NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的：制备NIDD基因TaqMan探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR（FQ-PCR）,以进一步研究NIDD的表达情况。方法：采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区（CDS）片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqMan探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果：RT—PCR法扩增出一特异产物与预期长度112bp相符,DNA序列测序的结果与C,eneBank提供的已知序列（AB098078）比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112bp完全相同,与NIDD基因100％同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0．99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10％。结论：采用RT．PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqMan探针。     

Allglo探针与TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测猴免疫缺陷病毒的比较

目的比较Allglo 探针和TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测SIV 的灵敏度下限和重复性。方法把SIV 标准品进行梯 度稀释成6 个浓度,每个浓度同时提取12 个标本进行批内差异分析,每个标本提取12 次进行批间差异分析之后进行逆转录 并用TaqMan探针和Allglo 探针进行定量PCR检测。批内差异分析者每个标本同时进行逆转录和上机检测,批间差异分析 者分12 次进行逆转录和检测,对这两种探针的PCR结果利用ABI7300 定量PCR仪所携带的软件和相关的统计学方法进行 分析。结果TaqMan 探针和Allglo 探针法检测SIV 标准品的灵敏度下限均为50 copies/mL。重复性结果显示：批内结果差 异分析显示Allglo 探针法最大变异系数为0.63%,最小变异系数为0.33%,TaqMan 探针法最大变异系数为1.33%,最小变异 系数为0.2%;批间结果差异分析显示Allglo 探针法最大变异系数为1.77%,最小变异系数为0.95%,TaqMan探针法最大变异 系数为1.86%,最小变异系数为1.03%。结论在荧光定量RT-PCR 法检测猴免疫缺陷病毒中,Allglo 探针法可能优于 TaqMan探针法。     

检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种高敏感度的检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)DNA的实时荧光定量PCR方法,为针对HSV-2潜伏感染的治疗性疫苗和抗病毒药物疗效提供一个评价方法。方法 依据HSV-2糖蛋白D(gD)基因序列,使用序列比对软件,选取其保守区序列设计引物及TaqMan探针并进行筛选;以gD基因重组质粒pcDNA3-HSV-2 gD作为标准模板,对该检测方法的反应条件进行优化,提高其检测特异性、敏感度和重现性。结果 该检测方法特异性好,检测的最低拷贝数可达到2个拷贝,线性范围为2×10⁰~2×10⁸拷贝/反应,是普通PCR敏感度的10³倍。该检测方法组间和组内变异系数均低于5%,说明该检测方法具有良好稳定性。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法用于检测痕量HSV-2 DNA具有特异、敏感、定量和重现性好的优点。     

多探针荧光定量PCR法用于慢性前列腺炎病原菌学诊断的建立

目的建立一种新的改良的TaqMan荧光定量PCR方法，能高度敏感地同时检测并鉴定多种细菌．该方法有一套独特的多探针设计：一对由16SrDNA基因编码的高度保守序列作为引物；引物之间的一个高度保守区域被用来设计通用探针，一个高度可变区域被用来设计特异性探针．方法通过对10种慢性前列腺炎病人细菌培养常见的病原菌的DNA提取物进行FQ-FCR（荧光定量PCR）检测，用通用探针检测这10种细菌的DNA含量，在此同时用金黄色葡萄球菌特异性探针（SA probe）和大肠杆菌特异性探针（EC probe）分别特异性检测金黄色葡萄球菌（S．aureus）和大肠杆菌（E．coil）的DNA含量．[第一段]     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒PET-32a（＋）-16srRNA作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系。并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为102～109copies／μL,灵敏度为lcopy／μL,特异性为100％。高拷贝样品的天问CV为2．65％、批内CV为1．86％,低拷贝样品的天间CV为2．12％、批内CV为0．78％。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对结核病的早期快速诊断有较高价值。     

