RNA干扰体外抑制肝癌细胞端粒逆转酶基因表达的研究

目的 利用小片段干扰RNA(siRNA)在肝癌细胞内诱导RNA干扰(RNAi)，抑制端粒逆转录酶(hTERT)基因表达，在体外进行RNAi对肝癌治疗的试验研究。方法 构建针对hTERT基因的siRNA(siRNA-hTERT)，转导入肝癌细胞7721，在瘤细胞内诱导RNAi，采用流式细胞分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、免疫组化等技术检测siRNA处理前后细胞增殖及hTERT基因表达变化。结果 siRNA-hTERT对肝癌细胞生长抑制率达37．5％；细胞周期中S期细胞明显减少，G1／G0期细胞显著增加；hTERT基因的mRNA表达由99．4％下调到53．1％，其蛋白表达由86．3％下调到46．6％。结论 RNAi在体外明显抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达和瘤细胞增殖。     

siRNA抑制人肝癌细胞MDM2表达及细胞增殖的研究

目的探讨siRNA对人肝癌HepG2细胞MDM2基因表达的抑制作用及对增殖的影响。方法体外合成针对MDM2基因的siRNA质粒,转染HepG2细胞株;应用RT-PCR和western blot方法检测siRNA对MDM2和P53基因和蛋白表达的影响,并用MTT法检测siRNA对细胞增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期。结果和空白组比转染siMDM2-1,2的HepG2细胞的MDM2基因和蛋白表达减低,而P53基因和蛋白表达增加。阴性对照质粒组的基因表达未见明显改变。转染siRNA MDM2后细胞生长受到抑制,转染siMDM2-1,2和阴性对照质粒后的抑制率分别是46.3%、56.1%和3%。和对照组比较,转染siMDM2-1,2的hepG2细胞的细胞周期发生明显改变,而转染对照质粒的hepG细胞周期未发生明显变化。结论 siRNA MDM2可以有效抑制HepG2细胞株中MDM2的表达,促进P53的表达,同时可以使细胞周期发生变化,这可能是其抑制肿瘤细胞增殖的主要机制之一。     

saRNA调控p21基因表达对肝癌细胞的抑制作用

目的探讨RNA激活p21对肝癌Hep G2、Hep 3b和SMMC-7721细胞生长和侵袭力的影响。方法化学合成靶向p21的saRNA,将其转染肝癌细胞系Hep G2、Hep 3b和SMMC-7721,利用荧光定量RT-PCR和免疫印迹检测细胞中的p21表达水平,并MTT法检测细胞生长情况及划痕实验观察细胞侵袭能力的变化。结果 Hep G2、Hep3b和SMMC-7721细胞的p21 mRNA分别较对照组升高了6.6、7.1、6.1倍,p21蛋白表达水平分别升高了17.4、11.4、6.7倍。细胞转染后48 h时的细胞增长平均抑制率分别为47%、53%和55%;划痕实验显示转染组细胞迁移能力显著低于对照组(P0.01)。结论靶向p21的RNAa能抑制肝癌细胞的生长和侵袭力,p21可作为一个具有肝癌治疗应用价值的靶基因。     

特定沉默胶质瘤U251细胞株的PDGF-B基因对细胞凋亡和增殖的影响研究

目的利用RNA干扰基因治疗技术,特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板衍生生长因子B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法用血清培养液(含10%胎牛血清DMEM培养基)体外培养人U251脑胶质瘤细胞系。随机分为3组,第1组为实验组:转染siRNA的细胞,第2组为阴性对照组:转染空白质粒的细胞;第3组为空白对照组:细胞常规培养不予以干预。利用脂质体将siRNA转染进入U251细胞,在细胞内形成双链siRNA,识别并降解PDGF-B mRNA。通过RT-PCR检测U251细胞中PDGF-B基因mRNA的表达水平,Western blot检测PDGF-B的蛋白表达,MTT法检测U251细胞的增殖情况,流式细胞学对比检测3组细胞的凋亡情况。结果利用脂质体将靶向PDGF-B基因siRNA转染进入U251细胞,48 h后利用RT-PCR检测PDGF-B基因mRNA的表达,结果显示与阴性对照组和空白对照组对比,转染组PDGF-B基因mRNA表达水平明显下降;转染72 h后,Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%);MTT结果显示siRNA转染组U25细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测显示,与阴性对照组和空对照组相比,转染siRNA的细胞的实验组中,G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达,能够使细胞周期阻滞在G1期,从而抑制胶质瘤细胞的增殖,并促进细胞的凋亡。结论构建靶向胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,通过体外试验观察可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,其所产生的RNA干扰效应对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长的抑制和促进凋亡作用。     

