EB病毒衣壳蛋白P23重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的 构建pPICZα A-BLRF2重组表达载体,实现BLRF2重组蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达,为进一步研制高效能重组抗原诊断试剂,研发亚单位疫苗奠定基础.方法 以B95-8细胞提取的EBV DNA为模板,采用PCR法扩增出目的基因片段BLRF2,与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,电转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达,表达产物经Western blotting进行鉴定.结果 成功构建pPICZαA-BLRF2重组质粒,并在毕赤酵母菌中成功表达了分泌型BLRF2重组蛋白.结论 在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了P23蛋白,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZα A-BLRF2生产酵母工程菌株,为进一步应用研究奠定了基础.     

人核迁移蛋白C在毕赤酵母中的融合表达

目的：研究获得人体核迁移蛋白C在毕赤酵母中的高效表达的方法。方法：将重组表达质粒pPICZαA-hNUDC-his用BxtXⅠ单酶切,电击转入Pichia pastoris KM71,采用Zeocin筛选获得转化子。结果：通过优化诱导表达条件使目的蛋白获得较高的表达量。结论：通过优化诱导蛋白表达条件可大幅提高易降解蛋白hNUDC在毕赤酵母KM71中的表达量。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白(CPV VP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPV VP2基因进行扩增,将CPV VP2基因克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPV VP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPV VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64.35 kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPV VP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

乙型脑炎病毒E蛋白毕赤酵母表达系统的构建

目的：构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统。方泼：应用RT-PCR法扩增乙型脑炎病毒E蛋白表达基因,定向克隆入载体pPICZαA,将重组质粒以PineⅠ线性化并电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,用Zeocin筛选转化子进行鉴定。结果：PCR扩增产物约为1350bp,定向克隆获得pPICZαA-E表达载体,经测序结果与Genbank相应序列比较,核苷酸序列同源性为100％,电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株GS115-E,提取其基因组DNA经PCR鉴定与预期相符。结论：成功构建乙型脑炎病毒E基因毕赤酵母表达系统,为进一步进行E蛋白真核表达研究奠定基础。     

PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中引导分泌表达天然N-端rBPTI

目的：在毕赤酵母(Pichia pastoris)中分泌表达天然N-端rBPTI。方法：将PHOⅠ/bpti基因克隆到真核表达载体pPICZα,电转化毕赤酵母菌株X-33。 结果：构建了含PHOⅠ/bpti基因的表达质粒,并在 X-33中分泌表达rBPTI。用胰蛋白酶抑制实验筛选出表达rBPTI的工程菌。表达上清经阳离子交换层析分离纯化为单一组份,SDS-PAGE显示相对分子质量为 6 500。结论：PHOⅠ信号肽在毕赤酵母中成功地诱导分泌表达了具有正确N-端氨基酸序列的rBPTI。     

vasostatin在毕赤酵母中的表达及其抗血管生成的研究

目的:用酵母表达系统表达具有生物活性的vasostatin,并检测其抗血管生成活性.方法:将vasostatin基因克隆入酵母诱导型表达载体pPIC9K中,经过Sac Ⅰ线性化、电转化毕赤酵母蛋白酶缺陷菌株Pichia pastoris KM17、筛选阳性克隆、PCR鉴定和DNA序列分析,获得了vasostatin基因重组到酵母染色体中的阳性重组子,阳性重组子经甲醇诱导和分离纯化,获得了重组vasostatin蛋白,CAM实验检测重组蛋白抑制血管新生活性.结果:酵母表达的重组vasostatin产量达12 mg·L-1,CAM实验表明重组vasostatin能够显著抑制新生血管生成.结论:酵母表达系统能高效表达具有抑制新生血管生成活性的重组vasostatin蛋白.     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。     

人透明带蛋白3真核表达载体的构建

目的 构建人ZP3蛋白(从第23位到348位氨基酸)真核表达载体,用于在毕赤酵母中表达重组人ZP3蛋白.方法 通过PCR方法扩增编码人ZP3蛋白的基因,并将其克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ构建真核表达质粒pPICZα-hZP3.结果 经PCR扩增获得的hZP3基因大小为978 bp,其DNA测序结果分析表明:pPIC...     

