SARS的免疫学检测

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是一种新的人类尚未完全认识的传染病，在SARS发病进程中免疫系统发生了很大的变化。本文主要介绍SARS的特异性抗体和抗原检测、SARS病人外周血免疫细胞和外周血细胞因子测定及免疫病理学检查等，并探讨SARS的发病机理。     

微流控蛋白印迹杂交与传统Western blot对目的蛋白的检测效果比较

目的借助微流控蛋白印迹实验实现对目的蛋白省时、省力和省试剂的定性以及相对定量分析。方法选取O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)蛋白为目的蛋白,选用高表达MGMT蛋白的MCF7细胞为细胞模型,用传统蛋白印迹杂交和纸芯片蛋白印迹杂交实验法对经过药物MGMT阻断剂(lomeguatrib)处理后MCF7细胞的MGMT蛋白表达量做定性以及相对定量分析。结果纸芯片蛋白印迹杂交可以成功进行MGMT的定性、相对定量分析,而且上样检测量可低至10~25 pg。这相比于传统Western blot的上样检测蛋白检测限1~5 ng,提高了3个数量级。整个操作流程只需要1 h,所用试剂量少,实验成本更低。而且,纸芯片的多通道构造可以实现如同反向蛋白杂交分析(RPPA)一样的,对组织蛋白表达量进行高通量的系统检测。结论微流控蛋白印迹杂交相较于传统Western blot可以检测到更微量级的蛋白,节省试剂和样品,省时和省力,并可进行高通量的定性以及相对定量分析。     

光学蛋白芯片检测免疫球蛋白抗体的研究

利用椭偏光蛋白芯片检测系统，在光学硅片上装配人类免疫球蛋白G作为感应层，利用能与其抗体特异性结合的特点，对样品中人类免疫球蛋白G抗体进行定量检测，结果表明，此系统能用于蛋白质定量检测。     

S100A10蛋白的表达及其抗体的制备

目的制备S100A10蛋白及其特异性抗体。方法用PCR扩增编码S100A10的基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的蛋白产物经镍柱亲和层析纯化后,作为抗原皮内接种免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体,分别以ELISA,Western blot法检测抗体的滴度和抗原特异性。结果成功构建原核表达载体pET28a(+)-(S100A10)2,得到纯化的(S100A10)2蛋白,制备的多抗具有较高的抗体滴度和抗原特异性。结论建立了S100A10原核表达及纯化系统,成功制备了S100A10的多克隆抗体,为S100A10的进一步研究提供了工具。     

凝血酶调节蛋白植物凝集素样片段的原核表达及抗体制备

目的：制备凝血酶调节蛋白(thrombomodulin，TM)抗体。方法：原核表达目的蛋白，将表达的融合蛋白纯化后免疫小鼠。以EVC304包板的cell—ELISA检测抗体滴度，用Western blot和免疫组化鉴定抗体特异性。结果：目的蛋白在大肠杆菌中大量表达形成包涵体，将表达蛋白纯化并复性后免疫小鼠，3次免疫后得抗体效价为1：4000，经加强免疫后抗体效价达到1：8000；特异性较好。结论：在天然TM提取纯化困难的情况下，通过原核表达目的蛋白制备抗体是可行的。     

前体mRNA剪接蛋白Tra2α特异抗体的制备和鉴定

目的 :制备用于检测人胚胎组织Tra2α蛋白的特异抗体。方法 :选择Tra2α中特有的一段编码序列 (第 5 2～ 16 5位核苷酸 ) ,通过克隆至pGEX 3x表达载体形成GST融合基因 ,并以诱导表达和纯化的该融合蛋白为抗原免疫新西兰兔 ,获得了抗Tra2α的血清。结果 :免疫印迹 (Westernblot)检测结果显示 ,该血清能特异地与人胎脑组织中的Tra2α蛋白结合。免疫组织化学结果显示 ,该血清能用于人胎脑组织中Tra2α蛋白分布的检测。结论 :所制备的抗血清具有很好的特异性 ,可用于人胚胎组织中Tra2α蛋白的检测。     