抑制mll-af9融合基因表达对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响

本研究探讨siRNA(small interfering RNA)对人急性单核细胞白血病细胞系THP-1的mll-af9融合基因的影响.选择THP-1细胞特有的m11-af9融合基因为靶基因,设计并合成siRNA片段.以人急性单核细胞白血病细胞系THP-1为靶细胞,应用脂质体转染方法,将siRNA导入细胞,通过流式细胞仪检测siRNA转染效率,用RTPCR法比较转染前后mll-af9 mRNA表达水平的变化,以MTT法检测细胞增生抑制率,流式细胞术检测细胞周期的改变和细胞凋亡水平.结果表明siRNA转染效率为(69.1±1.8)%,转染siRNA后THP-1细胞生长受到明显抑制,m11-af9融合基因表达量大幅度减少,细胞周期发生了明显的变化,主要表现为G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡水平增高,而对照组siRNA转染后则无上述改变.结论利用siRNA靶向干扰mll-af9融合基因的表达可以有效抑制人急性单核细胞白血病细胞THP-1的增殖.     

siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响

目的构建GPC3基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响,探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7,荧光定量PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3,以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系,筛选并建立稳定表达siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况,验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中,GPC3基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平;同时,流式细胞仪检测发现,GPC3表达下调后,诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达,并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。     

miR-218负调控SFMBT1抑制肝癌细胞增殖

目的探讨miR-218是否通过调控含有4个mbt区域的scm相关基因(SFMBT1)影响肝癌细胞增殖能力。方法 RT-PCR检测人肝癌细胞Hu H-7、Hep G2、SNU-449和人正常肝细胞HH中miR-218的水平。靶基因预测软件预测miR-218的靶基因并用荧光素酶报告基因进行鉴定,RT-PCR和Western blot检测miR-218对靶基因的调控作用。肝癌细胞转染miR-218模拟物(miR-218 mimics组)、SFMBT1小干扰RNA(SFMBT1 siRNA组),同时设置对照组(只加入转染试剂)。噻唑蓝(MTT)检测各组细胞存活率。结果肝癌细胞Hu H-7、Hep G2、SNU-449中miR-218表达水平均明显低于正常肝细胞HH(P0.01)。Hep G2细胞中miR-218表达水平最低,后续选用Hep G2细胞深入研究。miR-218的靶基因是SFMBT1,并且miR-218负调控SFMBT1靶基因。miR-218 mimics组和SFMBT1 siRNA组细胞存活率均明显低于对照组(P0.01)。miR-218 mimics和SFMBT1 siRNA共转染后的细胞存活率比miR-218mimics组和SFMBT1 siRNA组均明显降低(P0.01)。结论 miR-218能够负调控靶基因SFMBT1抑制人肝癌细胞的增殖。     

