幽门螺杆菌外膜蛋白cagL基因的克隆、表达及其对IL-8 mRNA表达的影响

目的:克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)NCTC11637菌株cagL基因,并探讨其对IL-8 mRNA表达的影响.方法:设计cagL引物,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后测序分析, 用信息学软件分析其物理化学特性,并构建表达载体cagL-PET28a(+)转化E.coli BL-21(DE3),IPTG诱导表达, 镍亲和层析纯化,SDS- PAGE及蛋白质印迹鉴定表达蛋白.纯化蛋白与细胞GES-1共培养,提取细胞总RNA,RT-PCR检测细胞IL-8mRNA表达.结果:测序分析表明cagL编码成熟肽的碱基序列为654 bp,编码217个氨基酸,与基因库公布的其他H.pylori菌株的基因序列同源性为96%～98%,氨基酸同源性为 97%～99%,软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域;表达蛋白的相对分子质量约为32 000,蛋白质印迹检测融合蛋白具有良好的抗原活性;重组蛋白作用于GES-1细胞后,可诱导细胞因子 IL-8 在 mRNA 水平上的表达.结论:CagL蛋白可刺激GES-1细胞IL-8 mRNA的表达.     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

EBI3蛋白基因克隆、表达及其初步鉴定

目的 进一步研究EB病毒诱导基因3(EBI3)蛋白在病原生物感染宿主中的功能,探讨原核表达小鼠EBI3蛋白并初步鉴定.方法 收集日本血吸虫感染的C57/BL6小鼠脾细胞后提取总RNA,利用所合成引物经RT-PCR获得EBI3的cDNA,将该基因亚克隆入原核表达载体pET32a(+) ,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21株, 经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对包涵体进行变性、纯化和复性后获得可溶性的小鼠重组EBI3蛋白,用Western blot对其鉴定.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获取血清,经饱和硫酸铵法和DEAE-Sephadex A-50柱纯化得到抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA检测其免疫活性.结果 基因工程获得目的 蛋白变性复性成功后经Western blot鉴定证实为小鼠重组EBI3蛋白,免疫小鼠后取血清,分离纯化获得抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,ELISA结果表明该蛋白具有免疫原性.结论 成功地表达了小鼠重组EBI3蛋白,并制备了抗小鼠重组EBI3蛋白多克隆抗体,为进一步研究EBI3蛋白在病原生物感染宿主中的功能奠定了基础.     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

淋球菌外膜蛋白Porin I多抗的黏附抑制作用研究

目的:研究兔抗淋球菌外膜蛋白Porin I(P I)的多克隆抗体阻断淋病奈瑟菌对泌尿生殖道上皮的黏附作用。方法:将自行构建表达的淋球菌GST-P I融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔,获得兔抗P I蛋白的多抗血清,纯化后得到P I-IgG抗体。建立淋球菌感染BALB/c小鼠模型,并通过观察阴道黏膜改变、分泌物涂片、冲洗液培养及阴道组织病理变化评价兔抗P I-IgG抗体对淋球菌黏附的影响。结果:经1 m g/m l兔抗P I-IgG处理后3 h再接种淋球菌的BALB/c小鼠生殖道黏膜未见红肿及脓液,分泌物涂片及阴道冲洗液未检及淋球菌,阴道组织病理检查也未见炎症细胞浸润。而低于浓度1 m g/m l及长于3 h兔抗P I-IgG处理的小鼠阴道组织病理可检及炎症细胞,但其它检查结果阴性。结论:纯化的抗淋球菌GST-P I融合蛋白的多克隆抗体,能有效抑制淋病奈瑟菌对小鼠泌尿生殖道上皮的黏附与感染,阻断作用及持续时间与抗体浓度有关。     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0540基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的：构建幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）Cag致病岛（Cag—pathogenicity island,Cag—PAI）编码的hp0540基因的原核表达系统,并制备其多克隆抗体。方法：应用PCR技术从Hp11637基因组DNA中扩增hp0540基因片段,克隆至pMD18-2T载体后,进行序列测定,并对其序列进行生物信息学分析;构建pET-28a—hp0540原核表达载体,转化表达宿主菌BL21DE3;经IPTG诱导表达后,SDS—PAGE法鉴定目的蛋白的表达,并以Ni^2＋-NTA柱分离纯化目的蛋白;将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并测定抗体效价。结果：成功克隆了hp0540基因,全长1086bp,编码361个氨基酸,与基因库公布的其他坳菌株基因序列的核苷酸同源性为98％。工程菌诱导后SDS—PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为39000,经Ni^2＋NTA柱纯化后可获得重组蛋白,重组蛋白免疫新西兰大白兔后获得效价为1：160000的多克隆抗体。结论：成功构建了hp0540基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定了基础。     

抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定

目的：纯化rVVC免疫家免，制备并纯化多克隆抗体。观察复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合作用肝癌细胞SMMC7721后，肝癌细胞SMMC7721形态学和活性变化，评估抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC772的保护作用。方法：纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳免获得多克隆抗体，多克隆抗体经过硫酸铵盐析、Sephadex G25除盐和DEAE-SephadexG100层析纯化并进行Westerm Blot鉴定和抗体效价分析。复性rVVC、纯化多克隆抗体、rVVC和纯化多克隆抗体混合物作用肝癌细胞SMMC7721后，显微镜观察并以MTT法确定抗重组rVVC蛋白多克隆抗体对肝癌细胞SMMC7721的保护作用。结果：兔抗重组rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后，得到较纯的IgG分子。免疫印迹结果显示，抗重组rVVC蛋白多克隆抗体与纯化抗原呈现特异性反应条带。显微镜观察和MTT结果表明，纯化多克隆抗体能够阻断重组rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC772的损伤。结论：成功制备了具有保护和阻断作用的免抗重组rVVC多克隆抗体，为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。     

重组人IL-1β分子的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

目的克隆人IL-1β基因,纯化其原核表达的产物,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法重组原核表达质粒pET-32a（＋）-IL-1β在宿主菌BL21（DE3）表达后,用割胶回收、电洗脱的方法纯化原核表达的蛋白,并用其免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备相应的mAb。用ELISA法检测mAb的效价,并进行Ig亚类、特异度的检测。结果本研究利用HL-60细胞系cDNA为模板经PCR克隆了人IL-1β基因,纯化的重组人IL-1β蛋白纯度和含量分别为95%和0.75μg/μl。共筛选出能稳定分泌抗人IL-1β的杂交瘤细胞2株,分别为5G5和8H8。抗体亚型均为IgG2a,轻链均为κ链。结论克隆了人IL-1β基因,并成功纯化了其原核表达的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备的鼠抗人IL-1β的单克隆抗体（mAb）,为实验室及临床研究奠定了一定的基础。     

幽门螺杆菌CagL蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）CagL蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）,并鉴定其特性。方法： 用原核表达并纯化的CagL融合蛋白免疫BALB/c小鼠,6周后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经亚克隆筛选获得阳性杂交瘤细胞株;ELISA法鉴定mAb的亚型;间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清和腹腔积液效价及其相对亲和力;相加ELISA法分析mAb的识别表位;蛋白质印迹法鉴定mAb特异性;冻溶法检测杂交瘤细胞株的稳定性。结果： 获得3株能稳定分泌抗CagL的杂交瘤细胞株,其中两株单抗属IgM类,一株单抗属IgG2a类,轻链型别均为κ型;杂交瘤细胞培养上清效价在1∶64～1∶128之间,腹腔积液的效价均达1∶16 000以上;相对亲和力较高;3株mAb识别3种不同的抗原表位;3株mAb都能与融合蛋白反应,其中两株能与H.pylori全菌蛋白发生特异性反应;杂交瘤细胞经冻存复苏后,体外传代仍能稳定分泌mAb。结论： 成功制备了抗H.pylori CagL蛋白的单克隆抗体,为深入研究幽门螺杆菌CagL蛋白的功能和Ⅳ型分泌系统的致病机制奠定了基础。     