北京地区人Boca病毒外壳蛋白VP2的原核表达及抗原性初步分析

目的 获得新发现的北京地区人Boca病毒(HBoV)主要外壳蛋白VP2,为对该病毒病原学的深入研究打下基础.方法 从已证明为HBoV阳性的临床标本BJ3722中经PCR扩增得到HBoV VP2蛋白编码区基因片段,将其克隆至pUCm-T载体中,然后再亚克隆至原核表达载体pET-30b(+),经双酶切、PCR、序列测定等方法 挑选、鉴定阳性克隆,得到重组表达质粒pET-30b-VP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的温度下利用IPTG诱导蛋白表达;对得到的蛋白表达产物粗提物经Ni2+亲和层析纯化后,利用抗组氨酸抗体、兔抗HBoV-VP2多肽免疫血清及人血清进行抗原性初步分析.结果 BJ3722 VP2基因正确插入pET-30b中,开放阅读框架正确,表明得到了预期的pET-30b-VP2重组原核表达质粒.比较25℃、30℃、37℃ 3个不同温度下的蛋白表达产物,以25℃ 1 mmol/LIPTG诱导培养过夜后产生的带6×His标记的重组VP2蛋白量最大,主要以包涵体形式存在.VP2蛋白粗提物经Ni2+亲和层析,在pH4.5时获得较理想的纯化结果.Western blot显示所表达的蛋白质能够与抗组氨酸特异性抗体、兔抗HBoV-VP2蛋白多肽免疫血清以及人血清发生反应.结论 本研究成功构建了重组pET-30b-VP2原核表达质粒,改善了表达及纯化条件,得到了较大量的HBoV-VP2蛋白表达,并初步证明表达产物具有抗原特异性,可用于对这一新发现病毒的进一步深入研究.     

酵母表达的重组戊型肝炎病毒ORF2蛋白在实验感染恒河猴血清抗体检测中的应用

诊断试剂的研制和开发亦是戊型肝炎研究的重要内容 ,以Ｅ .Ｃｏｌｉ及昆虫细胞表达的重组戊型肝炎病毒 (ＨＥＶ)ＯＲＦ2蛋白作为抗原建立的免疫学检测方法已应用临床戊型肝炎的诊断、实验感染灵长类动物抗戊型肝炎病毒 (ＨＥＶ)抗体的检测以及ＨＥＶ特异性抗原的检测。这些方法包括 :Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ,ＩＦＡ、ＥＬＩＳＡ等。研究证实 ,重组ＨＥＶＯＲＦ2蛋白具有较好的抗原性〔1 3〕。我们应用巴氏毕赤酵母 (Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ)成功表达了戊型肝炎结构区蛋白ＯＲＦ2 ,制备了新型重组ＨＥＶＯＲＦ2 〔4〕,将其作为抗原建…     

检测结核分枝杆菌蛋白抗原b夹心ELISA的建立及其应用

目的 建立定量检测脑脊液中结核分枝杆菌蛋白抗原b的夹心ELISA,以便用于诊断结核性脑膜炎.方法 制备抗结核分枝杆菌蛋白抗原b鼠源性单克隆抗体(mAb)及兔多克隆抗体;以单克隆抗体为包被抗体,多克隆抗体为检测抗体,建立检测结核分枝杆菌蛋白抗原b的双抗体夹心ELISA;应用此方法检测正常人(n=6)、非结核性脑膜炎患者(n=26)及临床确诊结核性脑膜炎患者(n=42)的脑脊液标本中蛋白抗原b的含量,并分析其与结核性脑膜炎活动性感染的相关性.结果 成功建立了检测蛋白抗原b的夹心ELISA,敏感度可达0.4 μg/L.应用该方法在正常人及非结核性脑膜炎患者脑脊液中未检测到蛋白抗原b;在结核性脑膜炎患者脑脊液中蛋白抗原b含量显著升高.结论 建立了敏感、特异检测结核分枝杆菌蛋白抗原b含量的ELISA,为活动性结核性脑膜炎的诊断提供一种有效手段.     