戊型肝炎病毒 ORF2截短蛋白 p154在毕赤酵母中的分泌性表达及其抗原性

目的：利用毕赤酵母系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2编码蛋白第452～605氨基酸多肽（p154）,探讨毕赤酵母表达系统用于研发戊型肝炎基因工程疫苗的可能性。方法：采集戊型肝炎患者粪便,进行RT-PCR检测和测序鉴定,并依此为模板扩增ORF2 p154基因,克隆到表达载体pPICZαA上,电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经筛选鉴定后将携带目的基因的重组克隆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。结果：利用基因重组技术构建了含HEV p154片段的pPICZαA重组质粒,并在毕赤酵母菌株GS115中实现了分泌性表达,表达的目的蛋白p154分子质量约为22 kDa,上清中p154表达量可达到200μg· ml -1。 p154可与HEV感染兔恢复期血清及HEV单克隆抗体6F9进行反应,表明酵母表达的p154具有良好的抗原性。结论：HEV ORF2 p154在毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,为进一步研发真核表达的戊型肝炎基因工程疫苗奠定了实验基础。     

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

目的 构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1R Ⅰ)的pPICZαA-sIL-1R Ⅰ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-IR Ⅰ蛋向.方法 采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1R Ⅰ.经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-IR Ⅰ,转化E.coli Stb13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选.确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达.提取菌体蛋白和上清液进行Western blotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达.结果 pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-IR Ⅰ成功电转入酵母菌GS115:转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts:对培养上清和菌体蛋白进行Western blotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白.结论 成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1R Ⅰ蛋白,为sIL-IR Ⅰ的研究和应用提供实验基础.     

结核分枝杆菌Ag85A在毕赤酵母中的表达、纯化及酶联免疫斑点试验研究

目的利用毕赤酵母表达和纯化结核分枝杆菌AgS5A蛋白,以期得到高效刺激T淋巴记忆细胞产生1．干扰素的特异性抗原。方法用PCR扩增得到Ag85a基因,构建出重组质粒pPic9k085a,通过电转化进入毕赤酵母,经遗传霉素G418抗性筛选、硫酸铵沉淀浓缩及离子交换层析纯化得到目的蛋白。最后以大肠杆菌和毕赤酵母表达的A邸5A分别为抗原刺激物进行酶联免疫斑点（Elispot）试验,分析其刺激BCG免疫小鼠T淋巴细胞产生Υ-干扰素（IFN-Υ）的能力。结果在毕赤酵母中成功克隆并稳定表达了Ag85A蛋白,Elispot检测结果表明,毕赤酵母比大肠杆菌产生的Ag85A蛋白,对小鼠T淋巴细胞的刺激效果更加明显（P〈0．05）,能产生更多的免疫斑点。结论毕赤酵母表达的Ag85A蛋白可以更高效的刺激T淋巴细胞,可用于检测结核杆菌感染诱导的细胞免疫应答。     

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白.方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE(12%)和Western blot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化.Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L.活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖.结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白.     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性

