全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系DU—145凋亡的分子机理

克隆全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系ＤＵ－１４５细胞产生凋亡的相关基因，探讨维甲酸诱导前列腺癌细胞产生凋亡的分子机理。方法应用全反式维甲酸诱导前列腺癌细胞系ＤＵ－１４５细胞凋亡，采用基于ＰＣＲ的改良消减杂交技术克隆与凋亡相关的基因。结果在前列腺癌ＤＵ－１４５细胞凋亡过程中，有大量肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）的表达，同时，克隆出ｃ－ｅｒｂＢ－２基因。结论ＴＮＦ及ｃ－ｅｒｂ－２基因在由全反式维甲酸诱导的前列腺     

胃癌相关基因c-met表达和凋亡的研究

目的 研究ｃ－ｍｅｔ基因蛋白和细胞凋亡在胃黏膜病变演进的表达及关系,探讨ｃ－ｍｅｔ表达对胃癌（ＧＣ）预后的意义。方法 １４５例经病理证实不同胃黏膜病变,采用免疫组织化学法检测ｃ－ｍｅｔ基因表达,采用原位末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测细胞凋亡,用Ｌｏｎｇ－ｒａｎｋ法检测胃癌生存率。结果 在浅表性胃炎（ＣＳＧ）、萎缩肠化生胃炎（ＣＡＧ＋ＩＭ）、异型增生（ＤＹＳ）、早期ＧＣ和进展期ＧＣ中,ｃ－ｍｅｔ基因表     

Bcl—2基因增强表达对TNF诱导U937细胞凋亡的效应

目的：探讨Ｂｃｌ－２基因增强表达对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）诱导的Ｕ９３７细胞凋亡的生物学效应。方法：用磷酸钙沉淀法将Ｂｃｌ－２基因转染到Ｕ９３７细胞，用Ｇ４１８筛选稳定转染子，用不同剂量ＴＮＦ处理后观察未转染细胞的存活率。结果：用Ｂｃｌ－２稳定转洒的Ｕ９３７细胞经ＴＮＦ处理，存活率明显高于未转染细胞，结论：Ｂｃｌ－２基因增强表达阻抑ＴＮＦ诱导的Ｕ９３７细胞凋亡。     

γ—射线诱导HL—60细胞凋亡相关基因的分离和鉴定

为明确参与γ－射线诱导ＨＬ－６０细胞凋亡的ｃａｓｐａｓｅ家族成员，根据已知ｃａｓｐａｓｅ家族成员保守肽序列设计简并引物，经ＲＴ－ＰＣＲ从凋亡ＨＬ－６０细胞ｍＲＮＡ扩增出一条带，通过基因克隆及序列测定进行鉴定。结果克隆出ｃａｓｐａｓｅ－３ｃＤＮＡ的一段序列。说明ｃａｓｐａｓｅ－３参与了γ－射线诱导的ＨＬ－６０细胞凋亡，可能是该凋亡途径的枢枢元件。     

Bcl-2基因增强表达对TNF诱导U937细胞凋亡的效应

目的：探讨Ｂｃｌ－２基因增强表达对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）诱导的Ｕ９３７细胞凋亡的生物学效应。方法：用磷酸钙沉淀法将Ｂｃｌ－２基因转染到Ｕ９３７细胞，用Ｇ４１８筛选稳定转染子，用不同剂量ＴＮＦ处理后观察转染与未转染细胞的存活率。结果：用Ｂｃｌ－２稳定转染的Ｕ９３７细胞经ＴＮＦ处理，存活率明显高于未转染细胞。结论：Ｂｃｌ－２基因增强表达阻抑ＴＮＦ诱导的Ｕ９３７细胞凋亡     

HL—60细胞内一种新的全反式维甲酸应答基因的克隆

利用差示ＰＣＲ技术从ＨＬ－６０细胞内克隆出一个新的,差异表达的ｃＤＮＡ片段,并并其命名为Ｗ－１基因,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交证实,用全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）诱导ＨＬ－６０细胞分化时,Ｗ－１基因的转录水平在诱导早期增加而在诱导２４ｈ后关闭,推测Ｗ－１基因可能在ＨＬ－６０细胞早期分化中有一定作用。     

