HIV DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫效果的研究

目的 构建含HIV-1B亚型中国株gagV3基因的DNA疫苗及重组腺病毒伴随病毒(rAAV)疫苗，并研究DNA疫苗和rAAV联合免疫的免疫效果。方法 将HIV-1B亚型中国株gagV3基因克隆入真核表达载体pCI-neo上，构建了含HIV-1 gagV3基因的DNA疫苗pCI-gagV3。采用电击法将pCI-gagV3质粒转染p815细胞，用G418压力筛选，得到转入重组质粒的细胞系p815-gagV3，用免疫酶法检测细胞系中HIV-1基因的表达。用该DNA疫苗进行小鼠免疫实验，检测免疫效果；用该DNA疫苗初次免疫，含同样gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒rAAV-gagV3加强免疫，采用免疫酶法检测免疫小鼠血清中HIV-1特异性的抗体水平，用乳酸脱氢酶法检测免疫小鼠的HIV-1特异性CTL水平。结果 pCI-gagV3可以在p815细胞中表达HIV-1的基因，免疫BALB／c小鼠后可以在小鼠体内诱发HIV-1特异性的细胞和体液免疫反应。HIV-1特异性抗体滴度为1：20；效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为41．7％。pCI-gagV3与rAAV-gagV3联合免疫并不能明显提高抗体水平，但可以提高CTL反应，效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为61.3％，高于单独用DNA疫苗或重组AAV疫苗免疫后产生的CTL活性。结论 DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫可以提高免疫小鼠产生的HIV-1特异性CTL反应。     

pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的：构建pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，观察其在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤免疫应答的能力。方法： 通过RT-PCR构建重组表达质粒pcDNA3.1+/MAGE-3；以pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗免疫已接种肿瘤细胞的小鼠，每10 d重复免疫1次，共3次，以pcDNA3.1+、PBS为对照。末次免疫后5 d检测血清中MAGE-3抗体滴度、小鼠脾淋巴细胞的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）杀伤活性、细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度，同时计算抑瘤率。结果： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，用此疫苗免疫已接种B16/MAGE-3细胞的小鼠后，能诱导小鼠脾淋巴细胞MAGE-3特异性的杀伤活性，脾细胞培养上清中细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度明显增高，血清中抗MAGE-3抗体在1∶20滴度时阳性，肿瘤生长被显著抑制，与pcDNA3.1+组、PBS组相比，差异显著（P＜0.01）。结论： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，该疫苗在小鼠体内既能激活CTL杀伤活性和CD4+ T细胞活性，又能激活体液免疫反应，从而诱导出特异性的抗肿瘤免疫应答。     

MUC1基因疫苗对膀胱肿瘤抑制的免疫学实验研究

目的：研究人粘蛋白MUC1基因DNA疫苗诱导小鼠细胞毒性T细胞（CTL）及体液免疫应答的作用，为膀胱癌的疫苗治疗提供实验资料。方法：接种pcDNA3．1（＋）-MUC1质粒，通过ELISA法检测小鼠血清MUC1抗体生成和脾细胞产生IL-2和1FN-7的量，通过LDH释放法测定CTL对BIU-87细胞的杀伤活性。结果：接种pcDNA3．1（＋）-MUC1疫苗后，小鼠血清中抗MUC1抗体水平明显升高，与对照组相比有显著性差异（P〈0．01）。脾细胞产生的IL-2和IFN-7水平较对照组高（P〈0．01）。在效靶比为100：1、50：1、25：1、12．5：1时，MUC1基因疫苗免疫组小鼠CTL对BIU-87杀伤率（分别为58．4％、47．2％、35．7％、27．4％），较空载体pcDNA3．1（＋）组小鼠和灭菌生理盐水组小鼠（分别为11％、19．2％、9．5％、14％和16．5％、11．9％、8．6％、10．3％）均明显升高，且有显著性差异（P〈0．01）。结论：MUC1基因DNA疫苗能够诱导小鼠产生抗MUC1特异性抗体，诱导产生杀伤表达MUC1细胞的CTL，为MUC1基因疫苗用于膀胱肿瘤生物治疗提供了一定的实验依据。     