目的:在毕赤酵母表达系统中表达贻贝抗菌肽Myticin A并检测其生物学活性.方法:提取贻贝总mRNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增得到DNA片段.PCR产物与pMD18-T连接,得到阳性重组载体pMD18-Myticin A.Myticin A基因插入载体pPIC9K中,得到的重组载体pPIC9K-Myticin A转化至宿主菌中.得到高抗性阳性菌株并进行诱导表达.发酵上清进行Tricine-SDS-PAGE分析并用CM-sepharose柱和Sephadex G-25柱纯化,Western印迹法鉴定并检测生物学活性.结果:获得重组载体pPIC9K-Myticin A.高抗性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K-Myticin A经甲醇诱导后,Tricine-SDS-PAGE证实其相对分子质量为4 500,表达量为14%以上,纯化后纯度达到90%以上.Western印迹法证实所表达样品为Myticin A.表达样品对巨大芽胞杆菌的生长有抑制作用,对小鼠成纤维细胞(L929)、胰腺癌细胞(SW1990)、结肠腺癌细胞(LoVo)的生长均有明显抑制作用.结论:应用毕赤酵母表达系统能较好地表达抗菌肽Myticin A,生物学活性研究证实其具有抗革兰阳性菌作用,明显抑制肿瘤细胞生长.     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

人前列腺特异性抗原基因重组表达载体pPICZαC-m PSA的构建和表达

目的在毕赤酵母细胞中表达PSA,为临床的检测和治疗提供材料.方法经RT-PCR获得PSA全长cDNA并测序.将编码成熟PSA 237氨基酸的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,该载体含有AOX1启动子和α-factor信号肽序列,构建表达载体体pPICZαC-m PSA.甲醇诱导X33细胞表达rPSA,ELASA试剂盒筛选高表达rPSA的细胞株.结果获得了人PSA全长序列,构建了表达载体pPICZα-m PSA.获得了高表达rPSA的酵母X33细胞株,表达产量为1.2 mg/L.结论建立了重组人前列腺特异性抗原的毕赤酵母表达体系,规模化的生产有助于PSA的生物学特性的研究和临床检测和治疗的应用.     

恶性疟疾多价疫苗的构建及表达

目的 构建恶性疟原虫多表位融合抗原基因(PfCP2E9),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法 选取本实验室前期构建的融合蛋白PfCP-2.9与疟原虫红内期疫苗候选抗原EBA175IIF2,按一定的次序拼接成该融合基因,并克隆至酵母表达载体,用电转化方法将拼接基因导入毕氏酵母中进行分泌表达.结果 拼接的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达.结论 构建的恶性疟原虫多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.     

人碱性成纤维细胞生长因子cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的：克隆和表达人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF),以便进一步研究其功能。方法：从人神经胶质瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出hbFGF cDNA片段,与pMD18-T载体连接后作DNA序列分析,并用亚克隆的方法构建pPICZα-hbfFGF,将测序正确的重组质粒用SacI线性化后电转化至毕赤酵母X-33,经PCR法、SDS-PAGE和Western blotting分析表达产物,从而筛选出能够稳定、高效分泌表达hbFGF的酵母工程菌。结果：经测序证实获得的hbFGF序列与GenBank（登录号NM002006）报道的完全一致,甲醇诱导表达后培养液上清的SDS-PAGE凝胶电泳显示在相对分子质量约18 000有一蛋白条带,Western blotting结果显示表达产物与抗人碱性成纤维细胞生长因子抗体产生特异性条带,证明rhbFGF蛋白的表达。结论：成功克隆了hbFGF 基因,并在毕赤酵母体系中进行了表达。     

重组人可溶性凋亡素-2配体在Pichia系统中的表达

目的：在甲醇营养型酵母（Pichia)表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL,凋亡素－2配体）分子。方法：人可溶性TRAIL编码基因片段插入pIC3.5酵母表达载体,氯化锂转化酵母GS115株,甲醇诱导表达5d,SDS－PAGE和Western-blotting确认表达,L929细胞鉴定活性,结果：发现在酵母细胞中重组表达的TRAIL在SDS－PAGE上占总蛋白的50％以上,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL重组分子,杀伤肿瘤细胞的比活性较原核表达后复性的TRAIL有明显提高,并能诱导几株肿瘤细胞DNA片段化,说明TRAIL可能已正确折叠并形成活性必需的高级结构。结论：在Pichia系统中正确表达了可溶性TRAIL分子。