日本血吸虫Mr 23 000抗原与白细 胞介素-12多价DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的 研究能共同表达日本血吸虫Mr 23 000膜抗原（Sj23）与白细胞介素-12(IL-12)的多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23诱导BALB/c小鼠免疫保护作用。 方法 　在多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23和PV-IL12的基础上，构建空白质粒PV和仅表达Sj23的质粒PV-Sj23。50只BALB/c小鼠分为5组，每组10只，分别注射多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23、表达Sj23的质粒PV-Sj23、表达IL-12质粒PV-IL12、空白质粒PV和生理盐水，100 μg/只，免疫1次。4周后每只鼠攻击感染40±2条尾蚴，42 d后剖杀，计数成虫及肝内虫卵数。 结果 成功地构建了空白质粒PV和只表达Sj23的质粒PV-Sj23及多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23。PV-IL12-Sj23组和PV-Sj23组分别获得了45.5%和27.2%的减虫率，两组比较差异有显著性（P<0.05），减卵率分别为58.4%和33.9%。 结论 多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23可诱导BALB/c小鼠产生较显著的抗血吸虫免疫保护作用，且保护性效果比单价DNA疫苗PV-Sj23好。     

Sj26基因转染的树突状细胞对日本血吸虫感染的免疫保护机制研究

目的 探讨日本血吸虫Sj26基因转染的树突状细胞（DC）对日本血吸虫感染的保护性免疫作用机制。 方法 BALB/c小鼠48只随机均分4组, 于小鼠耳廓分别注射细胞悬液(浓度1×10⁶/ml)0.2 ml, A组注射Sj26基因转染的DC、B组注射质粒pcDNA3转染的DC、 C组注射未处理的DC, D组注射RPMI-1640。共免疫3次，间隔2周。末次免疫后2周，每鼠经皮肤感染40±2条尾蚴。分别于免疫前、末次免疫后第 2 周以及攻击感染后第 6 周采血, ELISA法检测血清IgG抗体、γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）水平，免疫印迹法（Western blot）检测血清特异性抗Sj26 IgG抗体，双夹心ELISA法检测脾淋巴细胞经伴刀豆球蛋白A(ConA)和可溶性虫卵抗原(SEA)刺激后培养上清中IFN-γ和IL-4含量。噻唑蓝法（MTT）检测脾淋巴细胞增殖情况。 结果 A组血清IgG抗体水平(吸光度A₄₉₁值)，免疫后（A₄₉₁=0.117）显著高于免疫前（A₄₉₁=0.049）（t=2.73，P<0.05），也显著高于B组（A₄₉₁=0.061）和C组（A₄₉₁=0.058）（t值为2.48和2.56，P<0.05）。A组血清能特异识别血吸虫成虫抗原Mr 26 000蛋白。血清IL-4水平，各组免疫前、后均无明显变化。 IFN-γ水平，A组血清免疫后为（101.4±4.9)pg/ml, 明显高于免疫前的(15.0±1.9) pg/ml（t=5.80，P<0.01），亦高于免疫后的B组（40.1±3.1) pg/ml和C组（35.6±1.2) pg/ml (t值为3.98和4.13，P<0.01)。脾淋巴细胞经ConA刺激诱生的IFN-γ， A组（171.2 pg/ml）显著高于 D组（91.0 pg/ml）（t=4.25，P<0.01）。 经SEA刺激诱生的IFN-γ， A组（70.8 pg/ml）显著高于D组（49.7 pg/ml）（t=2.83，P<0.01）。经ConA刺激诱生的IL-4水平，A组（79.7 pg/ml）明显低于D组（125.2 pg/ml）（t=4.40, P<0.01）。经SEA刺激诱生的IL-4，A组（50.7 pg/ml）明显低于D组（70.5 pg/ml）（t=2.62，P<0.05）。A组脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后的刺激指数分别为4.1和2.82，均高于其他各组（与D组比较，t=3.20, P<0.01和t=2.15，P<0.05）。 结论 Sj26基因转染的树突状细胞免疫小鼠主要诱导Th1型免疫应答。     

日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫力的研究

目的构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)重组质粒,并观察其在小鼠体内诱导的抗日本血吸虫感染保护作用。方法RT-PCR特异性扩增Sj14FABP基因,将其克隆入真核表达载体pVIVO2,通过PCR、双酶切及测序鉴定。获得的重组质粒pVIVO2-Sj14FABP转染HepG2细胞,间接免疫荧光(IFA)检测蛋白表达;并免疫BALB/c小鼠,30d后攻击感染,感染后45天剖杀,计数检获成虫数和肝脏虫卵数。结果RT-PCR扩增出大小为440bp的Sj14FABP片段,重组质粒经PCR和双酶切后均获得目的片段,转染细胞IFA结果显示有较强荧光。重组质粒免疫小鼠后分别获得24.1%减虫率和27.2%减卵率。结论成功构建和表达重组质粒pVIVO2-Sj14FABP,该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫双价DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究

