支气管肺发育不良新生鼠模型肺泡上皮细胞标志物的表达变化及意义

目的 研究高氧致支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)新生鼠模型中Ⅰ型肺泡上皮细胞(typeⅠalveolar epithelial cells,AECⅠ)和Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AECⅡ)特异性标志物表达变化及其意义.方法 80只新生Wistar大鼠,于生后12 h内随机分为模型组(吸入氧浓度为85%)和对照组(吸入空气),每组40只.于暴露第7、14、21天,分别进行肺组织HE染色观察病理学改变,免疫荧光双标染色观察AECⅠ标志物水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)及AECⅡ标志物表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)表达及定位,Western blot方法检测AQP5和SP-C的蛋白表达水平,real-time PCR方法检测AQP5和SP-C的mRNA表达水平.结果 模型组大鼠肺组织表现出肺泡数目减少,体积增大,结构简单化,肺泡间隔增厚,次级分隔减少等肺泡化障碍表现.免疫荧光双标染色可见,模型组AQP5及SP-C表达明显增多,表达位置紊乱,且双染细胞/SP-C阳性细胞的比例明显增高(P<0.001).与对照组比较,模型组中AQP5及SP-C蛋白表达从高氧暴露7 d开始增加,增高的趋势持续至21 d.模型组中mRNA表达水平,AQP5从暴露7 d开始,SP-C从14 d开始较对照组明显升高(P<0.05),且两组间差异随高氧暴露时间延长更加明显(P<0.05).结论 暴露高氧中的新生鼠BPD模型肺组织中,AECⅠ标志物AQP5及AECⅡ标志物SP-C均表达上调,发生转分化的AECⅡ明显增多,表明在BPD肺损伤后的修复中存在AECⅡ过度转分化现象.     

Notch受体在早产鼠高氧肺损伤中的动态表达

目的检测Notch受体、AQP5、SP-C在高氧暴露下早产SD大鼠肺的表达,探讨Notch在高氧肺损伤中的作用机制。方法SD早产鼠80只随机分为对照组和高氧组,于1、71、42、1 d行肺组织病理学检查;免疫组织化学法检测Notch1、Notch3;RT-PCR检测Notch1、Notch3、AQP5S、P-C mRNA;Western blot检测AQP5、SP-C。结果病理学检查显示,高氧组肺发育滞后,Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)分化抑制。免疫组织化学法检测结果显示,高氧组各时间点(除7 d)肺组织Notch1表达低于对照组(P<0.05,0.01),Notch3上调(P<0.01)。Notch1、Notch3 mRNA改变类似蛋白水平。高氧组AQP5,SP-C mRNA及蛋白较对照组显著下降。结论85%高氧导致早产鼠肺Notch受体表达异常。Notch信号可能通过调控转分化参与高氧肺损伤。     

高氧对早产大鼠肺表面活性蛋白C表达的影响

目的探讨高氧对早产大鼠肺表面活性蛋白C（SP-C）表达的影响。方法孕21dSD早产大鼠,生后12～24h内随机分为空气组、高氧组。于空气或高氧暴露后1、4、7、10和14d提取肺组织,采用RT-PCR测定SP-C mRNA表达,免疫组化和Western-blot检测SP＂C蛋白表达。结果早产大鼠生后肺组织SP-C表达1d时最高,4d后表达渐减弱,其阳性染色信号主要定位于Ⅱ型肺泡上皮细胞。高氧暴露1d,肺组织SP-C mRNA及蛋白表达显著低于空气组,以后增加,高氧7d增加最明显,高氧14d时SP-C表达较空气组又减弱。结论SP-C参与了早产大鼠肺发育及高氧肺损伤的生理与病理过程,高氧暴露导致SP-C表达下调或功能障碍是促使高氧肺损伤发生发展的重要因素。     