实时荧光定量TaqMan-PCR检测小鼠多瘤病毒方法的建立

目的 建立一种快速、特异、敏感的小鼠多瘤病毒 (murine polyomavirus, MPyV)荧光定量 TaqMan PCR检测方法, 用于MPyV核酸的检测。 方法 根据GenBank中小鼠多瘤病毒基因组序列设计了一对特异性引物及TaqMan探针, 扩增长度为69 bp的片段, 通过优化反应体系和反应条件, 对构建的重组质粒标准品进行检测, 并绘制标准曲线, 进行特异性、敏感性和重复性试验。最后用建立的方法对人工感染MPyV的肺脏、脾脏和粪便, 及86 份小鼠临床样本进行检测, 验证在临床应用中的效果。 结果 所建立的检测方法特异性强, 只能在小鼠多瘤病毒DNA中检出荧光信号, 检测灵敏度达到100拷贝, 批内和批间重复性好, 检测结果变异系数(CV)均小于1.13%, 人工感染MPyV小鼠的肺脏、脾脏和粪便均为阳性, 对86份临床样本进行检测, 有3份样本呈阳性(阳性率为3.5%)。 结论 建立的MPyV荧光定量TaqMan-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好, 适合用于MPyV临床诊断、日常监测和流行病学调查。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

荧光探针定量法检测小儿肺炎支原体临床应用研究

目的:探讨荧光探针定量(FQ-PCR)法检测小儿肺炎支原体的临床应用价值。方法:用荧光探针定量(FQ-PCR)法对小儿肺炎支原体DNA进行定量测定。同时用ELISA法MP-IgM(1周内、1周后)进行比较。结果:150例受检患儿中,FQ-PCR法阳性57例,阳性率占38%,DNA平均拷贝数4.65×106;1周内MP-IgM阳性15例,占10%;1周后MP-IgM阳性42例,占28%。FQ-PCR与1周后MP-IgM之间差异有显著性,X2=3.39(P<0.05),FQ-PCR与1周内MP-IgM有显著差异X2=32.27(P<0.005),1周之内与1周之后MP-IgM之间有显著性差异X2=13.91(P<0.005)。结论:应用FQ-PCR技术具有特异性强,灵敏度高,是早期快速诊断小儿肺炎支原体感染的可靠方法,值得推广使用。     

扎伊尔型、苏丹型埃博拉病毒TaqMan探针实时定量PCR核酸检测方法的建立

目的建立针对扎伊尔型(ZEBOV)及苏丹型埃博拉病毒(SEBOV)特异、灵敏和快速的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法。方法选用世界卫生组织(WHO)参比实验室所使用的引物和探针序列,建立针对扎伊尔型及苏丹型埃博拉病毒的NP基因序列保守区的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,验证检测方法的灵敏性、特异性和稳定性,并与常规PCR检测方法进行比较。结果所建立的实时定量PCR方法可用于ZEBOV及SEBOV的特异性检测,较传统PCR方法反应快捷、灵敏,分别可达:ZEBOV 34拷贝/反应、SEBOV 24拷贝/反应;具有良好的特异性、稳定性和可重复性。结论建立了ZEBOV及SEBOV Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,该方法可有望用于埃博拉病毒(EBOV)的实验室、临床及现场核酸检测。     

大鼠疑似泰勒氏病毒荧光定量检测方法的建立

目的 建立一种能在临床上快速、准确地检测大鼠疑似泰勒氏病毒（Theiler''s-like virus of rats,TLV）的方法,采用TaqMan探针荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）技术,特异性针对TLV病毒核酸进行检测。方法 通过基因合成序列作为质粒标准品的模板,同时选择特异性的序列在3622~3729 nt处,设计一对引物和TaqMan性探针,优化反应体系及条件,进行qPCR扩增,从而建立TLV TaqMan探针qPCR方法,并对其灵敏度、稳定性和特异性进行评价。结果 建立的TLV qPCR检测方法,标准曲线线性关系良好,R²值可达到0.99,灵敏性最低能够检测到10个拷贝数/μL,对比普通PCR方法,高出其100倍;对其他常见大鼠病毒均无非特异反应;重复性良好,批内和批间变异系数均小于1%。结论 利用TaqMan探针建立快速检测TLV的荧光定量PCR方法,该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性好等特点。     

HMGB1基因SNP位点实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立基于Taq Man探针实时荧光PCR技术的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测方法。方法收集2014年4月在深圳口岸医院体检的健康人群样本20份,选择HMGB1基因上的2个SNP位点设计常规PCR和实时荧光PCR扩增引物和Taq Man探针,采用基因测序和实时荧光PCR方法对样本进行SNP分型。结果实时荧光PCR方法SNP分型结果显示,在20份样本中的HMGB1基因rs1412125位点检测到TT基因型11例,CC基因型1例,TC基因型8例;HMGB1基因rs3742305位点检测到GG基因型15例,GC基因型5例,未发现CC基因型。这一结果与基因测序方法结论完全一致。结论基于Taq Man探针技术的实时荧光PCR方法进行HMGB1基因SNP分型简单、快速、高效,可用于人群大规模样本的SNP筛查,具有广泛应用的价值。     