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探索ｐ１６基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法采用脂质转染的方法．将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２５１,观察ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒ＰＣＤＮＡ３为对照。免疫组化、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｐ１６基因表达,对转染后细胞生长情况、细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ,ＣＤＤＰ）敏感性的变化进行分析。结果外源ｐ１６基因的高水平表达显著掏了胶质瘤Ｕ２５１细胞的生长,克隆形成率减少,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了Ｇ１期阻滞,同时,细胞对顺铂的敏感性降低,化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论外源野生型ｐ１６基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,同时降低Ｕ２５１细胞对顺铂的化疗敏感性。ｐ１６基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。     

人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立

建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体外经ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－４培养,扩增出高纯度的ＤＣ,抽取纯化ｍ ＲＮＡ,转录成ｃＤＮＡ,定向插入ｐＳＰＯＲＴ２．０载体,建立人ＤＣ的ｃＤＮＡ 质粒文库;用ＡＢＩ３７７全自动测序仪对该文库进行同源性比较,筛选出代表未知基因ＥＳＴ,然后在ＧＣＧ 软件中进行分析,对重要的未知ＥＳＴ克隆其全长ｃＤＮＡ。结果：所扩增的ＤＣ经流式细胞仪分析高表达ＭＨＣ－Ⅰ,ＭＨＣ－Ⅱ,Ｂ７,ＣＤ１ａ 和ＣＤ８３等表面标志,能强烈刺激同种异体Ｔ淋巴细胞的体外增殖反应;建立的ＤＣｃＤＮＡ 文库９２％ 以上克隆有平均１．６ ｋｂ 大小的插入片段;从所测的１２ ０００余条ＥＳＴ中筛选出代表未知基因的３ ０００余条,克隆到１０９条全长新基因,包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子,部分全长基因已在Ｇｅｎｅｂａｎｋ 中登录。结论：成功建立了人ＤＣ的ｃＤ－ＮＡ 基因文库及其大规模随机测序体系,并克隆到免疫分子。建立人树突状细胞（ＤＣ）的ｃＤＮＡ文库,通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞,体     

精-甘-天-丝四肽对肾小球系膜细胞凋亡相关基因的作用

目的探讨精氨酸－甘氨酸－天门冬氨酸－丝氨酸（ＲＧＤＳ）四肽对肾小球系膜细胞凋亡相关基因白细胞介素－１β－转化酶（ＩＣＥ）和ｂｃｌ－２表达的影响,为利用ＲＧＤＳ四肽调控系膜细胞的增殖与凋亡提供实验理论依据。方法合成ＲＧＤＳ四肽,采用经典的肾小球系膜细胞培养方法进行体外研究;碘化丙啶染色法观察凋亡细胞细胞核的固缩、碎裂现象;琼脂糖凝胶电泳法观察凋亡细胞核小体ＤＮＡ的断裂现象;逆转录－聚合酶链反应技术检测凋亡相关基因ＩＣＥ和ｂｃｌ－２的表达变化。结果与ＲＧＤＳ四肽孵育１０小时后,肾小球系膜细胞出现了典型的凋亡征象,诸如细胞核固缩、碎裂和ＤＮＡ梯形条带等;同时,ＲＧＤＳ四肽处理组的ＩＣＥ和ｂｃｌ－２表达亦明显高于对照组。结论在ＲＧＤＳ四肽诱导的肾小球系膜细胞凋亡过程中,ＩＣＥ和ｂｃｌ－２基因对细胞凋亡可能具有重要的调节作用。     

用差别显示法寻找细胞凋亡的相关基因

目的 寻找参与细胞凋亡的相关基因。方法 天花粉蛋白诱导Ｕ９３７细胞凋亡后,用锚定引物和随机引物进行差别显示ＰＣＲ,回收差异条带,进行ＲＮＡ点杂交。用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝ｃＤＮＡ库,阳性克隆测序,并与凋亡细胞ＲＮＡ行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交。结果 用细胞凋亡时高表达的差异片段筛选胎肝ｃＤＮＡ文库,获得一个１．４ｋｂ的ｃＤＮＡ克隆,该ｃＤＮＡ序列中部分碱基与人Ｂｒｕｔｏｎ酪氨酸激酶高度同源。     