苦杏仁甙对高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型细胞的保护作用

目的 探讨苦杏仁甙对体外高氧暴露早产鼠肺泡Ⅱ型细胞(type 2 alveolar epithelial cell,AECⅡ)的保护作用机制。方法 原代培养早产鼠AECⅡ,建立高氧细胞模型,采用MTT比色法、流式细胞术、免疫印迹(Western blot)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,观察苦杏仁甙对高氧暴露早产鼠AECⅡ增殖及表面活性物质蛋白(surfactant associated protein,SP)mRNA表达的影响。结果 高氧暴露导致早产鼠AECⅡ增殖抑制,AECⅡ SPs mRNA表达降低。MTT试验显示,苦杏仁甙50～200μmol／L时呈剂量依赖方式促进早产鼠AECⅡ细胞增殖,200μmol／L浓度时,其作用最强,400μmol／L浓度时反而呈抑制作用。200μmol／L苦杏仁甙可显著促进体外高氧暴露AECⅡ增殖,提高其SP mRNA表达水平。结论 高氧暴露导致早产鼠AECⅡ增殖抑制及SP mRNA表达降低,200μmol／L苦杏仁甙对体外高氧暴露的早产鼠AECⅡ有一定保护作用。     

高氧致新生大鼠支气管肺发育不良肺成肌纤维细胞分布的变化及意义

目的 观察高氧致新生大鼠支气管肺发育不良(BPD)肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及胶原的变化,探讨高氧致新生大鼠BPD的发生与成肌纤维细胞的内在联系.方法 将新生大鼠持续暴露在85%高氧环境中,在实验的1、3、7、14、21 d,取左肺组织固定、脱水、石蜡包埋、切片,用于肺组织病理变化观察及α-SMA表达的免疫组织化学检测;右肺-80℃冰冻,用于Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白和mRNA表达检测.结果 新生大鼠长期高氧暴露可致肺泡简单化,肺泡数目减少,终末气腔扩张,次级隔数目减少,肺泡间隔显著增厚,出现纤维化.高氧暴露14和21 d时,α-SMA在肺泡间隔和肺泡表面表达显著增强,呈条素状分布;但空气组仅在次级间隔的顶端呈点状分布.随高氧暴露时间延长,Col Ⅰ表达增加,并且高氧组肺组织α-SMA表达与Col Ⅰ mRNA表达呈明显正相关(r=0.59,P< 0.05).结论 新生大鼠高氧暴露导致肺损伤符合早产儿BPD的病理改变,成肌纤维细胞分布紊乱可能在BPD的发病过程中起重要作用.     

高体积分数氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞硫氧还蛋白及其还原酶表达的影响

目的 探讨高体积分数氧(高氧)对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)硫氧还蛋白(Trx)及硫氧还蛋白还原酶(TrxR)表达的影响.方法 无菌条件下取孕19 d SD大鼠的胎鼠肺组织,剪碎.采用1 g/L胰酶和1 g/L胶原酶消化19 d胎鼠肺组织块,经差速离心和反复贴壁法,分离、纯化、原代培养胎鼠AEC Ⅱ,待其生长至亚融合状态时,随机分为空气和高氧组.于培养箱内静置30 min后,空气组置于同一室内空气中,高氧组通以1 000 mL/L纯氧(2 l/min)10 min;然后密封培养瓶,置培养箱中培养.二组分别培养12、24、48 h,倒置相差显微镜下观察高氧对其细胞形态及活性的影响;并采用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测其Trx mRNA和TrxR mRNA表达.采用SPSS 13.0软件进行组间两样本均数t检验.结果 细胞爬片上AEC Ⅱ纯度为(94±2)%,表明所获细胞适合研究使用.与空气组比较,随时间延长,高氧暴露各时间点AEC Ⅱ生长状态明显不良;悬浮细胞增多,但大多数细胞仍具有活力;高氧暴露可促使AEC ⅡTrx mRNA、TrxR mRNA表达增加,且二者分别于24 h(t=2.471 P=0.033)和48 h(t=2.916 P=0.015)表达最强.结论 高氧暴露可促使胎鼠AEC ⅡTrx mRNA和TrxR mRNA表达上调;Trx和TrxR的表达上调可能是高氧肺损伤的重要保护作用机制之一.     