丙型肝炎病毒抗体与核心抗原联合检测的诊断效能研究

目的 探讨丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)与核心抗原(HCV-cAg)联合检测对丙型肝炎的诊断效能.方法 经重组免疫印迹试验确证的92例阳性标本,81例阴性对照标本,同时进行HCV-Ab和HCV-cAg检测,分析HCV-Ab检测法、HCV-cAg检测法及两者联合检测法的敏感性、特异性和ROC曲线下面积.结果 HCV-Ab检测法敏感性为79.3％,特异性为93.8％;HCV-cAg检测法敏感性为87.0％,特异性为90.1％;HCV-cAg与HCV-Ab联合检测法敏感性为92.4％,特异性为88.9％.三种试验比较,敏感性差异有统计学意义(P＜0.05),特异性差异无统计学意义(P＞0.05).三种方法ROC曲线下面积分别为0.866、0.885和0.906.HCV-cAg与HCV-Ab联合检测法,诊断准确性较高.结论 HCV-cAg与HCV-Ab检测方法的联合应用对于丙型肝炎的诊断效能较高.     

一种双抗体夹心ELISA检测热休克融合蛋白方法的建立

MUC1蛋白在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞都呈现高水平表达。MUC1蛋白的表位肽VNTR，是诱生MUC1特异性免疫应答的靶点；采用MUC1 VNTR多肽研制出的生物制剂能刺激小鼠抑制表达MUC1肿瘤细胞的生长。     

人精子膜抗原的制备及其在人精子抗体检测中的应用

精子表面的抗原与受精和胚胎的早期发育有密切关系，其中部分抗原能引起机体产生相应的抗体，从而影响到精子的受精功能和胚胎的发育，导致免疫性不育。因此对人类精子膜抗原的研究有助于从蛋白质水平来揭示受精的过程和不育的机制，为不育特别是免疫性不育的治疗及免疫避孕开辟一条新途径。因为精子膜比较坚固，难以破碎和溶解，不易得到较高浓度的精子膜抗原。而且即使精子膜被破碎溶解后，往往有许多种抗原成分混在一起，为了提取一种成分，常需反复分离。目前常用的是先用物理或化学方法溶解精子膜，再用分段分离的方法纯化各种抗原，如Hinsch、Diekman等所用方法。为了减少反复分离的麻烦，我室摸索了提取精子膜抗原的方法并对其进行了分析，现报道如下。     

抗人β防御素3融合蛋白抗体的制备及其活性检测

目的：人抗菌肽β防御素3（HBD3）除具有杀灭多种病原菌的作用外，还参与机体免疫防御的多个过程，本实验的目的是进一步了解HBD3在人体的生物功能。方法：通过将编码HBD3成熟链的基因与载体pGEX—KG相连，表达出谷胱甘肽s转移酶与HBD3（GST—HBD3）的融合蛋白，制备HBD3的抗体。结果：通过Western blot检测及免疫组化方法证实HBD3抗体的制备成功，显示了HBD3蛋白在食道上皮细胞的表达部位。结论：为进一步了解HBD3在人体的功能及其在疾病状态下的改变奠定了坚实的基础。     

双抗原夹心法检测抗HIV-1/2总抗体方法的建立和评价

目的 进一步提高HIv感染诊断试剂的敏感性。方法 以人工合成的HIv—1 gp41．1(sP1)、gp41．2(sP2)、gp120(sP3)、P24(sP4)和HIV—2gp36(sP5)5条多肽，采用双抗原夹心酶链免疫吸附试验(ELISA)原理，以sP1、sP3、sP4和sP5混合包被酶标板作为因相抗原，辣根过氧化物酶标记sp1、sp2、sP4和sP5多肽为标记物，建立了检测抗HIV—1／2总抗体的双抗原夹心ELISA法。结果 检测卫生部药品生物制品检定所第2代40份质控参比血清，其特异性和灵敏度均为100％，高于间接ELISA法(特异性为90％，灵敏度为65％)。检测210份其他病种患者血清均为阴性，与雅培HIVAB试剂比较检测如份健康献血员血清和88份HIv感染者血清，符合率为100％。结论 本方法特异性强、敏感性高，操作简便，适用于献血员的筛选和临床HIv感染的检测。     

比浊法和单扩法检测C—反应蛋白的结果评价

目的 通过采用速率散射比浊法和单向免疫扩散法对人血清中C-反应蛋白的检测,对这两种实验方法进行评价.方法 收集60份感染性疾病息儿血清标本分别采用比浊法和单扩法检测CRP,并在60份血清标本中随机取20份混合,两种测试方法同时测定CRP 20次作重复性试验.结果 两种方法检测CRP其结果无差异(p>0.05).重复性试验结果,比浊法CV％为2.7％,单扩法CV％为7.7％.结论 两种方法检测CRP结果虽无差异,但比浊法在检测时间、操作方法、精确度、灵敏度、重复性等方面均优于单扩法.     

