一种简单分离、传代培养成年小鼠肝细胞的方法

目的　寻找肝细胞分离、传代培养更简单方便的方法。方法　应用不同胰酶浓度、不同消化时间消化成年小鼠肝组织后进行组织块培养 ,观察细胞的贴壁率、产量及活力。结果　胰蛋白酶分离成年小鼠肝细胞 ,于 MEM(含 2 0 %小牛血清 )培养液中 ,37℃密闭培养 ,生长情况良好 ,12小时左右即可完全贴壁 ,并已传至第二代。胰酶浓度为 0 .15 % ,消化时间15 m in,细胞产量及活率较高 ,每 10 g体重细胞产量为 0 .84± 0 .0 8× 10 7,细胞活力为 (90 .6 6± 5 .71) % ,贴壁生长 48小时细胞倍增 PD值为 0 .86± 0 .0 5。结论　胰蛋白酶消化、组织块贴壁法是成年小鼠肝细胞分离、培养传代的简便方法 ,不需要特殊装置 ,酶耗费少 ,细胞采集可满足一般实验要求     

一种小鼠原代肝细胞培养方法

目的寻求一种简易、廉价的原代小鼠肝细胞培养方法。方法采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液，以低血清进行肝细胞单层培养。结果通过多次探索、观察，比较成功地进行了原代肝细胞培养。结论此方法适合一般实验室开展肝细胞培养。     

一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法

目的 建立一种简单的能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法 将经典的两步灌流法简化为经下腔静脉逆向脉冲式灌注,利用低速离心法对肝细胞分离液进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞活率;培养瓶预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态。结果 此法得到了足够数量的肝细胞,细胞活率大于90%;细胞可稳定贴壁1周。结论 成功建立了一种简单的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。     

改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法

目的:建立一种简便、经济、高效的小鼠肝细胞分离和纯化方法。方法:对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,缩短消化时间和改变灌注方式;分离的小鼠肝细胞,采用低速离心(300 r/min,1min,3～5次)纯化,台盼兰染色检测活率,糖原染色鉴定肝细胞,并与单密度梯度离心纯化法进行比较。结果:原代肝细胞经低速离心纯化后,活率达到90%左右,纯度达95%以上,与密度梯度离心法效果相近。结论:建立了一种新的小鼠原代肝细胞的分离纯化方法。     

一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法

目的：建立一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法。方法：取新生大鼠、成年小鼠的肝组织，立即剪碎、铜网过滤，RPMI-1640培养基培养，24小时后换液，除去血细胞后进一步培养，形态学观察，并用PAS(periodicacid-Schiff)染色法鉴定。结果：在光镜可见分离、培养的肝细胞折光性强，呈圆形，偶见梭形，核大而圆，具有双核细胞；PAS染色后，胞质中布满粉红色糖原颗粒，核呈空泡状。结论：本实验方法可获得较纯的肝细胞，而且操作简便可行，经济实用。     

一种培养幼小鼠肝细胞的方法

我国目前动物实验主要用小鼠进行。然而经典的Ｓｅｇｌｅｎ灌流肝细胞分离需采用门静脉插管灌流较难用于幼鼠 ,特别是幼小鼠。我们对Ｓｅｇｌｅｎ灌流法做了改进 ,将生后 2ｄ的 6 15幼小鼠肝细胞培养成功 ,现报告如下。1　材料和方法动物 :出生 2ｄ 6 15幼鼠。试剂 :Ｄ -Ｈａｎｋ’ｓ液 ,Ｈａｎｋ’ｓ液 ,ｐＨ 7.2 ,0 .0 5 %Ⅳ型胶原酶 (购自美国Ｓｉｇｍａ公司 ) ,含 10 %小牛血清完全培养基。肝细胞分离与培养 :取出生 2ｄ的 6 15幼鼠 ,2 5 %氨基甲酸乙酯 (4ｍｌ/ｋｇ体重 )腹腔注射麻醉 ,常规皮肤消毒 ,剖开胸腹腔 ,暴露心脏与肝脏 ,用 1…     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

高活力原代小鼠肝细胞的分离与纯化

目的建立一种稳定的能获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞的分离和纯化方法。方法对传统的两步原位胶原酶灌注法进行4个方面的优化,主要包括选择逆向灌流、将持续灌注法改为间断灌注后夹闭门静脉法、严格控制胶原酶消化时间和将分离的肝细胞悬液进行低速Percoll单密度离心纯化。分离后的肝细胞进行体外培养。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法检测。结果新鲜分离的小鼠原代肝细胞活力能稳定达到87%±3%,平均活细胞总数为8×105每克小鼠体重,绝大部分细胞在体外培养2h后贴壁生长。结论优化后的肝细胞分离方法更为稳定、有效,分离到的肝细胞具有高活力的优点。     

HBV—DNA不同模板制备进行多聚酶链基因扩增

本文采用 4.2mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.1mol/L2一巯基乙醇,0.5%(W/V)十二烷基肌氨酸钠作为裂解液进行一步法程序式抽提血清标本HBV—DNA模板用于多聚酶链基因扩增.该法与常规DSD抽提法及微量直接法进行比较,具有方法简单、稳定、不易污染且敏感性高.抽提过程可在1个小时内完成,经酶切及a~(32)P标记探针放射自显影鉴定PCR产物具良好特异性,该法尤其适应于大量临床标本的检测,值得推广使用.     

