CD123和CD66c在儿童B-ALL中的表达及其在MRD监测中的应用

目的探讨CD123和CD66c在儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)中的表达及其在微小残留病(MRD)监测中的应用价值。方法采用多参数流式细胞术(MFC)检测141例初诊B-ALL患儿CD123和CD66c在骨髓中的表达情况。另选取25例急性髓系白血病(AML)患者作为对照组,经治疗症状完全缓解后采集其骨髓标本,所有标本均含比例不等的正常增生B系前体细胞。当初诊患儿抗原表达不同于对照组时,选取CD10/CD34/CD19/CD45做进一步MRD抗体组合检测。结果 CD123和CD66c在正常增生B系前体细胞和成熟B淋巴细胞中均不表达。在141例B-ALL患儿中,分别有88例(62.41%)CD123和70例(49.65%)CD66c表达阳性。分别有45例选择CD123和52例选择CD66c用于MRD监测,选择CD123和CD66c用于监测的病例有35例,选择CD123或CD66c用于监测的病例有62例,覆盖率为43.97%。CD123和CD66c在MRD监测中均具有良好的稳定性,无衰减或变弱。结论 CD123和CD66c均可用于儿童B-ALL MRD监测,但需联合其他筛选指标,以提高MRD监测的覆盖率。     

骨髓中CD4+CD25highFoxp3+调节性T细胞与儿童急性B淋巴细胞白血病的相关性研究

目的通过检测急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿骨髓中叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)mRNA的表达及CD4+细胞中调节性T细胞(Treg)比例,探讨Treg与儿童B-ALL发生及预后的关系。方法用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测10名正常儿童、35例初发B-ALL患儿及68例临床缓解患儿骨髓中Foxp3mRNA水平;用流式细胞术检测上述骨髓标本中CD4+CD25highFoxp3+Treg的比例;利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测骨髓中细胞因子白细胞介素10(IL-10)的表达情况。结果骨髓中Foxp3 mRNA表达水平在B-ALL初发患儿组是对照组的4.44倍,微小残留病(MRD)阳性组是阴性组的2.39倍;B-ALL初发患儿骨髓中Treg占CD4+T淋巴细胞的比例[中位数(M)=12.77%]较对照组(M=8.09%)增高,差异具有统计学意义(P<0.01);MRD阳性组Treg比例(M=14.74%)与MRD持续阴性组(M=11.30%)比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。治疗后MRD阳性组骨髓中IL-10水平[(24.69±11.73)pg/mL]显著高于MRD持续阴性组[(9.19±5.82)pg/mL,P<0.05]。结论 B-ALL初发和MRD阳性患儿骨髓中Foxp3 mRNA水平和Treg比例显著增高,且骨髓中IL-10水平与Treg的比例变化趋势相一致。Treg可作为评价B-ALL患儿预后和复发的指标,Treg可能是通过分泌抑制性细胞因子IL-10而发挥其抑制作用。     

CD+4 Foxp3+调节性T淋巴细胞在儿童急性白血病中的表达及其与微小残留病的关系

目的 研究调节性T淋巴细胞(regulatory T cell,Treg)在白血病患者体内的表达情况,探讨Treg的增高与白血病疗效监测与白血病微小残留病(minimal residual disease,MRD)预后指标之间的关系.方法 建立Foxp3-FITC/CD-25PE/CD4-PerCP/CD3-APC四色流式细胞术检测Treg的方法 ;比较10例正常骨髓标本以及33例白血病初发患者[急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)17例,急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)9例,急性髓细胞白血病(AML)7例]骨髓标本中Treg的数量;结合56例临床缓解患者MRD监测结果 ,评估Treg作为白血病患者预后判断评价指标的价值.结果 正常骨髓组Treg占CD+4T淋巴细胞的比例中位数(M)为8.09%,初发自血病组M为12.77%,两者差异有统计学意义(U=3.41,P<0.01);而在B-ALL、T-ALL和AML组的差异无统计学意义(H=1.22,P>0.05).Treg数量与临床病理学参数无显著相关性.此外,Treg数量在MRD阳性组(M=14.74%)与MRD持续阴性组(M=11.3%)中的差异有统计学意义(t=252.5,P<0.05).结论 白血病初发患儿体内的Treg数量显著增高,且患儿中Treg表达水平与MRD有关联.高水平Treg预示白血病患儿预后较差,存在复发的可能.     

