大鼠细小病毒双重PCR检测方法的建立

目的 建立快速检测大鼠细小病毒的PCR方法.方法 根据大鼠细小病毒基因序列的特点,建立鉴别检测大鼠细小病-(RPV)与其他三种大鼠细小病毒(H-1、KRV、RMV)的双重PCR方法.根据RPV核酸序列的性质,在VP2基因筛选了一对用于特异扩增RPV株的引物,在NS1基因设计了一对用于特异性扩增H-1,KRV和RMV的引物.结果 两对引物组成的二重PCR方法可以特异性的扩增RPV而不扩增核酸同源性高的小鼠细小病毒和多种其他病原微生物;敏感性实验表明,二重PCR的最低检测限可达1 000拷贝/μL.双重PCR结合测序在检测23份临床样本中,检测出7份RMV阳性,包括1份与RPV共感染阳性样本.结论 本研究建立的检测RPV的双重PCR方法具有特异性好、灵敏度高及操作简单等优点,是一种简便、可靠的检测方法.     

I型鸭肝炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

目的 建立快速诊断I型鸭肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。方法 根据NCBI下载的20个来自我国不同省份的的I型鸭肝炎病毒的基因序列,找出其保守序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,进行条件优化,检测其特异性,敏感性,稳定性。结果 该方法敏感性达20拷贝,比常规PCR敏感性高。其特异性强,对番鸭细小病毒(MDPV),鹅细小病毒(GPV),新城疫病毒(NDV)和禽流感(AIV),鸭减蛋综合征病毒(EDSV),禽网状内皮组织增生症病毒(REV),鸭坦布苏病毒(DTMUV),禽呼肠弧病毒(ARV)8种病毒的检测均为阴性,I型鸭肝炎病毒检测结果为阳性。用建立的方法检测了江苏徐州采集100份样品,阳性率为92%。说明I型鸭肝炎病毒在江苏徐州地区的鸭群中普遍存在。结论 建立了I型鸭肝炎病毒荧光定量PCR方法。     

H-1细小病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

目的建立H-1细小病毒抗体的ELISA检测方法,并进行初步应用。方法采用大鼠神经胶质瘤细胞C6培养大鼠H-1细小病毒,制备包被抗原,采用纯化后抗原建立该病毒的ELISA检测方法;将建立的方法与国外同类试剂盒进行比对,考察该方法的特异性和灵敏度。同时,应用该方法对35份大鼠血清进行检测。结果所建立的方法可检测出稀释1280倍的阳性血清;与犬细小病毒、小鼠微小病毒和猪细小病毒阳性血清均无交叉反应;与大鼠细小KRV病毒有交叉反应;对35份大鼠血清进行检测,结果均为阴性,与国外同类试剂盒结果一致。结论所建立的H-1细小病毒ELISA检测方法具有良好的种属特异性和灵敏度,可用于大鼠血清中H-1细小病毒抗体检测。     

实验动物疾病Ⅲ.啮齿类动物的主要中枢神经系统疾病

一、大鼠潜在病毒(KRV)与托兰氏H-1病毒病 1.病史:Kilham等于1959年从野生大鼠肝脏囊尾蚴吸虫的包囊分离出一株病毒——Kilham ratvirus,这种病毒可能与绦虫幼虫协同而在大鼠体内引起肿瘤。托兰于1960年用大鼠进行人类肿瘤细胞的传代过程中分离了托兰氏H-1病毒。 2.病原:大鼠潜在病毒属于细小病毒科的细小病毒属。H-1病毒和细小病毒有亲缘关系,皆为单股DNA病毒。其大小为18～30 nm,能凝集豚鼠的红细胞。这两株病毒对温度有显著的抵抗力,能耐受80℃达2小时,在40℃可耐受60天以上。也可耐受pH2～11,以及氯仿、乙醚和酒精。 3.生态学:KRV和H-1病毒通常可对实验和野     