成年小鼠心脏干细胞的体外分离及表型鉴定

目的 建立稳定的小鼠心脏干细胞（cardiac stem cells,CSCs）分离方法,并对体外培养的CSCs进行生物学特性鉴定.方法 选用健康成年CD1小鼠,在无菌条件下取心脏并剪碎,并用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶反复消化,采用差速离心法去除混合细胞悬液中的心肌细胞,结合免疫磁珠分选法纯化c-kit＋ CSCs后,进行流式细胞仪表面标记鉴定.结果 酶消化法和磁珠分选法结合成功分离并纯化了成年小鼠c-kit＋ CSCs.磁珠分选前,流式细胞仪表面标记鉴定c-kit＋ CD34-CSCs为4.62％;经磁珠分选后c-kit＋ CD34-CSCs可达70.23％.结论 酶消化法结合磁珠分选法能成功分离纯化成年小鼠c-kit＋ CSCs,且能用于后续体外培养.体外培养时c-kit＋ CSCs相对于其它表型标记的心脏干细胞更加稳定,具有较强的扩增能力.相对于心脏组织块培养法,酶消化法可在短期内获得高纯度的c-kit＋ CSCs,更有助于心脏干细胞相关信号通道的体外实验研究.     

人成体肝脏干细胞体外分离、培养及鉴定

目的：体外分离、培养人成体肝脏干细胞，确定肝癌干细胞的表面标志物，寻找肝脏干细胞新的来源。方法:以肝癌患者的癌旁组织做为肝脏干细胞的来源，进行体外培养，摸索培养条件，待细胞稳定传代后，通过免疫磁珠法初步分离C-kit⁺细胞， 对肝脏干细胞进行初步筛选，最后对肝癌的癌旁组织及C-kit⁺细胞利用免疫组化及免疫荧光 化学染色鉴定AFP⁺、CK19⁺双阳性表达，证实癌旁组织中存在肝脏干细胞。结 果：肝细胞生长因子（HGF）、α-成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）及白血病抑制因子（LIF）对肝癌癌旁组织细胞的原代培养非常重要，可以获得比较稳定的细胞以便传代。免疫荧光组织化学染色证实癌旁组织中存在肝脏干细胞，经体外培养，免疫磁珠初步分离C-kit ⁺细胞后，获得小圆形细胞，此类细胞共同表达AFP及CK19。结论：人类肝癌的癌旁组织中存在肝脏干细胞，可以联合其表面表达的标志物，将 C-kit⁺/AFP⁺/CK 19⁺做为鉴定分离肝脏干细胞的一种方法。体外分离培养得到的小圆形细胞即卵圆细胞具备向肝细胞及胆管上皮细胞双向分化的潜能。     

乳腺成体干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的：体外分离、培养乳腺成体干细胞，为乳腺癌术后乳腺再造提供新的方法。方法：应用免疫磁珠法从15例乳腺癌患者的癌旁正常组织中分离人乳腺干细胞，即具有干细胞特性的分离的人类乳腺上皮细胞（SHMEC）,并对其培养、抗原表达、转染及分化能力等进行研究。 结果：经过培养得到两种不同形态的上皮细胞，即腺泡上皮细胞和肌上皮细胞，其中腺泡上皮细胞可以向肌上皮细胞转变，腺泡上皮细胞经过猿病毒（SV40）转染后获得永生化，在培养中可以形成类似乳腺末端小管腺泡单位的结构。 结论：体外分离培养得到的腺泡上皮细胞具有干细胞特性。     

简便快捷的小鼠胰岛分离纯化方法研究

目的 探讨小鼠胰岛分离与纯化的方法.方法 采用多点注射灌注胶原酶法消化胰腺,不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法分离、纯化胰岛.双硫腙特异性染色后计算胰岛产量及纯度.葡萄糖刺激后测定培养上清液胰岛素水平检测胰岛功能.结果 (1)每只小鼠采用上述分离、纯化法平均得到(114±15)个胰岛,平均纯度为(77.12±3.23)％,胰岛细胞存活率＞90％; (2)分离、纯化的胰岛培养上清液中胰岛素水平在无糖、低糖(2.8 mmol/L)和高糖(22.2 mmol/L)刺激下分别为(23.80±3.52) mIU/L、 (67.57 ±4.04) mIU/L和(164.32±10.75) mIU/L,各组间比较,差异有统计学意义(P＜0.05).两两比较,低糖组的胰岛素水平为无糖组的2.84倍(P＜ 0.05),高糖组的胰岛素水平为低糖组的2.43倍(P＜0.05),高糖组的胰岛素水平为无糖组的6.90倍(P＜0.05).结论 采用多点注射灌注胶原酶法消化胰腺,不连续密度梯度离心联合人工挑取的方法分离、纯化的小鼠胰岛产量及纯度较高,形态完整,不同浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌反应良好,是一种简便、快捷的小鼠胰岛分离方法.     

大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的一些因素，以建立稳定的MEF培养体系。方法 取BALB／c小鼠胚胎分离成纤维细胞，利用体外培养体系，对MEF的生长形态，生长曲线及细胞周期进行观察，并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究。结果 13.5d胎龄鼠胚的MEF分离效果优于10.5d,18.5d胎龄鼠胚；MEF在体外为贴壁生长型细胞，第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下，0.25%胰酶消化MEF时间以3－5min为宜。结论 MEF在第3代增殖旺盛，最适宜作胚胎干细胞的饲养层。     

成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离?培养及鉴定

目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法.方法:V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织,并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,而后加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)继续培养,7天可形成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达.结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮,再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,可使胰腺导管细胞得到较好的纯化.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(79.3±10.5)%,而insulin及glucagon染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因.结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞.经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性.