抑制促血管生成素基因表达对肝癌血管生成的影响

目的:观察抑制促血管生成素-2(Ang-2)基因表达后时人肝癌细胞系SMMc7721体外成瘤性和血管生成的影响,阐明Ang-2基因在肝癌血管生成和转移过程中的作用,为研究抗血管生成疗法奠定基础.方法:选择携带Ang-2基因的肝癌细胞系SMMC7721,通过脂质体介导的基因转染方法将特异干扰性小RNA(siRNA)基因导入SMMC7721肝癌细胞系,并用G418筛选稳定表达的细胞克隆,用RT-PCR和免疫荧光法检测是否成功构建了抑制Ang-2基因表达的SMMC7721肝癌细胞系.将63只裸鼠随机分成3组,分别用转染和未转染siRNA基因的携带Ang-2基因SMMC7721肝癌细胞及不携带Ang-2基因SMMC7721肝癌细胞注射于裸鼠皮下产生肿瘤结节,观察肿瘤的生长的速度并对肿瘤组织中的微血管进行检测.结果:用RT-PCR方法从RNA水平以及用免疫荧光法从蛋白质水平均证实新构建的肝癌细胞系成功抑制了Ang-2基因及其蛋白产物的表达.抑制了Ang-2基因后肿瘤生长速度明显减慢(P<0.05),肿瘤组织中血管生成的数量较未转染前明显减少(P<0.05).结论:Ang-2的表达增强了人肝癌细胞系SMMC7721的体外成瘤性并促进了肿瘤组织中的血管生成.抑制Ang-2的表达可以明显减弱这种促进作用.     

siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究

本研究探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默人红白细胞白血病细胞（HEL）的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应（semiquantitative RT-PCR）检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为（72.22±2.80）%,evi1-mRNA相对表达率为（27.31±1.11）%,HEL细胞活率为（26.05±2.49）%,与其他各组相比有显著性差异（p〈0.001）。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高（p〈0.01）。结论：evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。     

靶向沉默HuR基因增强人肝癌细胞Hep3B对多柔比星的化疗敏感性

目的探讨沉默人抗原R(Hu R)基因对人肝癌细胞Hep3B多柔比星化疗敏感性的影响及相关机制。方法脂质体包裹靶向Hu R基因的短发夹RNA(sh RNA)转染Hep3B细胞,real-time PCR和Western blot分别检测沉默Hu R基因后Hu R、MDR1 m RNA和蛋白的表达,MTT法检测沉默Hu R基因后Hep3B细胞对多柔比星化疗的敏感性,流式细胞术(FCM)检测沉默Hu R基因后对Hep3B细胞凋亡的影响。结果 Hu R sh RNA质粒转染Hep3B细胞能有效沉默Hu R基因,m RNA和蛋白水平的抑制率分别为82%和75%。与未处理Hep3B细胞(Mock组)比较,沉默Hu R基因的Hep3B细胞(si Hu R组)对多柔比星的半数抑制浓度(IC50)显著降低[(86.36±6.54)μg/L vs.(318.56±9.89)μg/L,P<0.05],细胞凋亡率明显升高[(30.48±5.12)%vs.(8.86±1.35)%,P<0.05],MDR1 m RNA和P-gp蛋白表达显著降低,比值分别为0.36±0.08和0.28±0.11,差异均有统计学意义(P<0.05)。Mock组与转染对照sh RNA质粒Hep3B(Control组)的各检测指标均无统计学差异(P>0.05)。结论沉默Hu R基因可能通过抑制耐药蛋白P-gp的表达增强其对多柔比星的化疗敏感性。     

抑制Hedgehog信号通路对肝细胞癌细胞生长和迁移的影响

目的探讨Hedgehog（Hh）信号通路在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞中的作用及其机制。方法选取2株HCC细胞系HepG2和Hep3B分成6组,分别为HepG2空白对照组、HepG2/GDC-0449组、HepG2/GANT61组、Hep3B空白对照组、Hep3B/GDC-0449组、Hep3B/GANT61组。HepG2/GDC-0449组、Hep3B/GDC-0449组采用GDC-0449（靶向SMO）,HepG2/GANT61组、Hep3B/GANT61组采用GANT61（靶向GLI1/2）Hh信号通路抑制剂处理。采用实时PCR检测HCC细胞Patched1、Smoothened、Glioma1、vimentin和E-cadherin mRNA表达水平,采用Western blot实验检测Patched1、Smoothened、Glioma1蛋白表达水平,采用克隆形成实验观察存活克隆计数与死亡细胞计数。结果 HepG2/GDC-0449组和HepG2/GANT61组与HepG2空白对照组比较,Hep3B/GDC-0449组和Hep3B/GANT61组与Hep3B空白对照组比较,Patched1、Smoothened和Glioma1mRNA及蛋白表达均下调,存活克隆计数减少,死亡细胞计数增多,E-cadherin mRNA表达水平增高,vimentin mRNA表达水平降低（P〈0.05）;HepG2/GANT61组较HepG2/GDC-0449组抑制作用更明显,Hep3B/GANT61组较Hep3B/GDC-0449组抑制作用更明显（P〈0.05）。结论 GDC-0449和GANT61 2种抑制剂均可有效抑制HepG2和Hep3B细胞增殖、迁移和上皮间叶细胞转化,增加细胞凋亡,其中GANT61抑制作用更明显。抑制Hh信号通路可有效影响HCC细胞的生长和迁移。     