HIV感染者血浆、尿液巨细胞病毒检测的临床分析

目的 分析HIV感染者血浆、尿液中巨细胞病毒检出率的差异性及其临床意义。 方法 对2012年7月~2013年7月间在杭州市西溪医院住院的202例HIV感染者的血浆和尿液标本进行巨细胞病毒核酸检测,分析两种类型的标本检出巨细胞病毒的差异性,同时观察CD4⁺T淋巴细胞计数与巨细胞感染的关系并分析其临床意义。 结果 202份血浆检出巨细胞病毒60例,检出率为29.70%(60/202)。202份尿液检出巨细胞病毒95例,检出率为40.03%(95/202),两种类型标本巨细胞病毒检出率差异有统计学意义(P<0.05)。60例血浆中检出巨细胞病毒标本其CD4⁺T淋巴细胞计数均<250个/微升,其中CD4⁺T淋巴细胞计数在0~100个/微升者35例占58.33%(35/60),在101~250个/微升者25例占41.67%(25/60)。 结论 HIV感染者血浆、尿液巨细胞病毒检测存在差异,血浆巨细胞病毒检测更具有临床意义。外周血CD4⁺T淋巴细胞计数越低更易发生巨细胞病毒感染。     

乳清粉对断奶实验兔肠道微生物区系和益生菌的影响

目的 利用分子生物学技术研究饲粮中添加乳清粉对断奶早期实验兔肠道微生物区系和益生菌的影响。方法 采用单因子实验设计, 选择40日龄断奶实验兔, 随机分为4组(每组12只), 分别饲以乳清粉添加水平为0%、2%、5%和10%的饲粮。饲喂30 d 后, 每组随机取8只兔, 麻醉处死, 取盲肠内容物提取细菌总DNA, 首先利用PCR-DGGE技术分析兔盲肠微生物区系多样性, 进而应用实时荧光定量PCR(SYBR Green I)法定量检测盲肠细菌中双歧杆菌和乳酸杆菌含量。结果 (1)实验兔盲肠细菌DGGE各分析参数随乳清粉添加量的提高逐渐上升, 添加不同水平乳清粉均可显著增加DGGE条带数(P<0.05, P<0.01)。2%和5%乳清粉添加水平组的DGGE条带数和香农指数均极显著(P<0.01)高于未添加组, 但以上2项指标在乳清粉各添加水平间差异无显著性(P>0.05)。DGGE均匀度指数在各实验组间均无差异显著性(P>0.05)。(2)饲粮中添加乳清粉可提高实验兔盲肠内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌数量, 其中各乳清粉处理组(2%, 5%和10%)的乳酸杆菌数量均显著高于0%添加组(P<0.05), 10%乳清粉添加组的双歧杆菌数量显著高于未添加组(P<0.05), 但与其他2个乳清粉添加组无差异显著性(P>0.05)。结论 (1)饲粮中添加乳清粉可显著提高实验兔盲肠细菌菌群的多样性。(2)在实验兔饲粮中添加乳清粉可有效增加肠道益生菌数量。     

益气活血中药对心力衰竭大鼠MMP-1、TIMP-1影响的实验研究

[目的]观察益气活血复方对慢性心力衰竭大鼠心肌组织基质金属蛋白酶1(MMP-1)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响。[方法]选用雄性SD大鼠,采用冠状动脉结扎术配合饥饿、游泳等方法造成慢性心力衰竭的动物模型。将造模成功的大鼠随机分为3组:模型组、中药组和西药对照组;中药干预6周后,将动物处死,取其心肌组织,利用实时定量荧光聚合酶链反应(PCR)技术和蛋白印迹分析法(Western blot)分别检测心肌组织中MMP-1、TIMP-1基因表达和蛋白表达。[结果]与对照组比较,大鼠模型组MMP-1的表达高于正常组(P<0.01),而TIMP-1的表达明显低于正常组(P<0.01);中药组和西药组MMP-1的表达均低于模型组(P<0.01),TIMP-1的表达明显高于模型组(P<0.01)。[结论]益气活血中药可以下调MMP-1的表达,增加TIMP-1的表达,从而阻止MMP-1对心肌细胞外基质结构的破坏作用,延缓心肌重塑,改善心脏功能,从而阻止CHF的发展。     

巨细胞病毒宫内感染对子代豚鼠学习记忆的影响研究

目的 观察巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)宫内感染对子代豚鼠学习记忆的影响。方法 PCR法筛选CMV DNA阴性豚鼠,雌雄合笼受孕;孕龄1~20天时,感染组腹腔内接种CMV病毒悬液,对照组接种生理盐水,足月分娩的子代豚鼠分别喂养至3月龄和6月龄,应用Morris水迷宫实验检测学习记忆能力,观察大脑海马组织神经元细胞的形态。结果 感染组与对照组相比,子代豚鼠的学习记忆能力明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);感染组的海马组织神经元细胞结构层次紊乱,出现变性、灶性坏死及凋亡等病理改变。结论 CMV宫内感染可以导致子代学习记忆能力的下降。     