CD66c在成人急性白血病细胞上的表达及意义

目的探讨CD66c及其基因CEACAM6在成人急性白血病细胞上的表达及意义.方法体外培养HL-60、K562、LCL721.221和Jurkat等急性白血病细胞,RT-PCR检测急性白血病患者骨髓细胞和白血病细胞中CEACAM6 mRNA的表达,并用多参数流式细胞术检测白血病细胞及白血病患者骨髓细胞CD66c分子的表达.同时对199例白血病患者骨髓细胞作细胞遗传学分析,并对25例CD66c阳性急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者进行白血病微量残留病（MRD）分析.结果①HL-60、K562、LCL721.221和Jurkat细胞的细胞膜和细胞质CD66c均阴性.②127例急性髓系白血病（AML）患者中4例CD66c阳性（3.15%）,以M2、M4为主;79例ALL中CD66c阳性28例（35.44%）,均为B-ALL;CD66c只在common B-ALL（54例中有20例）和pre B-ALL（11例中有8例）亚型表达,8例Ph＋B-ALL患者CD66c均阳性.③MRD阳性与阴性组患者比较,6个月内复发率差异有统计学意义（维持治疗14周时MRD阳性者8例,其中6例复发;MRD阴性者17例,其中2例复发）.④CEACAM6 mRNA在CD66c阳性B-ALL细胞强表达,在HL-60细胞呈弱表达,在K562、LCL721.221和Jurkat细胞不表达.结论CD66c在ALL中阳性表达是白血病MRD检测的标志之一.CD66c抗原表达与CEACAM6 mRNA的表达高度相关.     

四色流式细胞术检测B细胞急性淋巴细胞白血病微量残留病的临床意义

目的探讨利用四色流式细胞术（FCM）检测B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）微量残留病（MRD）的临床意义.方法采用以抗CD34/CD10/CD45/CD19为主的两种四色荧光标记抗体组合,对98例B-ALL患者的671份骨髓标本和1份脑脊液标本进行FCM多参数MRD检测,98例随访患者中26例无发病初期的免疫分型资料.结果FCM检测显示白血病细胞＜0.0001（MRD阴性）的标本为579份;白血病细胞＞0.0001的样本数为93份,其中64份骨髓标本白血病细胞比例＜0.05,29份标本白血病细胞比例＞0.05,我们将其归为复发病例（包括治疗后未达CR的病例）.共20例患者复发,其中19例血液学复发,1例中枢神经系统复发.15例血液学复发者在复发前7～17周发现MRD阳性,包括发病时免疫分型资料不明者6例,MRD水平均＞0.0001;2例分别在复发前3个月和9个月检测MRD为阴性,此后中断检测.在诱导治疗结束和治疗3个月时,如果MRD水平＞0.0001,复发率为50%（12例中有6例复发）,而MRD阴性组复发率为7.5%（40例中有3例复发）（P=0.000）.结论利用FCM进行MRD跟踪监测可预测复发,治疗初期患者MRD＞0.0001,复发的危险性较高.而在掌握了正常B祖细胞抗原表达规律的基础上,可不完全依赖于发病时的免疫表型资料.     