早产鼠高氧暴露后肺组织血管内皮生长因子和一氧化氮合酶的动态变化及相互关系

目的：最近研究表明,血管内皮生长因子（VEGF）及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)功能的缺失,在支气管肺发育不良（BPD）发病机制中发挥了重要的作用。该文通过动态观察持续中浓度高氧暴露（60％O2）对早产大鼠肺内VGEF蛋白及mRNA和eNOS蛋白及mRNA表达的影响,探讨BPD的发病机制。方法：将21 d 孕早产鼠随机分为高氧暴露组(简称高氧组) 和空气对照组(简称空气组) ,分别置于常压高氧仓中（60％O2）和正常空气中暴露。分别于生后1,4,7,11,14 d每组各处死6只大鼠,留取肺组织标本。苏木精-伊红染色观察病理改变,免疫组化检测VEGF和eNOS蛋白表达,逆转录-聚合酶链反应方法检测VEGF和eNOS mRNA表达。结果：早产鼠高氧暴露4 d后出现肺泡间隔减少,微血管发育异常,间质纤维化,且病变随着高氧暴露时间的延长而加重。高氧组大鼠第4,7天时肺组织VEGF蛋白表达明显低于相应空气对照组(P< 0. 05), VEGF mRNA表达亦显著减少(P< 0. 05)。随着暴露时间的延长,VEGF蛋白和mRNA进行性降低。高氧组大鼠在高氧暴露过程中肺组织eNOS蛋白和mRNA表达亦随着暴露时间的延长而降低。结论：高氧暴露导致早产鼠肺组织VEGF和eNOS表达持续性减少,微血管发育异常和肺泡化受阻。这些由高氧暴露诱导产生的BPD样损害,可能与VEGF和eNOS的表达下调有关,且二者之间存在着密切的联系。［中国当代儿科杂志,2007,9（5）：473-478］     

Notch信号在胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞与成纤维细胞共培养体系中的表达

目的 建立肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC Ⅱ)与肺成纤维细胞(LF)共培养模型,检测胎鼠AECⅡ共培养和单独培养时Notch1、3受体表达的变化.方法 应用Millipore插入式培养皿和Costar六孔板构建AEC Ⅱ/LF共培养模型,将未接种LF的Millicell2PCF插入式细胞培养皿置于接种有AEC Ⅱ的培养板为AEC Ⅱ单独培养组.光镜、透射电镜观察共培养与单独培养条件下AECⅡ大体形态、超微结构;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测其AEC Ⅱ增殖活力;反转录PCR法检测其AECⅡ分泌表面活性蛋白C(SP-C)功能,并用荧光定量PCR法检测其AEC Ⅱ Notch1、3 mRNA的表达.结果 AECⅡ/LF共培养组较AEC Ⅱ单独培养组稳定保持了其立方形结构和细胞表型并克隆样生长,增殖活力强.电镜下可见单独培养48 h AEC Ⅱ呈现AEC I样改变,而共培养AEC Ⅱ维持其正常生理形态.与单独培养组比较,共培养组AECⅡ分泌SP-C明显增多(P＜0.05),Notch1 mRNA表达显著升高(P＜0.05),而Notch3 mRNA显著降低(P＜0.05).结论 AECⅡ同型细胞培养时转分化为AEC I,不同型细胞(AECⅡ/LF)共培养抑制其转分化,此转分化过程受Notch信号分子调控.     