IL-15真核表达质粒的构建及对乙肝疫苗诱导的体液免疫应答的影响

目的 研究两种不同的IL-15真核表达质粒对乙肝蛋白疫苗诱导的免疫应答的影响。方法：构建IL-15真核表达质粒(简称pIL-15)和含有IL-12信号肽的IL-15真核表达质粒(简称pIL-2s-15)，CTLL-2细胞增殖实验验证两种质粒真核表达产物的生物学活性。将这两种质粒分别与HBsAg共免疫BALB／C小鼠，用ELISA法检测小鼠血清抗-HBs IgG及IgGl、IgG2a亚类的效价。结果：与HBsAg蛋白疫苗共免疫时，pIL-15可使HBsAg诱导的抗-HBsIgG效价升高，显著高于载体pcDNA3．1与HB—sAg共免疫对照组，pIL-2s-15对HBsAg诱导抗-HBsIgC效价没有明显影响。与HBsAg pcDNA3．1组相比，HBsAg pIL-2s-15组和HBsAg pIL-15组诱生的抗HBsIgG2a亚类均升高，但前者IgG2a／IgG1比值最高，与HBsAg pcDNA3．1组相比差别有显著性；HBsAg pIL-15组IgG2a／IgG1比值与HBsAg pcDNA3．1组相比差别无显著性。结论 pIL-15真核表达质粒可增强蛋白疫苗诱导的体液免疫应答，pIL-2s-15真核表达质粒则主要使免疫应答趋向Th1型。     

HBV与HCV融合基因免疫的抗肿瘤作用研究

目的 :观察基因疫苗SpcDNA3.1、CpcDNA3.1及融合基因疫苗CSpcDNA3.1诱导BALB c小鼠 (H 2 d)的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达HBsAg和HCcAg的小鼠肥大细胞瘤P815细胞 (H 2 d)接种动物后成瘤性的影响。方法 :3种重组质粒SpcDNA3.1、CpcDNA3 1和CSpcDNA3 1分别肌注免疫小鼠 ,3w后背部皮下接种质粒CSpcDNA3 1转染的P815细胞 ,观察小鼠成瘤和存活时间。LDH法检测免疫小鼠的脾淋巴细胞CTL活性。结果 :融合质粒CSpcDNA3 1可显著抑制肿瘤出现和生长 ,小鼠生存时间明显延长 ,生存率提高 ,CSpcDNA3 1免疫的小鼠脾淋巴细胞体外对转染的P815肿瘤细胞有明显的杀伤作用。结论 :融合基因疫苗CSpcDNA3 1免疫的小鼠能诱发特异性抗肿瘤细胞免疫。     

含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究

目的 探讨含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒(rAAV)和重组腺病毒(rAdV)疫苗在BALB／c小鼠中联合免疫的效果。方法 将密码子优化的HIV-1 gp120基因分别插入腺相关病毒(AAV)和腺病毒(AdV)载体质粒，构建含该基因的rAVV和rAdV载体疫苗。将两种疫苗以不同的联合方式免疫BALB／c小鼠，ELISA检测小鼠血清中的gp120特异性抗体，细胞内细胞因子染色法检测小鼠的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。结果 两种重组病毒均可表达目的基因gp120；在小鼠体内两种重组病毒联合免疫可诱导特异性的CTL应答和血清1gG抗体反应，但用rAAV初免2次，再用rAdV加强3次所诱发的CTL和血清1gG反应最强。结论 rAAV和rAdV疫苗联合免疫可在小鼠体内诱导特异性的CTL应答和血清1gG抗体反应。     

