人巨细胞病毒感染致血管内皮细胞损伤机制的研究

摘要：目的观察人巨细胞病毒（HCMV）感染对人血管内皮细胞氧化应激的影响及对血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和糖基化终产物受体（RAGE）时序性表达的影响,研究HCMV感染致动脉粥样硬化（AS）的作用机制。方法用HCMV感染血管内皮细胞,用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的改变;采用RT-PCR方法检测不同感染时段细胞VCAM-1及RAGEmRNA的表达。结果HCMV感染血管内皮细胞后,HCMV组荧光强度显著高于对照组（P＜0.01）。感染0h时,VCAM-1mRNA有基础水平的表达,4h开始升高,8h时达高峰,12h开始回落,24h回落更明显,与0h比较,均有统计学意义（P＜0.01）,48h接近0h表达水平（P＞0.05）。感染0h时,RAGEmRNA有基础水平的表达,4h开始升高,8h时表达水平明显升高,随感染时间延长,表达量逐渐增高,感染24h时达高峰,48h开始回落,仍维持在较高的水平,各时段与0h比较,均有统计学意义(P＜0.01)。结论HCMV感染血管内皮细胞后能够增强氧化应激,促进VCAM-1及RAGE的mRNA表达,并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过增强氧化应激、上调VCAM-1及RAGE的表达介导血管内皮细胞的炎症反应,促进动脉粥样硬化的发生、发展。     

人巨细胞病毒和糖基化终产物共同作用对血管内皮细胞的影响

目的：观察人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）和糖基化终产物（advanced glycation end products, AGEs）共同作用对血管内皮细胞（vein endothelial cells，ECV）氧化应激的影响及对糖基化终产物受体（the receptor for advanced glycation end products, RAGE）表达的影响，明确HCMV和AGEs在致内皮细胞损伤作用中是否具有协同效应，探讨HCMV和AGEs致动脉粥样硬化 （AS）发生和发展的可能机制。方法：用HCMV和AGEs分别及共同作用于ECV，将实验对象分为：对照组、HCMV组、牛血清白蛋白（BSA）组、AGEs组、AGEs＋HCMV组5组；用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的改变；采用RT-PCR方法检测血管内皮细胞RAGEmRNA的表达。结果：HCMV感染ECV后，对照组荧光强度和BSA组荧光强度均较弱，两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；AGEs组和HCMV组荧光强度强于对照组（P<0.01）；AGEs＋HCMV组荧光强度高于AGEs组和HCMV组（P<0.05），两者联合作用存在协同效应。对照组和BSA组ECV细胞RAGEmRNA均有低水平表达，两组之间比较无差异（P>0.05）；AGEs组和HCMV感染组RAGEmRNA表达量高于对照组（P<0.01）；AGEs＋HCMV组表达量高于AGEs组和HCMV组（P<0.01）。在相同病毒滴度感染的情况下，随AGEs浓度增加RAGEmRNA的表达增高，呈浓度依赖性；在相同AGEs浓度作用时，随HCMV感染滴度增加RAGEmRNA的表达水平升高，呈滴度依赖性。各组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：HCMV和AGEs均能够增强血管内皮细胞氧化应激，促进RAGEmRNA的表达，两者共同作用时呈协同效应。HCMV和AGEs有可能通过协同增强氧化应激、进一步上调RAGEmRNA的表达，介导血管内皮细胞的炎症反应，促进动脉粥样硬化的发生、发展。     

巨细胞病毒感染致人脐静脉内皮细胞E选择素时序性的表达

目的：观察人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）作用于血管内皮细胞（vein endothelial cells,ECV）对E选择素时序性的表达,探讨HCMV感染致动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发生和发展的可能机制。方法:用HCMV感染ECV,采用RT-PCR方法检测不同感染时段细胞E选择素mRNA及蛋白的表达。结果:HCMV感染ECV后,感染0h时E选择素mRNA有基础水平的表达,4h升高并达高峰,8h时开始回落,12h回落显著,24h回落更明显,与0h比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）,48h接近0h表达水平（P＞0.05）。结论:HCMV感染ECV后能够促进E选择素表达,并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过上调E选择素的表达,介导ECV的炎症反应,促进AS的发生、发展。     