异黄酮增加前列腺癌细胞放射敏感性

目的:研究异黄酮(genistein)与辐射联合应用对DU145前列腺癌细胞放射敏感性的影响.方法:雄激素非依赖型DU145前列腺癌细胞在克隆形成试验中,接受不同浓度的genistein和/或合用辐射,比较DU145细胞的存活率;用DNA Ladder检测细胞凋亡,并辅以TUNEL法观察凋亡形态;流式细胞仪和免疫印迹法分别观察细胞周期改变和相关蛋白表达.结果:克隆形成试验显示,genistein在较低或中等浓度(5～15 μmol/L)时,即可提高DU145细胞的放射敏感性;单独辐射和/或合用genistein 24 h后,细胞凋亡主要见于高浓度genistein(＞30 μmol/L)处理组,72 h后凋亡亦见于较低浓度genistein组;当genistein与辐射合用时,可产生G2/M细胞周期阻滞,72 h后得到大部维持并伴有凋亡和超二倍体细胞群的出现;细胞周期相关蛋白分析提示,随着genistein浓度的提高,周期素B1呈明显双相改变,cdc-2亦呈类似改变,但较轻微,而p21cip1则稳步上升.结论:genistein可提高DU145前列腺癌细胞的放射敏感性,其机理可能与凋亡细胞的增加,细胞周期阻滞和细胞修复功能障碍有关.     

万珂增强NK 细胞对前列腺癌细胞 杀伤作用的实验研究

目的 探讨万珂是否能够增强自然杀伤细胞（NK）对前列腺癌细胞的杀伤作用及其作用 机制。方法 以激素依赖性和激素非依赖性2 种前列腺癌细胞株LNCaP 和DU145 为模型，不同浓度（0、10 和20 nmol/L）万珂处理2 种前列腺癌细胞株24 h。采用Annexin-V/PI 法检测细胞凋亡率，流式细胞术检测 人白细胞抗原-ABC（HLA-ABC）蛋白的表达，实时荧光定量聚合酶链反应检测HLA-C mRNA 的表达。 结果 万珂能提高2 种细胞系对NK 细胞介导的杀伤作用的敏感性，而且在激素非依赖性前列腺细胞株 DU145 细胞中表现更明显。万珂能下调DU145 细胞表面HLA- Ⅰ类分子水平。相对DU145 细胞，万珂对激 素依赖性前列腺癌LNCaP 细胞不敏感，万珂处理后LNCaP 细胞中HLA- Ⅰ类分子也没有改变。结论 万珂 通过下调HLA- Ⅰ类分子的表达，增强NK 细胞对前列腺癌的杀伤能力，特别是增强对激素非依赖性前列腺 细胞的杀伤，该作用能提高前列腺癌的治疗水平。     

白花蛇舌草对人前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察白花蛇舌草提取物对人前列腺癌DU145细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法:不同浓度(0.25 g·L-1、0.5 g·L-1、1 g·L-1)白花蛇舌草提取物作用人前列腺癌DU145细胞24 h、48 h、72 h后,使用CCK-8法检测白花蛇舌草提取物对DU145细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡的改变;实时定量PCR检测COX-2 m RNA和PCNA m RNA的表达;Western bloting法检测Bcl-2、Bax、Caspase3、Cyclin D1蛋白表达。结果:随着作用时间的延长和剂量的增加,白花蛇舌草提取物对DU145细胞增殖抑制率明显提高,呈时效和量效依赖效应。白花蛇舌草提取物作用48 h后,可明显提高细胞凋亡率,下调DU145细胞COX-2 m RNA、PCNA m RNA及Bcl-2、Cyclin D1蛋白表达,上调Bax、Caspase3蛋白表达,呈量效依赖效应。结论:白花蛇舌草提取物能降低人前列腺癌DU145细胞增殖能力,并诱导其凋亡,其机制可能与改变细胞周期和影响凋亡相关基因表达有关。     

硼替佐米对前列腺癌细胞抑制作用及其机制

目的:探讨硼替佐米对前列腺癌细胞DU145的抑制作用.方法:采用MTT法检测硼替佐米对DU145细胞的生长抑制作用,流式细胞技术测定细胞周期和凋亡率,Western blot检测Bik和Caspase-3的表达水平的变化.结果:硼替佐米对DU145细胞的生长抑制作用有时间和浓度的依赖性.1.6 μmol/L的硼替佐米作用DU145细胞后,可见明显细胞核凝聚、皱缩和碎裂;细胞的周期处于G0/G1和G2/M期的细胞比例上升,S期的细胞比例下降(P＜0.05);细胞凋亡率明显增加,显著高于对照组(P＜0.05),Bik和Caspase-3表达水平上调.结论:硼替佐米可明显抑制前列腺癌细胞DU145的生长并诱导其凋亡,凋亡作用机制可能与其上调Bik和Caspase-3表达有关.     