我国HIV-1流行株gp41抗原表位筛选与串联表达

目的探讨HIV-1gp41抗原表位串联表达蛋白用于HIV抗体检测的可行性。方法用HIV-1gp41蛋白亲和层析柱制备HIV-1感染者血清中的多克隆抗体，用噬菌体展示随机十二肽库进行生物淘洗，反向吸附非特异性噬菌体。经ELISA鉴定阳性克隆，DNA测序，确定优势表位。将优势表位与文献报道的另一个优势表位串联，克隆人pQE30载体进行蛋白表达。结果成功筛选到位于HIV-1 gp41蛋白上的优势抗原表位(YGPKDAETTAIW)，串联表位(YGPKDAETTAIW-GGGS-SC-SAKFTCTTQI)在pQE30载体中实现可溶性表达。重组蛋白具有良好的抗原性，能与不同的HIV-1抗体阳性血清呈特异反应。结论HIV-1 gp41抗原表位串联表达设计足可行的，串联表位重组蛋白可用于HIV-1抗体检测，但检测灵敏性低于常规方法。     

新的肝脏特异性自身抗原的筛选、克隆、表达的研究

自身抗体特别是肝脏特异性目身抗体是目身免疫性肝病的主要特点，也是自身免疫性肝病的诊断和分型的主要标志。我们在2例高度怀疑自身免疫性肝病的患者血清中检测到一新的不明肝特异性自身抗体，应用表达性噬菌体文库筛选技术对未知自身抗原进行筛选鉴定，以期建立更为完善的自身抗体检测体系，进一步明确自身抗原在自身免疫性肝病发病机制中所起的作用。     

人内皮唾液酸蛋白改良双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立肿瘤内皮标志物1(tumor endothelial marker 1,TEM 1)ELISA检测方法,依据TEM 1基因胞外区片段序列及原核表达载体pMAL-p5x多克隆位点设计引物,采用PCR技术从含TEM 1全长基因载体中扩增目的片段,将双酶切的目的基因和载体经胶回收连接后插入表达载体并经测序鉴定,在转入宿主菌后用IPTG诱导目的蛋白表达,用分离纯化后的目的蛋白分别免疫鼠和兔以制备多克隆抗体并用ELISA和流式细胞术对抗体进行鉴定,采用兔抗TEM1为捕获抗体、鼠抗TEM 1为检测抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法,棋盘滴定法探索各抗体最佳工作浓度,倍比稀释TEM 1,检测建立方法的灵敏度。成功构建的重组表达质粒pMAL-p5x-hCD248,经纯化复性后获得目的蛋白,免疫后获得兔多抗抗体效价为1∶1 024 000、鼠多抗抗体1∶512 000,棋盘法确定捕获抗体、检测抗体及酶标抗体最佳浓度分别为1∶500、1∶16 000和1∶20 000,经检测证实该方法测定下限为18.31ng/mL;检测50例恶性肿瘤患者与50例健康人血清TEM 1含量,发现差异无统计学意义。     

食物不耐受特异性IgG抗体检测的临床应用

近年来,有关食物不耐受的研究受到越来越多的关注。多数研究认为;食物不耐受是人的免疫系统把进入人体内的某种或多种食物当成有害的抗原物质,针对这些抗原产生过度的保护性免疫反应,从而产生特异性的IgG抗体并引起全身各系统出现异常的慢性病症状。本文旨在通过检测患者和正常体检者体内食物不耐受特异性IgG抗体,以评价其临床应用价值。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2(hBF)-2)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗对前列腺癌的免疫治疗。研究以pcDNA3．1为载体,构建重组质粒pcDNA3．1／PSMA和pcDNA3．1／hBD-2-PSMA．通过RT-PCR和免疫组化检测其表达。并免疫小鼠,进行血清中抗体检测．CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞数目测定及CTL特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS-7细胞后能表达目的基因,