蛋白激酶B活化诱导骨桥蛋白表达与肝癌细胞骨转移间的关系

目的:研究蛋白激酶B(AKT)活化诱导骨桥蛋白(OPN)表达在肝细胞肝癌(HCC)骨转移中的作用及其机制。方法:收集40例HCC骨转移灶及其原发灶标本,并另选取22例无转移的HCC组织标本作为对照,行免疫组化染色检测AKT、OPN表达水平;同时用miR-21表达载体转染人HCC细胞系BEL-7402,诱导AKT磷酸化激活,同时用AKT特异性抑制剂(MK-2206)抑制AKT磷酸化激活,分别观察AKT磷酸化水平(p-AKT)与OPN表达间的关系;采用OPN特异性小干扰RNA(OPN-siRNA)沉默BEL-7402细胞OPN表达,并用MTT法检测其对细胞增殖的影响。结果:在发生HCC骨转移灶中,p-AKT和OPN阳性率分别为85.00%(34/40)和77.50%(31/40),明显高于其相应的HCC原发灶组织(p-AKT为60.00%;OPN为55.00%,P<0.05)及无转移的HCC组织(p-AKT为54.55%;OPN为36.36%,P<0.01);BEL-7402细胞转染miR-21诱导p-AKT上调后,OPN表达升高并促进肿瘤细胞增殖加速;反之,MK-2206抑制AKT磷酸化后,BEL-7402细胞OPN表达下降,肿瘤细胞增殖速率降低;采用特异siRNA沉默OPN表达,同样可抑制肿瘤细胞增殖。结论:HCC细胞OPN高表达与AKT信号通路的激活有关,AKT磷酸化水平的升高能诱导OPN表达,进而促进HCC细胞的增殖和转移,提示检测p-AKT与OPN的表达水平对于HCC恶性生物学行为的判断具有潜在的应用价值。     

过表达FOXB2对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨叉头框蛋白B2（FOXB2）对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 采用定量PCR检测正常肝细胞LO2细胞和肝癌细胞系Hep3B、Huh7细胞FOXB2 mRNA的表达,构建过表达FOXB2的细胞模型,逆转录实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测过表达效率,细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测FOXB2对Huh7细胞增殖能力的影响;平板克隆实验检测FOXB2对Huh7细胞克隆形成能力的影响;Transwell实验检测FOXB2对Huh7细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 FOXB2在肝癌细胞系Huh7和Hep3B细胞中的表达水平低于正常肝细胞LO2（P<0.001）;过表达FOXB2抑制了Huh7细胞的增殖（P=0.005）和克隆形成（P<0.001）;FOXB2过表达肝癌细胞的迁移（P<0.001）和侵袭（P=0.002）能力低于Vector对照细胞。结论 FOXB2在肝癌细胞中低表达,FOXB2过表达抑制了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。     

二硫代氨基甲酸吡咯烷对肝癌细胞株Hep3B增殖的影响

目的 探讨抗氧化剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrro1idine dithiocarbamate,PDTC)对肝癌细胞株Hep3B增值的影响及作用机制.方法 采用四甲基偶氨唑蓝(MTT)法,检测不同浓度PDTC、吡柔比星(pirarubicin)及PDTC预处理后联合吡柔比星对Hep3B细胞存活率的影响.电泳迁移率变动分析(EMSA)检测核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的活性及PDTC对该活性的影响.结果 MTT结果示:PDTC能有效抑制肝癌细胞株Hep3B的增殖,并有浓度依赖性.不同浓度的PDTC作用后Hep3B细胞存活率差异均有统计学意义(P＜0.01).单用1μg/ml吡柔比星作用后,细胞存活率(87.3土5.4)%,用PDTC预处理后,细胞存活率为(58.6±3.7)%,其差异有统计学意义(t=7.592,P＜0.01),PDTC预处理能明显增强吡柔比星的细胞毒作用.EMSA结果示,PDTC浓度依赖性地抑制NF-κB的激活,不同浓度的PDTC作用两两相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 PDTC能抑制肝癌细胞株Hep3B的增殖,增强吡柔比星的细胞毒作用,其主要作用机制是抑制NF-κB的激活.PDTC有望用于肝癌的化学预防,联合化疗药可进一步提高化疗的疗效.     