原代人脐静脉内皮细胞的分离培养及其对人巨细胞病毒的易感性研究

目的 通过检测原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对人巨细胞病毒(HCMV)的易感性,探讨胎儿宫内感染HCMV的可能途径.方法 无菌条件下取30例健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带,向脐静脉灌注0.1%胶原酶Ⅱ 37 ℃消化15 min,通过对细胞的形态学观察和免疫荧光染色方法对细胞进行纯度鉴定;用HCMV病毒株体外感染HUVEC,通过对HCMV基因及蛋白检测确定HUVEC对HCMV的易感性.结果 0.1%胶原酶Ⅱ、15 min的消化方法对HUVEC有较好的分离效果,免疫荧光染色结果表明HUVEC细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达; HCMV体外感染HUVEC 72 h后形态学有明显改变,病毒基因及蛋白均有阳性表达.结论 原代HUEVC对HCMV易感,通过脐静脉的血液传播可能是胎儿宫内感染HCMV的重要途径之一.     

抗病毒药物对HCMV感染的人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响

目的 观察人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC304)细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)基因表达及抗病毒药物对ICAM-1表达的影响.方法 应用半定量逆转录-聚合酶链反应技术动态检测HCMV感染的HUVEC304和更昔洛韦(ganciclovir,GCV)与膦甲酸钠(foscarnet sodium,PFA)干预受染的HUVEC304 ICAM-1 mRNA的表达.结果 常规培养的HUVEC304可表达ICAM-1;HCMV感染后4 h,ICAM-1 mRNA的表达开始增加(P＜0.05),6 h达高峰(P＜0.01),36 h表达水平开始下降,但仍高于正常细胞;GCV和PFA可抑制HCMV感染诱导的ICAM-1表达的上调(P＜0.05).结论 HCMV感染可引起ICAM-1 mRNA的表达增加;应用GCV和PFA可抑制HCMV诱导ICAM-1 mRNA的表达.     

活血注射液对ox-LDL诱导的单核-内皮细胞黏附作用的影响

目的观察活血注射液对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达及与人单核细胞黏附作用的影响。方法以培养HUVEC作为靶细胞,在内皮细胞培养基中加入ox-LDL制备细胞损伤模型。采用蛋白定量法检测HUVEC与单核细胞的黏附率;RT-PCR检测HUVEC中ICAM-1的mRNA表达;用流式细胞仪测定HUVEC中ICAM-1的蛋白表达。结果ox-LDL作用HUVEC后12、24h时,人单核细胞与HUVEC的黏附率显著升高,HUVEC中ICAM-1的mRNA和蛋白表达水平也均明显升高,均明显高于正常对照组(P<0.01),而活血注射液可明显降低人单核细胞与HUVEC的黏附率,以及显著降低ICAM-1的mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05,P<0.01),这种作用随着剂量的增加而增强。结论活血注射液能通过下调内皮细胞表面黏附分子的表达抑制单核-血管内皮细胞黏附,从而发挥对血管内皮细胞的保护作用,有利于减少或抑制动脉粥样硬化的形成。     

高表达内皮脂酶对平滑肌细胞生物学特性的影响及意义

目的 内皮细胞(EC)与平滑肌细胞(SMC)相互作用是动脉粥样硬化的重要病理生理特征,而内皮脂肪酶(EL)是内皮细胞在受致动脉粥样硬化因素作用后高表达的一种酶.目前尚无关于内皮细胞表达EL后对平滑肌细胞的生物学特性影响报道.方法 通过质粒转染法使脐静脉内皮细胞(HUVEC)高表达EL(简称HUVEC-EL),并与正常HUVEC对照,采用共培养技术观察HUVEC高表达EL后对内皮细胞的增殖、迁移、EL表达的影响.结果 内皮细胞高表达EL后,可促进共培养的平滑肌细胞的增殖、迁移,但平滑肌细胞所表达EL量减弱.结论 内皮细胞高表达EL后对共培养平滑肌细胞的生物学活性产生影响,这些影响可能参与动脉粥样硬化的病理生理过程.     