目的 研究防治日本血吸虫病的双价DNA疫苗的免疫保护效果。 方法 构建共表达双价DNA疫苗pVI-VO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP，并用BamHI/EcoRI和BspHI/AvRⅡ进行双酶切和测序鉴定。通过免疫荧光法（IFAT）检测质粒在BALB/c小鼠骨骼肌细胞的表达。70只小鼠随机分为7组，每组10只，分别肌肉注射生理盐水、pVIVO2-mcs、pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-SjFABP、pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP、pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP+多糖佐剂，免疫1次。免疫后4周用40±2条尾蚴攻击感染，感染后45 d剖杀，计数各组小鼠成虫数和肝虫卵数。 结果 双酶切反应和测序分析证明成功构建双价质粒DNA。IFAT结果提示双价质粒DNA可在小鼠骨骼肌细胞胞膜和胞浆中表达。双价DNA疫苗免疫小鼠后获得41.2%～53.8%的减虫率和47.0%～53.8%肝减卵率；pVIVO2-Sj23-SjFABP+多糖佐剂组获得68.9%的减虫率和84.0%肝减卵率，保护力显著高于单价疫苗和双价疫苗（P＜0.05﹚。结论 共表达的双价DNA疫苗在小鼠体内可产生较好的抗血吸虫感染的免疫保护效果。多糖佐剂组保护效果明显高于单价和双价疫苗组。     

植物多糖对日本血吸虫DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj23增效作用的研究

目的 以提取天然香菇菌多糖和茶叶多糖混合物为佐剂，探讨混合型植物多糖对血吸虫疫苗的保护性免疫增效作用。 方法 构建日本血吸虫重组质粒pVIVO2-IL12?鄄Sj23。BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只。A组每鼠股四头肌注射生理盐水100 μl 为对照，B组每鼠注射pVIVO2-IL12-Sj23 100 μg，C组每鼠注射pVIVO2-IL12-Sj23 100 μg加等量多糖混合物。小鼠接种后第4 周以日本血吸虫尾蚴40±2条经皮肤攻击感染，感染后6周剖杀，计算减虫率及每克肝组织减卵率，同时用ELISA测定血清中特异性抗体水平。 结果 C组减虫率和每克肝组织减卵率分别为64.3%和79.9%，B组则分别为45.5%和58.3%， B、C两组的差异有统计学意义（P＜0.05）。B、C两组IgG水平均较A组显著升高（P＜0.05），但B、C两组IgG抗体水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 以天然香菇菌多糖和茶叶多糖混合物为佐剂，对日本血吸虫重组质粒pVIVO2-IL12-Sj23的免疫效果有一定的增效作用。     

树突状细胞DNA多价疫苗抗日本血吸虫感染作用机制的研究

摘 要：目的 探讨树突状细胞（DC）DNA混合多价疫苗抗日本血吸虫感染保护性免疫作用机制。方法 BALB/c小鼠耳廓分别注射Sj26、Sj23和Sj14基因转染DC（A组）、Sj26基因转染DC（B组）、Sj23基因转染DC（C组）、Sj14基因转染DC（D组）、pcDNA3转染DC（E组）、未处理DC（F组）和RPMI-1640（G组）,共免疫3次,间隔2周,末次免疫后第2周,每鼠经皮肤感染40条日本血吸虫尾蚴。ELISA法检测血清特异性IgG抗体、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）水平,双夹心ELISA法检测脾淋巴细胞经ConA和可溶性虫卵抗原（SEA）刺激后培养上清中IFN-γ和IL-4水平,噻唑蓝（MTT）法检测脾淋巴细胞的增殖。结果 A组小鼠末次免疫后第2周血清特异性IgG抗体水平显著升高（与G组比较,P<0.001）。A组小鼠免疫后血清IFN-γ水平明显升高(P<0.01),而血清IL-4的水平,各组小鼠免疫前、后无明显变化。A组小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后诱生的IFN-γ水平显著增高,而IL-4水平显著降低(与G组比较,P<0.001)。A组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数高于其他各组（与G组比较,P<0.001）。结论 体液免疫和细胞免疫共同参与了DC DNA混合多价疫苗诱导的保护性免疫作用,其中Th1型免疫应答在抗日本血吸虫感染的保护性免疫中起主要作用。 关键词：日本血吸虫;树突状细胞;DNA疫苗;保护性免疫     