Chitosan-DNA基因免疫诱导粘膜特异性免疫应答及其抗CVB3感染作用

目的：构建新型粘膜基因疫苗，诱生CVB3VP1特异性粘膜免疫应答，探讨粘膜免疫抗CVB3感染的作用，为病毒性心肌炎的特异性防治奠定基础。方法：抽提CVB3 RNA，以RT-PCR扩增得VP1基因，插入真核表达载体pcDNA3中，构建质粒pcDNA3-VP1，以Chitosan多糖包裹形成Chitosan-DNA基因疫苗。将该质粒转染Hela细胞，观察其体外表达情况。以50辉DNA剂量的Chitosan-DNA疫苗滴鼻免疫BALB／C小鼠3次，检测CVB3特异性体液和细胞免疫应答；隔4周以5LD50活CVB3致死攻击小鼠，观察攻击后存活情况。结果：制备了直径为80-100nm的Chitosan-DNA复合物颗粒，体外转染证实Chitosan-DNA复合物中VPl的表达高于pcDNA3-VP1质粒-Lipofectamine的表达水平。该疫苗滴鼻3次免疫后，不仅诱生了高水平的IgG，而且诱生了高水平的粘膜IgA抗体，第6周抗体P/N值分别达3．5和3．2。特异性细胞免疫应答研究发现，该疫苗诱生了较强的VP1特异性CTL杀伤作用，并显著高于pcDNA3-VP1和pcDNA3组。CVB3攻击后，可保护33．3％小鼠长期存活，而pcDNA3和pcDNA3-VP1质粒滴鼻免疫对照组的平均存活天数分别为8．5和10．8天。病理学研究显示：Chitosan-DNA免疫小鼠心肌组织基本正常，而对照小鼠死亡前心肌显示大量的灶性坏死和炎性浸润。结论：Chitosan-DNA基因疫苗滴鼻免疫可诱生CVB3特异性粘膜IgA应答及CTL反应，具有一定的抗CVB感染的免疫保护力。     

HBV和HIV的复合型DNA免疫可诱发BALB/c小鼠的细胞免疫应答

本研究是通过细胞免疫检测来研究含有两种不同病毒基因的复合型DNA免疫的效果 ,同时和单一病毒基因的DNA免疫作比较。在本实验中 ,将HBV的S基因和 (或 )HIV 1的gp12 0基因插入到真核表达载体pcDNA3中 ,得到能表达HBsAg和gp12 0融合蛋白的重组体pcDNA S 12 0 ,和能表达HBsAg的重组体pcDNA S。在实验中 ,将重组质粒DNA直接注射到BALB/c小鼠股四头肌内 ,按每只小鼠 10 0 μg/ 10 0 μl的剂量经 3次免疫后 ,在T细胞增殖实验中 ,用HBsAg蛋白刺激体外培养的被免疫小鼠T细胞后 ,出现了明显的T细胞增殖。采用51Cr释放法检测特异性CTL杀伤作用时 ,发现致敏的CTL对HIVgp12 0多肽孵育后的靶细胞P815有明显的杀伤作用。     

IL-12对小鼠肥大细胞瘤基因疫苗的免疫学作用

目的 研究小鼠肥大细胞瘤P815基因疫苗和鼠IL-12对该疫苗的免疫学作用。方法 将小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原基因P1A克隆到真核表达质粒pCI-neo中；用P815细胞对DBA/2小鼠右腹侧皮下注射，构建P815小鼠肿瘤模型；以重组基因疫苗单独或与鼠IL-12真核表达质粒一起肌肉注射，观察肿瘤的消长，特异细胞毒T淋巴细胞激活和抗全的生成情况。结果 重组基因疫苗在体外有很好的表达，注射后CTL的杀伤效率为40%，IL-12共注射的CTI，杀伤效率达到60%，免疫后，30%小鼠的肿瘤出现消退；同IL-12共注射则有50%的小鼠的肿瘤出现消退，2种情况下都不能检测到任何特异抗体的产生。结论 重组P1A肿瘤疫苗能有效激活机体的肿瘤特异免疫应答；基因疫苗对小鼠P815肿瘤的治疗作用主要归因于细胞免疫；IL-12有增强这种免疫应答的作用。     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据     

丙肝核酸疫苗免疫的CTL活性检测

目的 :探讨丙肝核酸疫苗的细胞免疫应答效果。方法 :用丙肝核酸疫苗pSVL HCV C E1 通过皮下注射途径免疫BALB C小鼠 ,以绿色荧光载体重组体pEGFP N1 HCV C E1 转染的小鼠骨髓瘤细胞SP2 0作为靶细胞 ,采用51 Cr释放法 ,以(Na) 2 51 CrO4 标记靶细胞进行标准的 4h杀伤试验检测其CTL活性。结果 :CTL杀伤率达 4 0 7%。结论 :丙肝核酸疫苗能激发强烈的细胞免疫     