持续高氧暴露降低新生大鼠肺组织血管内皮生长因子的表达

目的：高氧肺损伤是导致支气管肺发育不良(BPD)的最常见原因。血管内皮生长因子(VEGF)在新生肺中具有促进内皮细胞增殖、分化、诱导血管发生的作用。本研究动态观察高氧暴露对新生鼠肺组织VEGF表达的影响,探讨BPD的发生机制。方法：新生Wistar大鼠出生后随机分为空气组和高氧组(均n=30)。高氧组在生后12h内开始,予以持续吸入95%氧气。分别于生后1、2、3、7、14、21d各处死5只大鼠,留取肺组织标本。苏木精-伊红染色观察病理改变,免疫组化检测VEGF蛋白表达,原位杂交方法检测VEGFmRNA表达。结果以切片视野灰度值表示,值越高说明蛋白或mRNA表达越少。结果：新生鼠高氧暴露7d后肺泡间隔减少,肺微血管发育异常,间质纤维化,且病变随高氧暴露时间延长而加重。高氧组大鼠第3,7天时肺组织VEGF蛋白表达明显低于相应空气对照组(81.9±0.8vs80.8±1.0,82.8±1.2vs79.2±1.6,均P<0.01)。VEGFmRNA表达亦显著减少(89.5±1.1vs88.0±1.0,91.1±1.5vs87.7±1.7,均P<0.001)。随着暴露时间的延长,VEGF蛋白和mRNA进行性降低,在高氧暴露14、21d时几乎检测不到VEGF蛋白和mRNA的表达。结论：高氧暴露抑制新生鼠肺VEGF的表达,这可能与高氧诱导BPD的发生有关。     

高氧致慢性肺疾病新生鼠肺泡上皮细胞AQP1和 AQP5表达及其意义

目的 探讨高氧损伤状态下，肺组织内水通道蛋白1（AQP1）和AQP5mRNA的动态变化规律及其在肺水肿中的作用。方法 新生鼠320只，依据吸氧浓度（FiO2）分组：实验组1（FiP2 0．8）、实验组2（FiO20．6）、实验组3（FiO20．4）、空气对照组（FiO20．21）。每组分别于实验后1、3、5、7、14d行AQP1mRNA、AQP，mRNART．PCR检测，同时检测肺组织Evans蓝含量。结果 高氧各组肺组织Evans蓝含量与空气组相比均显著增加，并随吸氧浓度、暴露时间的延长而增加。新生大鼠肺组织AQP1（高氧3d时）、AQP5（高氧5d时）基因表达明显低于对照组（F1=53．004，P=0．008；B=16．617，P=0．01），总趋势上AQP1、AQP5mRNA的表达实验组1、实验组2、实验组3依次降低。结论 AQP1、AQP，mRNA在高氧肺损伤时表达降低，并与肺水肿的严重程度密切相关。     

新生大鼠肺泡Ⅰ型细胞的原代培养及鉴定

目的探讨新生大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞(AECⅠ)的分离、纯化及原代培养方法,为主要以AECⅠ损伤为特征的肺部疾病研究提供模型。方法采用弹性蛋白酶联合胶原酶Ⅰ的消化方法,分离肺组织细胞,然后用肺Ⅰ型上皮细胞顶膜蛋白α(T1-α)单克隆抗体及免疫磁珠进行阳性选择的方法纯化AECⅠ,最后进行原代培养;通过锥虫蓝染色检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞生长及形态特征,细胞免疫荧光法检测细胞表面特异性抗原的表达。结果每只鼠可获得AECⅠ(1.4±0.4)×106个,纯度90.5%±3.4%,活力93.4%±3.0%。接种于玻璃培养皿48h后倒置显微镜下观察细胞开始粘附伸展,呈克隆样生长,在4～6天时汇合成薄的单层状。免疫荧光显微镜观察新鲜分离的AECⅠ特异标志物水通道蛋白-5(AQP5)阳性,呈现绿色荧光;AECⅡ标志物前表面活性蛋白C(proSP-C)阴性;培养后的AECⅠ免疫荧光染色呈AQP5阳性。结论利用弹性蛋白酶联合胶原酶Ⅰ消化,免疫磁珠进行阳性选择的方法可成功分离出高产量、高纯度的鼠AECⅠ,能满足体外进一步对AECⅠ生理功能的研究,也可为研究AECⅠ损伤修复机制提供细胞培养的模型。     