登革病毒感染对人血管内皮细胞血管细胞黏附分子-1表达的影响

目的:研究登革病毒2型(DV2)体外感染对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的影响.方法:原代分离、纯化、培养人HUVEC细胞,用生长良好的2～3代细胞进行实验.分别用病毒感染复数(MOI)为1、2、4、8、16的DV2病毒液感染HUVEC,阴性对照组直接以RPMI 1640培养,应用细胞计数试剂-8(CCK-8)法测定DV2感染前和感染后6、12、24、48、72和96 h的细胞活性.另以MOI=2的DV2病毒液感染细胞,阴性对照组直接以RPMI 1640培养,于感染后6、12、24、48、72、96 h分别收集病毒感染的HUVEC,采用流式细胞术测定细胞表面VCAM-1表达水平;采用RT-PCR法检测细胞中VCAM-1 mRNA转录水平.结果:当病毒MOI=2时对细胞活力的影响与对照组相比差异无统计学意义.DV2感染可以促进HUVECs中VCAM-1 mRNA的转录,96 h内均有增加,与对照组相比有显著性差异(P<0.05).其中,正常状态下HUVEC基本无VCAM-1 mRNA转录,感染12 h达到最高峰,12～48 h表达量显著高于其他时间(P<0.05).DV2 感染HUVEC后, VCAM-1蛋白表达在12～72 h显著升高(P<0.05),与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:DV2感染上调HUVEC的VCAM-1 mRNA转录和蛋白表达.这可能是DV2感染诱发患者血管通透性升高和血浆渗漏的重要分子机制之一.     

HRD1在oxLDL刺激的人脐静脉血管内皮细胞中的表达及意义

目的:观察羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(HMG-CoA reductase degradation protein 1,HRD1)在人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)内的表达情况,探讨HRD1对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)引起的血管内皮细胞凋亡及细胞内脂质沉积的影响?方法:免疫荧光检测HRD1在动脉粥样硬化患者血管组织中的表达?同时体外传代培养HUVEC,oxLDL刺激细胞后Western blot法观察HRD1的表达情况?Ad-HRD1感染oxLDL刺激后的HUVEC,Western blot法观察HRD1对细胞凋亡的影响,油红O染色法观察HRD1对细胞内脂滴生成的影响?结果:HRD1表达于动脉粥样硬化患者血管组织中;也表达于oxLDL刺激后的HUVEC中;Ad-HRD1感染oxLDL刺激后的HUVEC,Cleaved PARP和Cleaved Caspase 3表达降低并且细胞内脂滴形成减少?结论:HRD1可抑制oxLDL导致的内皮细胞凋亡和细胞内脂质沉积?     

氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对人脐静脉内皮细胞(H-UVEC)孤儿核受体NOR1表达的影响

目的:探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)孤儿核受体NOR1表达的影响。方法:采用ox-LDL建立人脐静脉内皮细胞损伤模型,将细胞分为空白组、ox-LDL高、中、低剂量组(25μg/ml、50μml、100μg/ml、200μg/ml),采用CCK8法检测HUVEC活性,采用实时荧光定量PCR分析NOR1转录水平变化,采用Western-Blot分析NOR1蛋白表达的变化。结果:在HUVEC中加入不同浓度ox-LDL共同培养12h后,CCK8值与ox-LDL呈现明显的剂量反应关系,与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。Ox-LDL能够诱导NOR1 mRNA转录和蛋白表达,NOR1 mRNA峰值出现在ox-LDL共同培养后的3h,NOR1蛋白质最大值出现在ox-LDL共同培养后的6 h。结论:ox-LDL能够损伤HUVEC,并能诱导NOR1的表达上调,其在内皮细胞损伤和动脉粥样硬化炎性反应中的作用有待进一步研究。     

HCMV对培养HUVEC凋亡的作用

目的 :探讨人巨细胞病毒 (HCMV)在动脉粥样硬化 (AS)发生和发展中的作用及可能的机制。方法和结果 :采用组织培养技术和流式细胞计数仪观察HCMV对离体培养的HUVEC凋亡的影响。实验发现无血清培养和TNF诱导的细胞凋亡率较正常对照组升高 ,而CMV感染组凋亡率明显降低。用流式细胞仪检测发现 ,在DNA直方图上 ,在G1峰左侧可呈现亚二倍体核峰型 (亚G1峰 ,即凋亡峰 )。而正常的细胞经流式细胞仪检测 ,没有亚二倍体细胞群的峰型 ;CMV可以抑制HUVEC的一氧化氮 (NO)的合成 ,并且呈浓度依赖性。结论 :HCMV感染HUVEC后能够抑制HUVEC的细胞凋亡 ,可能的介导因素为被HCMV感染的HUVEC其NO合成减少。     

Leflunomide inhibits the apoptosis of human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirus

Background

The immunomodulatory drug leflunomide (LEF) is frequently used for treating human cytomegalovirus (HCMV), but its antiviral mechanism is still unclear. In this study,we therefore investigated the effects of the active LEF metabolite A771726 on the HCMV lifecycle in human embryonic lung fibroblasts. We clarified the mechanism of LEF antiviral infection, and provide a new way to treat immune dysfunction patients with HCMV infection.