下调STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究

目的:探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因调控腺样囊性癌细胞生长的实验研究。方法:人腺样囊性癌生长细胞株ACC 2常规培养,分别采用A组为空白转染组,B组转染阴性对照siRNA(NC),C组转染特异性的siRNA(siRNA组)转染进ACC2,采用qRT PCR和Western blot法检测转染后STAT3 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT检测转染后腺样囊性癌细胞增殖。结果:ACC2细胞转染STAT3 siRNA 48 h后,STAT3 mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。ACC 2生长72 h细胞转染后细胞增殖受到抑制,较对照组有显著性差异(P0.05)。结论:STAT3基因有可能成为腺样囊性癌细胞生长基因治疗中重要的靶基因。     

RNA干扰沉默CXCR4基因对Jurkat细胞周期和凋亡的影响

本文研究探讨下调CXCR4的表达对人T-ALL Jurkat细胞周期和凋亡的影响。设计合成CXCR4的特异性siRNA,采用脂质体转染Jurkat细胞株。用RT—PCR检测siRNA对细胞内CXCR4基因表达的影响,用流式细胞术检测细胞周期分布和细胞的凋亡情况。结果表明：成功构建了CXCR4的特异性siRNA;与空白对照组相比,转染CXCR4siRNA的Jurkat细胞的CXCR4mRNA表达水平明显下降（56．9％±1．4％FS68．3％±2．4％）,G0／G1期细胞比例增加（35．8％±1．9％vs18．1％±1．2％）,G,／M期和S期细胞比例相应下降（19．8％±1．7％VS27．2％±1．5％;44．4％±2．1％VS54．7％±2．8％）,凋亡细胞率明显增高（20．9％±2．0％VS3．13％±0．9％）。结论：CXCR4的特异性siRNA能够有效下调CXCR4基因表达,诱导Jurkat细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而抑制细胞的增殖。     

法舒地尔和RhoA沉默对神经干细胞增殖的影响

背景：Rho及其相关分子在神经轴突生长、分化、延伸及突触形成中起重要作用,阻断和抑制RhoA/ROCK通路可促进神经干细胞的增殖与生长。目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默对大鼠神经干细胞增殖的影响。方法：体外培养Wistar胎鼠神经干细胞,分6组干预：空白对照组,5,10,15,20μmol/L法舒地尔组,siRNA沉默RhoA基因组。干预后第3天,采用RT-PCR,Westernblot检测各组神经干细胞RhoA基因及蛋白的表达。应用MTT比色法观察神经干细胞增殖情况;采用流式细胞术测定神经干细胞周期分布的变化。结果与结论：15,20μmol/L法舒地尔组、siRNA沉默RhoA基因组神经干细胞RhoA基因及蛋白表达量较5,10μmol/L法舒地尔组、空白对照组明显降低（P〈0.05）,细胞的生长速度较5,10μmol/L法舒地尔组、空白对照组明显增快（P〈0.05）,细胞周期G0/G1期减少（P〈0.05）,S期细胞数增多（P〈0.05）。当法舒地尔浓度增加到20μmol/L时对细胞的作用并非随浓度的增加而增强,与15μmol/L组的差异无显著性意义（P〉0.05）。15,20μmol/L法舒地尔组与siRNA沉默RhoA基因组相比差异无显著性意义（P〉0.05）。说明Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默在体外均能促进神经干细胞增殖,法舒地尔最佳作用浓度为15μmol/L。     