八色流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病微小残留病方法的建立

目的 建立八色流式细胞术(8c-FCM)检测急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)微小残留病(MRD)的方法,并进行初步验证.方法 采用CD19/侧向角散色光(SSC)、CD45/10和CD34(或cTdT)联合设门,两管八色抗体组合检测B-ALL的MRD.将B-ALL细胞株Nalm-6细胞掺入正常人骨髓细胞中,使Nalm-6细胞占有核细胞比例为10.00％、1.00％、0.10％、0.01％和0.005％,采用已建立的8c-FCM,进行回收试验和重复性试验,评价检测方法的准确度和精密度.检测抗体标记Nalm-6后保存不同时间的荧光强度变化,评价各荧光抗体的稳定性.检测并分析39份骨髓细胞免疫表型,包括对照者9例,初发或复发B-ALL患者9例,B-ALL化疗或骨髓移植(BMT)后缓解期病例21例,评价8c-FCM方法检测正常骨髓B淋巴系细胞群和B-ALL细胞的免疫表型结果,以及对B-ALL的MRD 检测结果,并探讨其与现用四色流式细胞术(4c-FCM)的可比性.结果 建立了以CD19、CD45、CD10为主的两管八色抗体组合检测MRD的方法;当掺入的细胞株占有核细胞比例≥0.10％时,变异系数(CV)＜2.5％,平均回收率为95.81％;当获取106个细胞,Nalm-6细胞比例10.00％ ～0.01％时,检测到的Nalm-6细胞占骨髓有核细胞比例与实测值呈线性相关(r=0.99,P＜0.05),该法检测骨髓中Nalm-6细胞的灵敏度达到0.01％.Nalm-6细胞株标记抗体后随时间延长略有降低,但24h内平均荧光强度减低＜10％.应用该方法检测骨髓中CD19阳性的B淋巴系细胞,对照组呈现4个连续发育阶段,可分为4期:Ⅰ期CD45low/CD10stro/CD20 -/CD38stro/CD34+或cTdT+,Ⅱ期CD45 +/CD10+/CD20-/CD38stro/CD34+或cTdT+,Ⅲ期CD45 +/CD10 +/CD20-/CD38stro/CD34 -或cTdT-,Ⅳ期CD45stro/CD10 -/CD20 +/CD38low/CD34 -或cTdT -.初发和复发B-ALL患者骨髓中白血病细胞与对照组相比,均存在抗原表达异常;8c-FCM检测B-ALL缓解组,有5例存在MRD,主要抗原表达与4c-FCM检测结果一致,5例MRD细胞的范围为0.02％～5.42％.结论 本研究所建立的两管8c-FCM新方法检测骨髓中白血病细胞的重复性好、准确度高,可鉴别骨髓正常B淋巴系细胞群、B-ALL治疗缓解后骨髓造血重建的B系前体细胞与MRD细胞群;和4c-FCM比较,两管8c-FCM新方法的标本用量少,检测速度快,能够有效诊断B-ALL的MRD.     

初治与复发B细胞急性淋巴细胞白血病患者白血病相关免疫表型的比较

目的比较初治和复发时B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的白血病相关免疫表型（LAIP）特点,探讨其对微量残留病（MRD）监测的影响.方法标记4～6组四色抗体组合,利用多参数流式细胞术（FCM）以CD45/SSC设门对410例初治和6例复发的B-ALL患者进行免疫分型检测.并采用CD34/CD10/CD45/CD19为主的2种四色荧光标记抗体组合,对98例B-ALL患者进行多参数FCM MRD检测.结果与初治B-ALL患者相比,复发患者中CD45异常表达者明显增多,分别为37.8%和69.2%（P=0.000）.通过对15例初治和复发患者的配对样本分析,9例患者（包括8例骨髓复发,1例中枢神经系统复发）出现免疫标志变化,其中4例患者CD45表达减弱,2例增强;4例患者CD34表达减弱;2例患者CD10表达增强,而CD19较稳定.对7例骨髓复发患者进行了MRD随访检测,均在复发前的2～4个月发现MRD,并且表型与复发后一致.结论较高比例的复发患者出现免疫表型变化,这种改变在复发前的MRD状态时已经出现,但不影响MRD监测的准确性.     

CD133两种亚型分子在儿童B系急性淋巴细胞白血病中的表达及其临床意义

本研究旨在探讨B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿初诊和治疗33 d时CD133两种亚型分子CD133-1和CD133-2的表达及其与临床预后指标的关系。用流式细胞术检测B-ALL患儿上述两个时间点骨髓单个核细胞的CD133-1、CD133-2表达和治疗33 d时微量残留病(MRD)的变化。结果表明,B-ALL初诊组48例中CD133-1阳性表达18例(37.5%),CD133-2阳性表达30例(62.5%,P<0.05);治疗33 d组25例中CD133-1阳性表达2例(8.0%),CD133-2阳性表达23例(92.0%,P<0.05)。诱导化疗后CD133-1的表达显著减少,但高于正常对照组;而CD133-2的表达下降缓慢。结论:初诊B-ALL患者CD133表达与其性别、年龄、外周血白细胞计数、骨髓幼稚细胞比例、FAB亚型、细胞遗传学异常、融合基因表达、危险等级及完全缓解率等均无相关性。B-ALL患儿CD133-2阳性表达高于CD133-1,CD133表达与CD34表达无相关性。CD133-2的表达与MRD显著相关。     