高氧暴露早产大鼠肺泡上皮细胞损伤与细胞外基质变化的动态研究

目的 动态观察高氧暴露新生早产大鼠肺组织肺泡上皮细胞(AEC)超微结构与细胞外基质(ECM)的变化,探讨其在高氧性肺损伤肺纤维化发病机制中的作用.方法 将80只新生早产SD大鼠随机分为空气组和高氧组,空气组在空气中饲养,高氧组置于高氧箱(保持氧体积分数>950 nd/L)中饲养,每组40只;每组又随机分为3、7、14、21 d 4个亚组,每组10只.分别在第3、7、14、21天处死动物,收集肺组织标本.采用透射电镜观察各亚组大鼠AEC超微结构改变;采用碱水解法测定其肺组织匀浆羟脯氨酸(HYP)含量;采用免疫组织化学方法检测肺组织Ⅰ型与Ⅲ型胶原表达与分布;并用图像分析方法检测肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性表达的PU值.结果 高氧组第3天即出现AEC轻度损伤;第7天时AEC损伤加重,第14、21天时出现AEC-Ⅱ坏死,板层小体基本排空,AEC基底膜及气血屏障明显增厚,肺间质可见大量胶原原纤维.肺组织HYP含量随着高氧暴露时间的延长而逐渐增加,第21天时达最高,在第7、14、21天时均明显高于空气组.Ⅰ、Ⅲ型胶原均在第3天呈弱阳性表达,第14、21天呈强阳性表达.肺组织Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性表达的PU值在第14、21天时明显高于空气组(P<0.01).结论 AEC损伤是早产大鼠长时间高氧暴露所致肺损伤的早期特征,而后期以肺间质ECM过度沉积为主.     

高体积分数氧致慢性肺疾病早产鼠肺上皮细胞凋亡及其调控机制

目的 探讨高体积分数氧致慢性肺疾病(CLD)早产鼠肺泡上皮细胞(AEC)凋亡的动态变化规律及Caspase-3 mRNA、Bax和Bcl-2基因的调控作用.方法 将60只早产SD鼠生后1 d内随机分为高体积分数氧暴露组(高氧组)和空气组(对照组)各30只,制备高体积分数氧致CLD早产鼠模型,应用脱氧核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术及链霉亲和素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学方法,检测生后1、3、7、14及21 d AEC的凋亡指数(AI)和肺组织Caspase-3 mRNA、Bax及Bcl-2基因蛋白的表达.相关分析采用Spearman分析.结果 与对照组比较,高氧组3 d AEC的AI、肺组织Caspase-3 mRNA水平及Bax基因蛋白表达开始升高,7～21 d明显增加,Caspase-3 mRNA水平在此期间持续于高水平;Bcl-2基因表达7 d开始降低,14～21 d明显降低.高氧组AEC的AI与肺组织Caspase-3 mRNA及Bax表达均呈正相关,与Bcl-2表达呈负相关.结论 高体积分数氧可致CLD早产鼠肺组织Caspase-3 mRNA基因表达增强,使Bax和Bcl-2介导Bax/Bcl-2基因表达比例失衡,是CLD早产鼠肺上皮细胞凋亡的重要机制之一.     