金丝楠木精油抑制人前列腺癌细胞体外生长的研究*

目的：研究金丝楠木精油对人前列腺癌细胞体外生长的影响,为金丝楠木精油预防肿瘤和长寿保健产品的开发与应用提供参考。方法：使用3种不同年份的阴沉金丝楠木、近代金丝楠木和新鲜金丝楠木为实验材料,通过加热升腾的方式提取精油。以人前列腺癌细胞系(PC3、DU145和LNCaP)为检测对象。通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)法检测金丝楠木精油对前列腺癌细胞的抑制情况,计算半数抑制率(50% inhibition concentration, IC50);使用流式细胞仪检测金丝楠木精油对前列腺癌细胞凋亡的影响,评价金丝楠木精油的抗肿瘤活性。结果：3种金丝楠木精油都可以抑制肿瘤细胞生长,新鲜金丝楠木精油对3种前列腺癌细胞系(PC3、DU145、LNCaP)的IC50分别为0.254 200%、0.119 600%和0.094 270%;近代金丝楠木精油对3种前列腺癌细胞系(PC3、DU145、LNCaP)的IC50分别为0.019 960%、0.031 750%和0.016 550%;阴沉金丝楠木精油对3种前列腺癌细胞系(PC3、DU145、LNCaP)的IC50分别为0.008 897%、0.016 850%和0.004 589%,其中效果最好的是阴沉金丝楠木精油,且万分之一含量的阴沉金丝楠木精油可显著诱导人前列腺癌细胞的凋亡,提示金丝楠木精油可能通过诱导凋亡达到抑癌的作用。结论：金丝楠木精油可抑制前列腺癌细胞增殖,促进癌细胞发生凋亡。     

整合素连接激酶对裸鼠前列腺癌的影响

目的：探讨应用整合素连接激酶（ILK）特异siRNA敲除ILK基因对人DU145细胞系裸鼠原位前列腺癌生长及进展的影响。方法：将合成的ILK特异siRNA转染人DU145细胞系,应用逆转录PCR检测ILK在转录水平的表达情况;使用Western blot方法检测ILK在蛋白水平的表达情况。初步探讨敲除ILK基因后对人DU145细胞的黏附、侵袭性的影响及其对细胞骨架结构的影响。分别将ILK siRNA和对照DU145细胞注入裸鼠皮下,每5天1次,连续4周,检测裸鼠前列腺癌肿瘤的大小、分化程度、凋亡及增殖状态来观察ILK对前列腺癌生长的影响。结果：siRNA显著降低了ILK基因的表达,ILK mRNA及蛋白的表达分别被抑制87%与81%。与对照组相比,实验组DU145黏附力及侵袭力显著下降,实验组细胞骨架结构破坏明显。裸鼠种植DU145细胞后5周,实验组与对照组相比,细胞在裸鼠种植部位形成的肿瘤体积明显减小［（18.1±1.3） mm³ vs (157.6±9.7) mm³,P<0.01）］,分化程度变好［Gleason评分（5.8±0.2） vs （ 8.8±0.3）,P<0.05］,凋亡指数增加［（64.75±5.87） vs （38.57±3.45）,P<0.01］,增殖指数减小［(42.75±4.76） vs （88.57±7.57）,P<0.01］。结论：动物实验表明,特异性的抑制ILK能抑制人DU145细胞的黏附及其侵袭能力,破坏DU145细胞骨架的形成,诱导前列腺肿瘤细胞的凋亡及抑制肿瘤细胞的增殖,从而在一定程度上抑制了肿瘤的生长及进展。     