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的?摇探讨重组白细胞介素－4（IL-4）真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。 方法 将小鼠IL-4 基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒， 并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA (VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠，设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达，末次免疫3周后攻击感染，用减虫率及减卵率表示保护力。 结果 重组IL-4和组织蛋白酶B DNA均在小鼠肌细胞表达，重组IL-4和组织蛋白酶B DNA联合免疫小鼠，产生43.2% 的减虫率和76.6% 的减卵率，与组织蛋白酶B DNA单独免疫相比差异有显著性（P<0.01，P<0.05 ）。 结论 重组IL-4 能提高日本血吸虫组织蛋白酶B 核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用，具有佐剂的免疫效应。     

日本血吸虫Sj23DNA疫苗的增效研究

目的 探讨缺失肿瘤转移有关基因ME491同源序列的日本血吸虫Mr23 000膜蛋白基因（Sj23DNA）突变体疫苗的免疫效果。 方法 将Sj23DNA中与人黑素瘤细胞膜上的ME491同源序列进行基因缺失突变，再将突变基因转染真核细胞人胚肾HEK293细胞，通过间接荧光抗体试验（IFAT）检测其表达情况。将pcDNA3-Sj23突变体经股四头肌注射免疫小鼠（100 μg/只），免疫后4周取注射部位肌肉作冰冻切片，IFAT检测目的基因的表达。40只BALB/c小鼠随机分成4组（每组10只），分别经股四头肌注射pcDNA3-Sj23突变体、pcDNA3-Sj23、空白质粒pcDNA3（均100 μg/只）和生理盐水（30 μl/只）免疫1次。免疫后4周用尾蚴攻击感染（40±2条/只）。第42天剖杀，肠系膜静脉灌注法及挤压法计数成虫，取肝脏计算每克肝组织虫卵数（EPG）。以减虫率和减卵率评价其免疫保护力。 结果 pcDNA3-Sj23突变体疫苗可在真核细胞HEK293中瞬时表达。pcDNA3-Sj23突变体在小鼠注射部位骨骼肌细胞上出现较强荧光，空白对照组未见特异性荧光。pcDNA3-Sj23突变体获得40.3%减虫率和42.8%减卵率，pcDNA3-Sj23获得33.1%减虫率和28.9%减卵率。两组差异均有统计学意义（P值均<0.05）。 结论 与pcDNA3-Sj23相比，缺失ME491同源序列的cDNA3-Sj23突变体疫苗能诱导BALB/c小鼠产生更好的免疫保护效果。     

日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达

目的　构建日本血吸虫 14kDa脂肪酸结合蛋白 (Sj14FABP)和细胞因子IL 12共表达质粒 ,并观察其能否在小鼠体内获得表达。方法　TRIzol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA ,采用RT PCR方法逆转录Sj14FABP编码基因序列 ,经过双酶切后定向克隆到载体pVIVO2 IL12中 ,通过PCR、酶切及测序进行鉴定。大量制备重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP并免疫BALB/c小鼠 ,取注射部位肌肉组织进行间接免疫荧光试验。结果　RT PCR扩增出一条大小为 4 4 0bp的片段 ;经PCR、酶切及测序鉴定表明所构建的重组质粒中含有Sj14FABP基因 ;间接免疫荧光试验结果为阳性。 结论　本试验成功构建重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP ,并在小鼠体内获得表达。     

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的 研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。 方法 42只BALB/c小鼠随机分为3组：实验组、空质粒组和PBS对照组，各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50 μg、pc-DNA3空质粒50 μg和PBS 50 μl，共免疫3次，每次间隔3周，末次接种量均加倍。末次免疫后2周，各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织，检测CD4⁺、CD8⁺ 及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个，观察其存活时间等。 结果 ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应，小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原；实验组小鼠的CD4⁺T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+ 比值显著升高(4.69±1.32)%（P<0.01）；其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）均有不同程度的升高，尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180 h后，实验组小鼠免疫保护率为88.9%，与对照组相比，小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟（P<0.01）。 结论 ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性，能产生良好的免疫保护作用。     