Methods

The experiment was divided into four groups: the control group, the HCMV group, the ganciclovir + HCMV group as well as the LEF + HCMV group. MTT was usedfor assessment of the cell inhibitory rate. Apoptosis was measured by staining with fluorescein isothiocyanate Annexin V and propidium iodide. Statistical significance was determined by paired t-test using SPSS software.

Results

The results of the study showed that cell proliferation was significantly inhibited by HCMV at 24 hours and 48 hours. With increasing HCMV concentration, the value-added inhibition of the cells was significantly decreased compared with the control group, and was statistically significant (P <0.01). Ganciclovir can increase proliferation of cellsinfected with HCMV; compared with the control group it was statistically significant (P <0.05). Meanwhile, with LEF treatment cell proliferation was significantly improved at 24 hours and 48 hours, with statistical significance (P <0.05). The apoptosis rate of human embryonic lung fibroblasts infected with HCMV increased significantly at 24 hours, 48 hours and 72 hours, and as time goes on the apoptosis rate increases statistically significantly (P <0.01) compared with the control group The apoptosis rate of theHCMV infection group decreased by adding LEF,and was statistically significant (P <0.05).

Conclusions

In this studywe show that LEF is an exciting new drug for cytomegalovirus infection. LEF significantly inhibited HCMV infection-induced apoptosis and proliferation, playing an important role in the treatment of patients infected by HCMV. In this study we explored the potential usefulness of LEF for cytomegalovirus infection and found it to be a cost-effective new treatment for cytomegalovirus infection that deserves further study.     

连接蛋白Lnk在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的：证实体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）存在Lnk分子的表达.方法：体外培养HUVEC系用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹技术,检测HUVEC细胞中的LnkmRNA及蛋白表达.结果：连接蛋白Lnk mRNA及蛋白在HUVEC中均有表达.结论：HUVEC组成性地表达Lnk,可作为体外研究Lnk的细胞系.     

人类巨细胞病地人胚肺细胞HOX基因表达的影响

应用半定量ＲＴ－ＰＣＲ技术研究人胚肺（ＨＥＬ）细胞ＨＯＸ基因的表达状态及人类巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）对ＨＥＬ细胞ＨＯＸ基因表达的影响。结果发现：ＨＥＬ细胞表达ＨＯＸＢ７基因;ＨＣＭＶ感染后,其表达上调;用全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）处理ＨＥＬ细胞,ＨＣＭＶ对ＨＯＸＢ７基因表达的上调作用更强。提示ＨＣＭＶ可能通过影响ＨＯＸＢ７基因的表达导致胚胎发育畸形。     

人类巨细胞病毒对人胚肺细胞HOX基因表达的影响

应用半定量RT PCR技术研究人胚肺 (HEL)细胞HOX基因的表达状态及人类巨细胞病毒 (HCMV)感染对HEL细胞HOX基因表达的影响。结果发现 :HEL细胞表达HOXB7基因 ;HCMV感染后 ,其表达上调 ;用全反式维甲酸 (ATRA)处理HEL细胞 ,HCMV对HOXB7基因表达的上调作用更强。提示HCMV可能通过影响HOXB7基因的表达导致胚胎发育畸形。 更多还原     

中药金叶败毒制剂对巨细胞病毒调控IL-6 mRNA表达的影响

目的 研究有感染性的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)和紫外线(ultraviolet light，UV)灭活丧失感染性的病毒(CMV-UV)感染人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblasts，HLF)后白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)mRNA的变化，并初步探讨中药金叶败毒制剂治疗HCMV感染的分子机制。方法 采用细胞培养与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，研究IL-6在转录水平的表达。结果 UV灭活丧失感染性的HCMV与有感染性的HCMV均可上调IL-6mRNA的表达，中药金叶败毒制剂与更昔洛韦(ganciclovir，GCV)都可抑制HCMV诱导的IL-6表达的上调。结论 IL-6mRNA的上调不需要有感染能力的HCMV，中药金叶败毒制剂可抑制HCMV诱导的IL-6表达的上调。