵巢微血管内皮细胞的管状结构形成及AMPK磷酸化激活.结论 成功分离了卵巢微血管内皮细胞,球状脂联素蛋白能够通过激活AMPK信号途径促进卵巢微血管内皮细胞的血管新生.     

辐射对小鼠大脑微血管内皮细胞的作用

目的 研究辐射单因素对小鼠大脑微血管内皮细胞的影响,并探索辐射对脑微血管内皮细胞的可能的调控机制.方法 采用原代培养的小鼠大脑微血管内皮细胞,分为3组,辐射剂量分别为0,1,2 Gy.应用TUNEL染色观察小鼠大脑微血管内皮细胞形态学变化和凋亡情况.应用Western blot方法测定MAPKs家族ERK、JYN蛋白的磷酸化水平. 结果 随着辐射剂量增加细胞凋亡比例升高,以2Gy辐射下的细胞凋亡最明显；ERK蛋白磷酸化水平在辐射剂量1 Gy时,出现下降趋势,随辐射剂量增大后呈现升高趋势,JNK蛋白磷酸化水平呈现升高趋势. 结论 辐射可引起小鼠大脑微血管内皮细胞凋亡,且随辐射剂量增加,细胞凋亡率随之上升.MAPK/ERK、MAPK/JNK信号转导通道可能参与辐射对小鼠大脑微血管内皮细胞凋亡的调节过程.     

红景天苷抑制模拟微重力诱导的肺微血管内皮细胞凋亡

目的研究红景天苷(Sa1)抑制模拟微重力诱导的肺微血管内皮细胞凋亡作用并探讨其可能的机制。方法采用回转器回转细胞模拟微重力效应,将传代培养的人肺微血管内皮细胞分为3组:对照组、回转组、回转+Sal预处理组,采用An-nexinV-FITC试剂盒对细胞染色,以流式细胞仪进行细胞凋亡检测,另通过Real-time PCR检测Bcl-2、Bax及Caspase-3基因表达情况,Western blot法检测PI3K、p-Akt与Caspase-3的蛋白表达情况。结果流式细胞仪定量结果表明回转72h后HPMEC的凋亡率显著高于同步对照组,Bcl-2基因表达降低,而Bax与Caspase-3基因表达升高,并且PI3K和p-Akt蛋白表达减低,Caspase-3蛋白表达升高;而Sal预处理后细胞凋亡率较回转组降低,Bcl-2基因表达升高,而Bax与Caspase-3基因表达下降,同时PI3K和p-Akt蛋白表达上升,Caspase-3蛋白表达下降。结论红景天苷可以抑制模拟微重力诱导的肺微血管内皮细胞凋亡,其机制可能为影响了PI3k/Akt通路。