胆汁螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立快速、敏感、特异的胆汁螺杆菌(Helicobacter bilis,H.bilis)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对胆汁螺杆菌进行定量检测。方法 PCR扩增H.bilis保守基因P17序列全长ORF435 bp,进行TA克隆,构建质粒标准品pMD-HBP17。通过对pMD-HBP17标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性及重复性;用所建立的qPCR方法检测77份临床样品,并与普通PCR的检测结果作比对。结果 所建立的qPCR检测方法,质粒DNA浓度在10⁸~10¹拷贝之间表现出较好的线性和相关性,所得标准曲线的斜率为-3.46,相关系数为0.999,检测灵敏度达到20个拷贝,对77份临床样品的检出率为14.3%,较普通PCR(7.8%)的检出率高。结论 建立的H.bilis qPCR检测方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可用于胆汁螺杆菌的定量及定性检测。     

乙型脑炎病毒TaqMan逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

目的采用TaqMan技术，研究建立实时荧光逆转录聚合酶链反应技术（RT—PCR）检测乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis，JEV）的效果。方法根据JEV非结构蛋白基因NS3基因序列（GenBank序列号，U15763），结合生物学软件序列比对分析，设计1对特异性引物和TaqMan寡核苷酸探针，优化荧光RT～PCR反应条件后，以模板梯度稀释法及相关毒株对比扩增检验测定方法的敏感度和特异性。结果引物和探针最佳浓度均为0．20uM，复性温度为55℃。方法至少检测出1 copy／止病毒RNA，与流感、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘等病毒均无交叉反应。从病毒核酸提取至完成检测仅需3hr左右。结论所建立的JEV病毒TaqMan荧光RT—PCR方法敏感特异，有助于JEV感染的实验室早期快速诊断。     

运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAP10基因2073A/G单核苷酸多态性

目的 建立一套以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的单核苷酸多态性(SNP)检测平台,并用于AKAP10基因2073A/G SNP的检测. 方法 设计一对TaqMan探针加入到PCR反应系统中,并设立阴阳对照,对AKAP10基因2073A/G SNP进行分型.同时验证部分样本PCR产物的直接测序结果 . 结果 运用TaqMan探针实时荧光PCR技术对AKAP10基因2073A/G SNP检测结果 准确,与PCR产物的直接测序结果 完全一致.AKAP10基因2073A/G多态性分布与性别年龄无关(P>0.05).非条件logistic回归分析提示,AKAP10基因2073A/G突变型(AG+GG)与野生型AA相比增加结直肠癌的发生风险(OR=1.52, 95% CI:1.07～2.15, P=0.019). 结论 通过合理设计TaqMan探针,设立阴阳性对照,应用TaqMan探针实时荧光PCR技术成功建立起一套SNP检测平台.AKAP10基因2073A/G多态性与结直肠癌发病存在显著相关性.     

香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的建立与应用

目的建立快速、灵敏、特异的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR体系,用于食源性致病菌监测和淡水鱼产品贸易往来的快速检测。方法根据GenBank公布的香港海鸥形菌16SrRNA基因高保守序列,设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,建立和优化快速检测体系,评价反应体系的特异性、灵敏度、重复性,并在淡水鱼类、急性胃肠炎腹泻患者标本中临床应用,结合细菌分离方法和序列测定分析进行验证。结果建立的香港海鸥形菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应体系检测时限短,仅40min就可出结果,特异性好,与沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌等非目标菌无交叉反应,灵敏度高,检测下限达10拷贝／反应,稳定性好,同一浓度阳性质粒进行16次重复检测的Ct值变异系数0．183％。92份淡水鱼及211份医院急性胃肠炎腹泻标本实时荧光PCR与常规细菌分离结果完全一致,均检出了12株香港海鸥形菌。16SrRNA测序结果显示与HKU1株同源性在99．5％以上,进一步验证了实时荧光PCR的特异性。结论本研究建立的香港海鸥形菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR反应体系快速、特异、灵敏,在防止食源性疾病的传播和加快贸易通关速度方面,具有较强的的应用价值。