Matrigel胶对高氧损伤早产鼠肺泡Ⅱ型细胞黏着斑激酶表达变化及其对肺泡Ⅱ型细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨人工重组基底膜Matrigel胶对高氧暴露下早产鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial CellⅡ,AECⅡ)黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)表达变化及其对AECⅡ增殖、凋亡的影响.方法 原代培养早产鼠AECⅡ,建立高氧细胞模型,采用免疫印迹分析Matrigel胶对AECⅡFAK蛋白、磷酸化FAK( FAK- Tyr397)蛋白、FAK mRNA表达的影响,以了解Matrigel胶对FAK活性的调节作用;并进一步用细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫细胞化学法和原位缺口末端标记(TUNEL)法分别检测FAK抑制和激活状态下AECⅡ增殖和凋亡状况.结果 接种于Matrigel胶后,AECⅡFAK蛋白、FAK-Tyr397蛋白及FAK mRNA表达水平均明显增加;与空气对照组比较,高氧暴露12h时,AECⅡPCNA表达强度明显下降(0.1498±0.009 vs 0.0953±0.006,P＜0.05),TUNEL标记细胞明显增多(1.232 ±0.6 Vs 13.40±3.2,P＜0.01);接种于Matrigel胶后AECⅡ凋亡指数差异无统计学意义,而PCNA表达强度明显增强(0.1498±0.009 Vs 0.1921±0.008,P＜0.01).与高氧组比较,高氧+Matrigel组AECⅡPCNA表达明显增高(0.0953±0.006 Vs0.1125±0.012,P＜0.05),凋亡指数明显下降(13.40±3.2 Vs 7.641±1.6,P＜0.05).结论 高浓度氧抑制AECⅡ增殖、诱导其凋亡,并抑制AECⅡFAK的表达;Matrigel胶具有抑制AECⅡ凋亡、促进AECⅡ增殖作用,对高氧暴露下AECⅡ具有保护作用,且与其促进FAK表达和活化有关.     

肺泡Ⅱ型上皮细胞的生长状况及其转分化的鉴定

目的 观察肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)体外培养的生长状况及转分化过程.方法 通过差速贴壁法对原代培养的AECⅡ进行分离、纯化,并将AECⅡ随机分为第0天、第2天、第4天、第6天、第8天8个时间点.利用倒置显微镜观察细胞生长情况,记录细胞数目,绘制生长曲线;锥虫蓝染色观察细胞活力;流式细胞仪观察细胞生长周期和细胞凋亡情况;电子显微镜观察细胞超微结构;采用免疫荧光技术,共聚焦显微镜观察肺表面活性蛋白(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)的阳性表达.结果 倒置显微镜下第 0天、第2天、第4天、第6天及第8天细胞数分别为(4.02±0.99)×108L-1、(10.41±0.24)×108L-1、(27.90±1.91)×108L-1、(27.12±0.85)×108L-1及(26.29±1.59)×108L-1,第2天与第0天、第4天与第2天细胞数比较差异均有统计学意义(Pa<0.05).第2天、第4天、第6天及第8天的细胞活力分别为(97.00±0.71)%、(97.20±0.84)%、(95.00±0.71)%及(92.80±1.30)%,第6天与第4天、第8天与第6天比较差异有统计学意义(Pa<0.05).细胞周期:空气组细胞G1期、S期细胞所占比率分别在第6天、第4天最高,但各时间点与前一时间点比较差异均无统计学意义(Pa>0.05).细胞凋亡:空气组Annexin-V+/PI-亚群在第4天所占比例最高,与第2天及第6天比较差异均有统计学意义(Pa<0.05);Annexin-V+/PI+亚群细胞所占比例在第8天时最高,但与第6天比较差异无统计学意义(P>0.05),而第6天与第4天比较差异有统计学意义(P<0.05).细胞超微结构:第6天时可见介于AECⅡ和AECⅠ之间的中间状态细胞,此类细胞在细胞表面有微绒毛,但胞质内无板层小体或胞质内有板层小体但细胞表面无微绒毛.免疫荧光:第6天可见部分细胞胞质内有呈绿色荧光的SP-C阳性表达,荧光强度较第2天、第4天减弱,伴有胞膜点状分布的呈红色荧光的AQP5阳性表达,细胞表达强度不等,表达AQP5相对较弱的细胞表达SP-C的强度相对增强.结论 原代培养的AECⅡ在培养早期增殖能力最强,细胞增殖分化能力在培养晚期降低.体外培养的AECⅡ有向AECⅠ转分化的能力.     