gpc3/mxr7基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的：通过原核表达并纯化GPC3蛋白，免疫家兔获得抗—GPC3多克隆抗体，为深入研究gpc3／mxr7基因的功能及其临床应用奠定基础。方法：将gpc3／mxr7基因片段亚克隆至pPROEX^TM HTb原核表达载体，采用融合6—his的融合蛋白方法原核表达GPC3蛋白质，纯化蛋白后免疫家兔，鉴定并纯化出抗—GPC3多克隆抗体。结果；原核诱导表达出GPC3蛋白，免疫家兔后获得多克隆抗体，经鉴定为抗--GPC3特异性多克隆抗体，并能识别原核、真核表达的外源性及HepG2和Hu-h7细胞内源性GPC3蛋白。结论：GPC3蛋白多克隆抗体能特异识别GPC3蛋白，可应用于gpc3／mxr7基因的功能研究，并为临床原发性肝癌的血清学早期诊断提供新的标记物。     

流行性乙型脑炎病毒重组E蛋白的纯化及多克隆抗体制备

目的：纯化原核表达的JEV E蛋白并制备其多克隆抗体。方法：IPTG诱导大肠杆菌表达JEV E蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化。将纯化后的JEV E蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗血清。琼脂糖双向扩散实验及间接ELISA检测抗体效价。结果：获得浓度1.85mg/ml、纯度92%的JEV E蛋白,并制备了JEV E蛋白兔多克隆抗体血清。琼脂糖双向扩散实验显示多克隆抗体血清1∶16稀释时仍能观察到沉淀线,间接ELISA法显示1∶200稀释时具有较高效价。结论：纯化了JEV E蛋白,并制备出了多克隆抗体。     

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。     

人基质金属蛋白酶—1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用

目的：获得兔抗人基质金属蛋白酶-1(MMP-1)多克隆抗体，并将其初步应用于临床检测。方法：将人MMP-1融合蛋白经亲和层析法纯化，并将其作为抗原免疫家兔，获得兔抗血清，经饱和硫酸铵纯化，获得初步纯化的兔抗人MMP-1多克隆抗体。用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验(ELISA)测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP-1的OD值。结果：获得初步纯化的兔抗人MMP-1特异性多克隆抗体，该抗体能与人MMP-1起反应。结论：制备的MMP-1多克隆抗体可初步用于临床检测。     

人基质金属蛋白酶-1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用

目的 :获得兔抗人基质金属蛋白酶 1 (MMP 1 )多克隆抗体 ,并将其初步应用于临床检测。方法 :将人MMP 1融合蛋白经亲和层析法纯化 ,并将其作为抗原免疫家兔 ,获得兔抗血清 ,经饱和硫酸铵纯化 ,获得初步纯化的兔抗人MMP 1多克隆抗体。用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验 (ELISA)测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP 1的OD值。结果 :获得初步纯化的兔抗人MMP 1特异性多克隆抗体 ,该抗体能与人MMP 1起反应。结论:制备的MMP 1多克隆抗体可初步用于临床检测     

抗P37多克隆抗体的制备 纯化与鉴定

目的：用P37融合蛋白免疫动物制备抗血清,为猪鼻支原体感染作用的分子机制提供依据。方法：诱导表达GST-P37蛋白并以其免疫兔制备免疫血清,ELISA法检测抗血清的效价;Western blot-ting检测抗血清特异性。结果：免疫家兔并纯化抗血清得到特异的抗P37抗体,该抗体能检测到P37蛋白的表达。结论：成功制备了抗P37的多克隆抗体,对进一步研究P37的功能提供了一个有用的工具。     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。