血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗的研究

目的 构建日本血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26,并研究其免疫原性及免疫保护作用。 方法 构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj14）、谷胱甘肽-S-转移酶（Sj26）和副肌球蛋白（Sj97）的跨膜共表达质粒pIRES?鄄Sj97-Sj14-Sj26,转染HeLa细胞。通过RT?鄄PCR法检测Sj14、Sj26和Sj97 mRNA的表达,免疫荧光（IFA）检测Sj14、Sj26和Sj97蛋白的表达。用纯化的该质粒免疫BALB／c小鼠（100 μg/只）,设生理盐水和空载体对照组,20只/组,每隔2周加强免疫1次,共免疫3次。末次免疫2周后,每组取10只小鼠,眼球取血并断颈处死,取脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞。分别检测免疫小鼠血清中总IgG抗体及脾淋巴细胞培养上清干扰素-γ（IFN-γ）水平,淋巴细胞刺激指数（SI）及 NO释放量,并分析脾淋巴细胞亚群。各组中余下小鼠每只经腹部感染40±1条尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫数及肝卵数,计算减虫率和减卵率。结果 构建的质粒可在体外表达。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组血清总IgG抗体含量分别为（5.62±0.64）、 （1.22±0.20）及（1.48±0.36） mg/ml,疫苗组与各对照组差异均具有统计学意义（P<0.01, P<0.05）。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组小鼠腹腔巨噬细胞NO含量分别为（321.19±18.03）、 （184.12±11.05）及（213.51±15.93） nmol/ml,疫苗组与生理盐水组间差异有统计学意义（P<0.05）。疫苗组、生理盐水组、空白质粒组小鼠脾淋巴细胞刺激指数分别为（2.25±0.29）、（1.18±0.07）及（1.22±0.09）,疫苗组显著升高（P<0.01）。疫苗组INF-γ水平与各对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.01）;CD4+和CD8+T细胞百分比明显升高。疫苗组减虫率和肝减卵率分别为39.9％和43.94％。 结论 pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗具有较强的免疫原性,可对日本血吸虫感染的小鼠产生一定保护作用。     

树突状细胞多价核酸疫苗抗血吸虫感染作用及机制研究

目的 探讨基因转染对树突状细胞(DC)功能的影响及DC多价核酸疫苗抗血吸虫感染作用及机制。方法 利用脂质体介导的基因转染技术将Sj26、Sj23和Sj14基因分别转染DC,流式细胞术(FCM)检测DC摄取抗原能力,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激作用。Sj26、Sj23和Sj14基因转染DC分别和联合免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,每只小鼠感染日本血吸虫尾蚴40条,小鼠感染血吸虫6周后,计数成虫和虫卵。ELISA法检测血清特异性IgG、血清干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)及脾淋巴细胞培养上清IFN-γ、IL-4水平,噻唑蓝(MTT)法检测脾淋巴细胞的增殖。结果 与真核表达载体pcDNA3转染DC和未处理DC相比较,基因转染DC摄取抗原的荧光强度明显降低(P<0.01),对同种异体T淋巴细胞的刺激指数明显升高(P<0.01)。各免疫组小鼠诱导的减虫率和减卵率均高于对照组(P<0.01),而基因转染DC联合免疫组小鼠抗血吸虫感染作用高于单一基因转染DC免疫组(P<0.001)。基因转染DC免疫组小鼠末次免疫2周后血清特异性IgG水平较免疫前显著升高(P<0.05),血清IFN-γ水平明显升高(P<0.01),而血清IL-4的水平无明显变化。与对照组比较,基因转染DC免疫组小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后培养上清IFN-γ水平显著增高,IL-4水平显著降低,刺激指数(SI)显著增高(P<0.001)。结论 基因转染能促进DC的成熟,增强DC的活性,DC多价核酸疫苗可增强抗血吸虫感染作用,其作用机制以Th1型免疫应答为主。     

日本血吸虫双价DNA疫苗体内外表达及持续时间的初步研究

目的观察日本血吸虫双价DNA疫苗在体内外表达及体内表达的持续时间。方法将构建的共表达日本血吸虫双价核酸疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj23瞬时转染HEK-293细胞,通过逆转录(RT-PCR)和间接免疫荧光试验(IFAT)检测真核细胞中SjFABP和Sj23基因及蛋白的表达。质粒经股四头肌注射免疫BALB/c小鼠12只,每月眼眶采血,并活体灌流小鼠2只,IFAT检测重组蛋白的原位表达,Westernblot法检测血清中特异性抗体,持续观察6个月。结果RT-PCR和IFAT证明质粒pVIVO2-SjFABP/Sj23能在体外表达。免疫后连续6个月,IFAT均检测到小鼠骨骼肌注射部位重组蛋白的原位表达,但Westernblot未检测到血清中特异性抗体的存在。结论日本血吸虫双价DNA疫苗在HEK-293细胞和小鼠骨骼肌中均能够正确地表达,体内表达持续时间至少在6个月以上。