乙型肝炎病毒多表位抗原基因真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

将自行设计、合成的乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT ,克隆入真核表达载体pCDNA3 1,构建重组质粒pCDNA3 1/BPT。后者经脂质体法转染小鼠BALB/c 3T3细胞 ,G4 18加压筛选出阳性转染细胞 ,并用间接免疫荧光法鉴定其在小鼠BALB/c 3T3细胞的表达。该重组质粒经胫骨前肌注射小鼠 ,10 0 μg/次每只小鼠 ,间隔 2周加强一次 ,共 3次。免疫诱发了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应 ,并用PCR法在小鼠的心脏、肝脏及肺组织中检测到pCDNA3 1/BPT ,这为研究HBV多表达抗原的核酸疫苗提供了初步的资料     

中国株HIV-1 gp120核酸疫苗的实验免疫研究

目的　探讨表达中国株HIV 1gp12 0基因的核酸疫苗在小鼠体内的免疫反应。方法　将表达HIV 1gp12 0的核酸疫苗质粒pVAXP经肌肉注射免疫Balb c小鼠 ,检测免疫小鼠脾CD4 +、CD8+T细胞亚群的数量 ,脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果　重组质粒pVAXP免疫组小鼠脾CD4 +、CD8+T细胞亚群的数值均比对照组高 (P <0 .0 5 ) ;免疫组脾特异性CTL杀伤活性与对照组相比差异极显著 (P <0 .0 1) ;血清抗体滴度显著高于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　表达HIV 1gp12 0基因的核酸疫苗质粒pVAXP能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫。     

HTHV核蛋白诱导产生特异性CTL的实验研究

目的 建立稳定表达核蛋白（ＮＰ）的Ｐ８１５细胞株,并以此作为ＣＴＬ的靶细胞,研究汉滩病毒（ＨＴＨＶ）诱导产生的ＮＰ抗原特异性ＣＴＬ。方法 脂抽体介导ｐＥＦ－ＢＯＳ／ＨＴＨＶ－ＮＰ和ｐＤＯＲ＾ｎｅｏ质粒ＤＮＡ共转染Ｐ８１５细胞株,用免疫组染色法证实ＮＰ在胞浆中的表达。分别取ＨＴＨＶ感染小鼠的脾细胞和ｐＥＦ－ＢＯＳ／ＨＴＨＶ－ＮＰ质粒ＤＮＡ免疫小鼠的脾细胞,经体外抗原和ＩＬ－２再刺激诱导产生ＣＴＬ效应     

Interleukin 2-dependent activation of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo

We have quantitatively studied the effect of interleukin (IL) 2 on the cytotoxic T lymphocyte (CTL) response to tumor cells in vivo. Mastocytoma P815 was transfected with murine IL 2 cDNA (P815-IL 2) and injected into syngeneic mice. The anti-tumor response was analyzed and compared with the response induced by the non-transfected cells. P815 parental cells are highly tumorigenic, causing death within 20-30 days. In contrast, IL 2-transfected cells were totally rejected. Co-injection of IL 2-secreting and parental cells resulted in the inhibition of growth of both type of tumors. In addition, the response induced by IL 2-secreting cells protected the mice against a subsequent challenge with P815. Long-term memory persisted in treated mice 3 months after tumor rejection. Frequencies of CTL precursors and CTL specific for P815 increased as a result of IL 2 secretion by the target cells. Estimates of CTL frequency at days 8 and 12 after injection were 2 to 3 times higher in mice inoculated with P815-IL 2 cells, and this correlated with tumor rejection.     

共表达HIV-1 gag-gp120与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫研究

目的探讨共表达HIV-1 gag-gpl20与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法以重组鸡痘病毒首免，以表达相同抗原的核酸疫苗质粒追加免疫，检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果联合免疫组脾特异性CTL杀伤活性比重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组、鸡痘病毒疫苗株对照组和空白质粒对照组高，血清抗体水平显著高于空白质粒对照组和鸡痘病毒疫苗株对照组，但与重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组之间差异无显著性。结论重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫可诱导小鼠产生更强的细胞免疫应答。     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。