高氧致慢性肺疾病早产鼠肺组织水通道蛋白-5及表面活性蛋白-A、B基因表达的意义

目的 探讨慢性肺疾病(CLD)早产鼠肺上皮细胞特异性标志物表面活性蛋白A、B(SP-A、SP-B)通道蛋白-5(AQP5)基因表达规律及其意义.方法 将80只早产鼠随机分为模型和对照组(每组40只),采用高体积分数氧诱导慢性肺疾病模型,于实验后1、3、7、14、21 d应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测其肺组织SP-A、SP-B及AQP5 mRNA表达.结果 生后初期2组SP-A、SP-B及AQP5均无统计学差异(Pa＞0.05),7 d实验组SP-A及SP-B明显高于对照组(Pa＜0.05),14 d时显著高于对照组(Pa＜0.01),21 d时仍明显高于对照组(Pa＜0.05);同时间点与对照组比较,AQP5均维持在较低水平(Pa＜0.05).结论 高体积分数氧诱导早产鼠的Ⅱ型肺泡上皮细胞(AEC-Ⅱ)向Ⅰ型肺泡上皮细胞(AEC-Ⅰ)分化障碍可能是CLD肺上皮修复异常的重要机制.     

高迁移率族蛋白B1在高氧致支气管肺发育不良的表达

目的：检测高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在高浓度氧（60% O2）暴露新生小鼠肺组织损伤模型中的表达水平,探讨HMGB1在支气管肺发育不良（BPD）发病机制中的作用。方法：新生足月C57BL/6小鼠随机分为BPD组和对照组,制备高氧浓度致新生鼠BPD模型,应用苏木精-伊红染色、Masson染色、放射性肺泡计数（RAC）、免疫荧光和实时荧光定量PCR技术,观察氧暴露后3 d、7 d、14 d肺组织病理改变及HMGB1的蛋白和mRNA表达水平。结果：BPD组在氧暴露后随时间推移,出现肺泡上皮肿胀,肺泡壁增厚,间质水肿,炎症细胞浸润,胶原样物质产生,肺泡结构紊乱,数量减少,较空白对照组明显发育迟滞。在氧暴露后7 d、14 d,HMGB1及其mRNA表达均强于对照组（P＜0.05）。结论：高氧暴露所致BPD中,HMGB1表达增加。BPD的病理过程可能与HMGB1表达增加有关。［中国当代儿科杂志,2010,12（3）：219-223］     

rh-CCSP对高氧暴露下新生大鼠肺损伤的影响

目的研究rh-CCSP对高氧暴露下新生大鼠肺损伤的影响,探讨高氧肺损伤的可能机制。方法将生后1 d的Wistar大鼠80只,随机分为4组。Ⅰ组:空气组;Ⅱ组:高氧组;Ⅲ组:空气+rh-CCSP组;Ⅳ组:高氧+rh-CCSP组。Ⅱ组和Ⅳ组大鼠持续暴露于85%O2中,Ⅰ组和Ⅲ组大鼠呼吸空气。Ⅲ组和Ⅳ组大鼠从出生第2天始每天雾化吸入rh-CCSP,rh-CCSP用双蒸水稀释,其浓度为1 mg/ml,每次雾化吸入10 min。于高氧暴露后7 d、14 d取肺组织,HE染色后测定肺泡辐射状计数(RAC值)和形态定量分析,用免疫组化方法检测肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)表达,用TUNEL方法检测肺细胞凋亡。结果Ⅱ组RAC值较I组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01);Ⅳ组的RAC值与Ⅱ组相比,明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅱ组肺泡面积比较Ⅰ组明显增多,差异有统计学意义(P<0.01);Ⅳ组的肺泡面积较Ⅱ组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。高氧暴露7 d时Ⅱ组肺组织细胞凋亡指数51.22±2.17明显高于Ⅰ组的21.39±3.18,差异有统计学意义(P<0.01);Ⅳ组的细胞凋亡指数28.98±3.86明显低于Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.01)。高氧暴露14 d时空气组和高氧组比较SP-A表达减弱(U=2.191,P<0.05);高氧+rh-CCSP组和高氧组比较,SP-A表达增强(U=2.048,P<0.05)。结论高氧暴露后肺内CCSP表达下降,阻碍肺泡发育,补充rh-CCSP可有效抑制肺细胞凋亡,还能增加肺内SP-A分泌,减轻肺损伤,可预防和治疗BPD的发生。     