Eg5通过c-Myc/SP1/CDK1通路调节去势抵抗性前列腺癌细胞的恶性增殖

目的：探究纺锤体有丝分裂驱动蛋白（Eg5）对去势抵抗性前列腺癌细胞株DU145生长、凋亡、细胞周期及侵袭转移的调节作用及机制。方法：Eg5 shRNA干扰Eg5在DU145细胞内的表达,小分子抑制剂SB-743921抑制Eg5在DU145细胞内的功能。实验分为对照组、NC shRNA组、Eg5 shRNA组和SB-743921组,MTT实验和单克隆形成实验测定各组细胞生长;Annexin V-FITC和PI双染实验测定各组细胞凋亡;PI单染实验分析各组细胞周期;划痕实验分析各组细胞迁移能力;q-PCR和Western blot评价各组细胞内c-Myc、SP1、CDK1、Cyclin A1、Cyclin B1、CDC25B、N-cadherin、Vimentin及E-cadherin的表达情况。结果：NC shRNA组与对照组各指标差异均无统计学意义（P ＞0.05）。Eg5 shRNA组、SB-743921组与对照组比,细胞增殖及迁移能力降低、细胞凋亡增加,细胞周期阻滞在G2/M期,差异均有统计学意义（P ＜0.05）。Eg5 shRNA组、SB-743921组与对照组相比,细胞内c-Myc和SP1的表达量降低（P ＜0.05）,调控G2/M期基因CDK1、Cyclin A1、Cyclin B1及CDC25B的表达降低（P ＜0.05）,同时调控细胞迁移基因N-cadherin和Vimentin的表达量降低,E-cadherin的表达量增加（P ＜0.05）。结论：有丝分裂驱动蛋白Eg5可能通过c-Myc/SP1/CDK1通路调节去势抵抗性前列腺癌的恶性增殖和侵袭转移,是治疗前列腺癌的潜在靶点。     

微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12和硝基化酪氨酸对前列腺癌细胞生长的影响

摘要 目的 研究微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12和硝基化酪氨酸对前列腺癌生长的影响。方法 利用PWR1E,RWPE1和DU145细胞株,通过蛋白质印迹分析、siRNA实验和MTT实验,检测微管蛋白酪氨酸连接酶类似物12和硝基化酪氨酸微管蛋白的含量,并观察细胞的生长情况。结果 在硝基化酪氨酸的作用下,DU145细胞的硝基化酪氨酸微管蛋白含量低于PWR1E和RWPE1细胞（P＜0.05）;和对照组相比,PWR1E和RWPE1实验组细胞生长受到抑制（P＜0.05）,而DU145细胞生长无明显改变（P＞0.05）;在有效沉默TTLL12后,实验组的硝基化酪氨酸微管蛋白含量高于对照组（P＜0.05）;实验组在硝基化酪氨酸作用下,细胞生长受到抑制,与对照组相比,差异有统计学意义（P＜0.05）,而对照组内两组细胞生长改变较小,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 TTLL12可使前列腺癌细胞逃避硝基化酪氨酸的打击,从而使前列腺癌细胞逃脱机体监控作用,获得异常增殖机会,而对这一调控机制的进一步研究,将有助于控制肿瘤细胞的生长。     

全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究

目的 从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性。方法 以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过“吸附-洗脱-扩增”对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集。采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆。阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体。采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性。结果 以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力最高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体。流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11 ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合。结论 通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础。     

阻断MAPK通路对前列腺癌细胞增殖的影响

目的：研究前列腺癌进展中细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的变化，探讨阻断此通路对前列腺癌细胞增殖的影响。方法：用MTT法检测表皮生长因子（EGF）、PD98059对前列腺癌细胞系LNCaP、PC 3和DU145增殖的影响；用Western blot法检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）表达和磷酸化ERK1/2水平的差异，以及EGF、PD98059对细胞ERK1/2磷酸化水平的影响。结果：EGF促进LNCaP、PC 3和 DU145的增殖，PD98059抑制细胞增殖；Western blot结果显示，3株前列腺癌细胞的总ERK1/2无明显差异。在血清饥饿的状态下，LNCaP细胞无ERK1/2的活化,而PC 3和 DU145细胞ERK1/2处于持续活化的状态。PD98059能够阻断EGF对3株前列腺癌细胞ERK1/2的激活。结论：MAPK通路的持续活化在前列腺癌的恶性进展中起重要作用，阻断此通路可以抑制前列腺癌细胞的增殖。