P27基因对人喉癌细胞抑制作用的研究

１Materialsandmethods１．１CelllinesandvectorHumanlaryngealcarcinomacelllineHep－２weregrowninDulbeccomodifiedEaglemedium．Thep２７eu－karyoticexpressionvectorpCMV－p２７wasagiftfromDrLijinge．１．２DNAtransfectionDNAtransfectionbyLipofectamineac－cordingtothemanufacturer｀sinstructions（Gibco）．１．３AnalysisofcellcyclebyflowcytometryCellstransfectedwithpCMV－p２７werecollectedbytrypsinization，fixedwith７０％ethanol．After４８hours，cellswerecollected，resuspendedin１mloflysisbuffe…     

miR-198 通过靶向ZEB2 调控EMT 过程抑制肝癌细胞增殖和迁移的机制研究

目的 探讨微小核糖核酸-198（miR-198）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织细胞中的表达及其对癌细胞增殖、迁移的影响及其相关机制。方法 采用qRT-PCR 检测miR-198 在HCC 组织及细胞(HepG2,Hep3G,MHCC97H,Huh7) 中的表达情况;采用脂质体2000 向Huh7 细胞中单独转染miR-198 mimics,共转染miR-198 mimics 和pcDNA3.1-ZEB2;生物信息学网站预测miR-198 的潜在靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验进行验证;采用Western blot 检测E 盒结合锌指蛋白2（E-box binding zinc finger protein 2, ZEB2）及上皮-间质转化（epithelialmesenchymaltransformation, EMT）相关蛋白表达;CCK-8 法和细胞划痕实验检测Huh7 细胞增殖和迁移能力。结果 20 例HCC 组织中miR-198相对表达量（0.354±0.022）明显低于邻近正常组织（4.762±1.135）,差异有统计学意义（t=17.365,P＜ 0.001）。HCC细胞系HepG2（0.589±0.103）,Hep3G（0.495±0.086）,MHCC97H（0.558±0.056）和Huh7（0.362±0.045）中miR-198 相对表达量较正常肝细胞LO2（1.823±0.125）显著降低（t=17.159,18.466,17.590,20.315,均P ＜ 0.05）。miR-198 mimics 组细胞增殖（0.398±0.146 vs 0.691±0.213）和迁移能力（20.012±2.103 vs 84.032±6.512）较对照组明显降低（t=1.965,52.459,均P ＜ 0.001）。miR-198 mimics 组细胞中E-cadherin 表达较对照组明显升高,N-cadherin和Vimentin 表达较对照组明显降低（t=18.478,17.550,19.706,均P ＜ 0.01）。ZEB2 是miR-198 的靶基因,miR-198负调控ZEB2。20 例HCC 组织中ZEB2 相对表达量（3.621±1.143）明显高于邻近正常组织（ 0.736±0.030）,差异有统计学意义（t=11.284,P ＜ 0.001）,与miR-198 表达呈负相关（r=-0.702,P ＜ 0.05）。共转染过表达ZEB2 逆转了miR-198 mimics 对HCC 细胞增殖、迁移和EMT 的抑制作用。结论 miR-198 在HCC 组织和细胞中表达下调,miR-198 通过靶向负调控ZEB2 的表达抑制Huh7 细胞的增殖和迁移。     

小分子干扰RNA介导的RhoA沉默优化胎肝干细胞培养

背景：细胞移植治疗是目前的研究热点之一,寻找良好的细胞来源并有效扩增,是大量临床应用的基础。目的：通过沉默RhoA基因优化胎肝干细胞培养方法。方法：体外培养胎肝干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组：A组为干细胞组,B组为经随机打乱顺序的小分子干扰RNA转染干细胞组,C组为经小分子干扰RNA转染的干细胞组。应用反转录-聚合酶链反应、Western blot法检测胎肝干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝比色法观察细胞生长的优化作用;流式细胞术测定细胞周期分布的变化。结果与结论：转染小分子干扰RNA后C组与A、B组相比,RhoA基因和蛋白表达量明显降低（P〈0.05）,细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多,各组间差异有显著性意义（P〈0.05）。提示通过沉默RhoA基因的方法可以促进胎肝干细胞增殖,对其培养有优化作用。