高氧对早产大鼠肺组织细胞色素氧化酶亚基Ⅰ表达的影响

目的探讨85%高体积浓度氧暴露对早产新生大鼠肺组织中线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)动态表达的影响。方法早产SD大鼠生后d2随机分为空气组、高氧组。高氧组持续暴露于85%氧气中,空气组置于同一室内常压空气中。两组分别于暴露满1、4、7、10和14 d时,提取肺组织RNA,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定COXⅠmRNA表达;采用免疫组织化学、免疫印迹(Western-blot)法检测COXⅠ蛋白表达。结果1.与空气组相比,高氧d1和d4 COXⅠmRNA的表达显著增强(P<0.05,0.01),其后开始下降,d7时两者无显著性差异(P>0.05),d10时较空气组显著降低(P<0.01),d14时又增高(P<0.01)。2.COXⅠ蛋白水平表达,与空气组相比,高氧d1和d4时,COXⅠ表达显著增强(P<0.01,0.05),d7时两者无显著性差异(P>0.05),其后开始下降,d10和d14时较空气组显著降低(P<0.01,0.05)。结论85%高体积浓度氧暴露诱导早产新生大鼠线粒体DNA编码COXⅠ异常表达,这种变化可能参与高氧肺损伤的发生。     

肺泡Ⅱ型上皮细胞原代培养及高体积分数氧-停氧对其细胞内钙离子水平的影响

目的 原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ),并动态观察高体积分数氧(高氧)-停氧对其细胞内钙离子([Ca2 ]I)的影响,为体外研究AECⅡ及阐明高氧肺损伤发病机制提供实验基础.方法 孕19 d SD大鼠麻醉消毒后超净台内剖腹取出所有胎鼠.用胎鼠肺组织进行AECⅡ分离、纯化及原代培养,倒置相差显微镜下观察其细胞的形态及生长状况.通过激光共聚焦显微镜观察其肺表面活性蛋白C(SP-C)免疫荧光的阳性表达鉴定AEC Ⅱ.鉴定为AECⅡ的细胞通以高氧(氧流量为3 mL/min,测氧仪检测氧体积分数为930～970 mL/L),持续约5 min后立即停氧,用激光共聚焦显微镜动态观察[ca2 ]I的变化情况,记录其随时间改变的动态变化曲线,同时观察钙离子荧光强度的变化并连续拍摄照片.结果 例置相差显微镜观察AEC Ⅱ呈岛状分布,铺路石状,细胞核及核仁明显,胞核圆形,胞浆内较多颗粒.激光共聚焦显微镜下可见AECⅡ胞浆中呈现绿色荧光的SP-C阳性表达.予AECⅡ高氧刺激时,[Ca2 ]I出现短暂下降后持续上升,上升至一定程度后又缓慢下降,甚至出现[Ca2 ]I耗竭现象,并维持该水平.予停氧刺激,[Ca2 ]I出现短暂下降后迅速上升,然后逐渐趋于平稳.随着[Ca2 ]I水平的增减,Ca2 荧光强度相应的增强或减弱.结论 高氧及给氧后停氧均可使[Ca2 ]I产生明显变化,可能是高氧导致AECⅡ损伤的重要途径之一.