动态监测微小残留病对B—ALL预后的临床意义

目的探讨微小残留病（MRD）监测在B急淋（B-ALL）复发预测及指导治疗中的临床意义。方法选择2008年1月到2012年7月32例初治急性B淋巴细胞白血病160份骨髓标本,利用四色多参数流式细胞术（FCM）进行微小残留病检测。以CD45／SSC设门,选择2-3组四色抗体组合,从诱导化疗第33天开始,每1—3个月监测MRD一次,动态监测MRD变化与白血病复发的关系。结果按照诱导治疗第33天的MRD水平分成三组,高（MRD〉1×10^-2）,中（1×10^-2≥MRD≥1×10^-4）,低（MRD〈1×10^-4）;MRD〉10^-2组与MRD％10^-4组比较复发率筹异有统计学意义（P〈0．05）;10^-4≤MRD≤10^-2组与MRD％10^-4组比较复发率差异无统计学意义（P〉0．05）。MRD％10t是预后好的指标。儿童B-ALL多次发现MRD阴性、阳性（10^-4≤MRD％10^-2）交替出现,一直未复发;B-ALL。病人复发前次MRD值均大于10^-2,且在g-6个月内复发。结论MRD阳性比形态学复发出现早,凼此连续监测MRD对白血病预测复发和指导个体化治疗有重要意义。     

淋巴细胞功能相关抗原-3(CD58)在儿童期急性B淋巴细胞白血病近期疗效判断中的应用

本研究评估CD58在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)近期疗效判断中的价值。应用四色流式细胞分析技术观察135例儿童期B-ALL患者CD58分子的表达特点;建立用CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合检测B-ALLMRD的方案;结合CD58的表达情况和MRD监测结果分析CD58在B-ALL中的预后价值。结果表明135例B-ALL的平均CD58MFI为113.08±63.33,15例正常骨髓的CD19+CD10+细胞的平均CD58MFI为14.68±5.26,两者差异显著(P<0.01);51.9%(70/135)B-ALL患者的CD58分子强表达,可以用CD58为指标进行MRD检测;CD58/CD10/CD34/CD19抗体组合的有效频率仅次于TdT/CD10/CD34/CD19,为51.9%;CD58高表达组的MRD阳性率显著低于CD58低表达组(P<0.05)。结论CD58可以作为B-ALLMRD检测的指标,此结果丰富了MRD检测的组合;CD58的高表达可以作为B-ALL预后较好的指标。     

CD37在恶性B细胞中表达意义的探讨

本研究旨在探讨CD37抗原在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）及B细胞非霍奇金淋巴瘤（B—NHL）细胞中表达的意义。利用多参数流式细胞仪检测对照骨髓标本、B—ALL标本及B—NHL标本细胞中CD37的表达。结果表明,20例B-ALL细胞[初治5例,伴微小残留病（MRD）15例]低表达CD37（1．04±0．24;1．50±0．89）,正常前体B细胞也低表达CD37（1．64±0．52）,3组间CD37表达水平无统计学差异（P〉0．05）。正常成熟B细胞和B—NHL细胞均高表达CD37（14．23±7．84和14．53±10．93）,它们之间差异无统计学意义（P〉0．05）。正常B细胞不同发育阶段的cD37表达水平比较显示,B祖细胞低表达cD37（0．88±0．17）,B前体细胞cD37表达增高（2．44±0．69）,成熟B细胞CD37表达最高。结论：低表达cD37并非B-ALL细胞所特有。幼稚B细胞低表达CD37,随着B细胞的成熟CD37的表达强度逐渐升高,亦即CD37在B细胞中的表达与细胞的良恶性无关。     

四色流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病残留细胞

目的探讨利用多参数流式细胞术检测急性B淋巴细胞白血病(BALL)残留细胞的方法和意义。方法采用四色流式细胞术,以4～6组四色抗体组合检测213例BALL患者免疫分型;以CD34、CD10、CD45、CD19为主的2种四色荧光标记抗体组合监测50例297份BALL患者骨髓标本微量残留白血病细胞,同时检测分析26份化疗后处于再生期骨髓标本中B祖细胞的免疫表型特点,并以相对定量方法比较了再生期B祖细胞与B系白血病细胞CD10、CD19和CD34表达量的差异。结果213例BALL患者中,71.8%患者存在CD45、CD34、CD19、CD10表达量的异常,只存在CD38弱阳性及髓系标志患者占8.1%。微量残留白血病细胞监测的50例患者中,12例患者存在0.06%～7.73%的白血病细胞,其中11例残留白血病细胞以CD45、CD34、CD19、CD10异常表达为主。50例患者中5例临床复发,4例在复发前7～17周微量残留病(MRD)检测阳性,且均>0.1%,1例MRD检测阴性。再生期B祖细胞依据CD45、CD34、CD19、CD10、CD22和CD20表达不同可分为3期。结论多参数流式细胞术检测MRD具有快速、敏感可定量的优势,对白血病复发有更强的预测性。     

流式细胞术对急性白血病免疫分型的临床意义

目的探讨流式细胞术(FCM)在急性白血病免疫分型中的临床意义。方法利用CD45/SSC设门的四色荧光FCM检测42例急性白血病病人骨髓细胞表面标记。结果分别以cCD3c、CD79a、cMPO作为T-ALL、B-ALL、AML的系列特异性标记。30例AML中cMPO阳性率为90.0%;12例B-ALL中cCD79a阳性率为91.7%.42例患者中有交叉免疫标记的占40.5%,其中髓系白血病中常见交叉表达淋系抗原CD56、CD7、CD19、CD10;淋巴细胞白血病中常见交叉表达髓系抗原CD13、CD33等。M2出现交叉表达现象最多见,阳性率为76.9%,常见表达CD56。伴CD56、CD7交叉表达的AML预后差。结论利用流式细胞术进行免疫表型分析对急性白血病的诊断及预后判断具有重要临床意义。     

B淋巴细胞白血病骨髓B细胞CD34+CD38+和CD34+CD38low/-细胞亚群的临床意义

本研究比较发病时免疫表型为CD34+CD38+和CD34+CD38low/-两组B淋巴细胞白血病(B-ALL)的生物学特性,并探讨其临床意义。选取54例初发B-ALL并经多参数流式细胞术检测为CD34+的B-ALL患者,根据CD38表达不同将其分为CD34+CD38+组(n=35)和CD34+CD38low/-组(n=19)。利用实时定量PCR的方法分别进行BCR-ABL,TEL-AML1和WT1基因的检测。随访标本利用7色流式细胞术检测微量残留病(MRD),平均随访时间12个月(1-28个月),平均随访间隔2个月(1-5个月)。结果表明,两组患者发病时WBC,血小板和血红蛋白水平及BCR-ABL,TEL-AML1和WT1基因阳性表达的比例均无统计学差异(P>0.05)。在诱导缓解后,CD34+CD38+组微量残留病阳性(MRD+)为28.57%(10/35),CD38low/-组MRD+为68.42%(13/19),CD34+CD38low/-组MRD+的检出率明显高于CD34+CD38+组(P<0.01)。在复发率上,CD34+CD38+组有2例,分别在第94天和第245天复发,复发率为5.71%(2/35)。CD34+CD38low/-组有7例复发,复发率为36.84%(7/19),中位复发时间263 d(46-468 d),两组间具有明显统计学差异(P<0.01)。本研究以16岁为年龄分界点,CD34+CD38+组16岁以上患者为8人(8/35),CD34+CD38low/-组16岁以上患者为10人(10/19),两组间有统计学差异(P<0.05)。结论:CD34+CD38low/-患者在成人中比例较高,且CD34+CD38low/-组在治疗后更易出现MRD+和复发。