季节性流感病毒H1N1 BALB/c鼠肺适应株的建立及其分子机制

目的 建立季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株，并对适应的分子机理进行研究。方法 以病毒滴鼻感染小鼠，通过在BALB/c小鼠肺组织中连续传代，观察小鼠存活情况及肺病理改变，来获得季节性流感病毒H1N1的鼠肺适应株。结果 季节性流感H1N1 A/Brisbane/59/2007病毒野生型毒株，经过在小鼠体内进行8次传代后，毒力逐渐增强，从无致病力到致死率达到100%，对鼠肺适应株与野生型毒株进行基因比对，发现适应株HA基因发生了3个有义突变。结论 野生季节性低致病力H1N1流感病毒可经在小鼠中经过多次传代而获得高致病力H1N1鼠肺适应株，HA蛋白89位Thr至Ile的突变对毒力的增强起决定性作用。     

痹祺胶囊对大鼠膝骨关节炎软骨组织影响的病理形态观察

[目的]观察痹祺胶囊对大鼠膝骨关节炎软骨组织的影响。[方法]选Wistar大鼠,木瓜蛋白酶膝关节注射造模,痹祺胶囊灌胃治疗6周,观察大鼠膝关节软骨组织的病理学变化。[结果]用痹祺胶囊治疗的模鼠膝关节软骨组织在水肿、变性、簇聚和坏死方面均轻于模型组,3个给药组(1.296、0.648、0.324g/kg)的病理学总评分分别为41.5、13.5、19.0分,均低于模型组(57.5分)。其中软骨细胞的坏死例数占总例数的百分比分别为64%、30%、30%(模型组70%),病理学评分为12.5、6.5、3.5分(模型组29.0分),经秩和检验(K-S),0.648、0.324g/kg治疗组与模型组差异有非常显著意义(P<0.01)。[结论]结果表明痹祺胶囊对大鼠关节软骨组织的坏死具有一定的保护作用。     

犬细小病毒核酸诊断方法的建立和应用

目的建立犬细小病毒的核酸诊断方法（PCR方法）并应用于临床诊断。方法根据犬细小病毒VP2基因序列设计引物，以犬细小病毒标准株、犬传染性肝炎病毒和正常增殖细胞DNA为模板，犬细小病毒扩增出221bp的特异带，将PCR产物连接到pMD18-T Vecter，转化大肠杆菌JM109菌株。重组质粒经测序并经blast比较，与GenBank中已登录的犬细小病毒VP2基因序列进行比较。同时将建立的PCR方法应用于30份犬粪便和病犬组织的检测，并测序。结果PCR产物测得的序列与GenBank的基因序列同源性为100％，粪便检测均无犬细小病毒的特异带，从病犬组织中有6份样品扩增出221bp的特异带，经测序比较，同源率为100％。结论建立了犬细小病毒的PCR检测方法，并能应用于临床诊断。     

双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立

目的建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法。方法根据GenBank公布的EHECstx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记。建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析。结果建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法。菌液浓度为102～108cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100%;3次重复测定108、105、102cfu/ml3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5%,在误差允许范围内。结论建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC。     

Aurora-A在食管鳞癌及癌前病变中的表达特点和研究意义

目的 探讨极光激酶(aurora kinases A,Aurora-A)在食管鳞癌及癌前病变(主要为癌旁癌前病变)组织样本中的表达特征及其在食管鳞癌发生、发展过程中的作用。 方法 应用组织芯片技术和免疫组织化学方法(S-P法)检测Aurora-A在9例重度不典型增生组织和122例食管鳞癌组织以及它们的癌旁癌前病变组织中的表达情况;并使用实时荧光定量PCR法检测Aurora-A基因在8对癌前病变组织和5对早期食管癌组织中的表达水平;同时运用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR法检测Aurora-A基因在各细胞株(人食管上皮永生化细胞株及食管鳞癌细胞株)中的差异性表达情况。 结果 免疫组化结果显示Aurora-A在正常食管黏膜上皮、轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生及食管鳞癌组织中的阳性率分别为17.2%、27.6%、50.0%、71.2%和84.3%,其表达率随病变程度加重而递增。Aurora-A基因mRNA水平在8例癌前病变组织和5例早期食管癌组织中的表达程度也明显高于其相应正常组织,其中病变组织存在Aurora-A显著性高表达的比率分别为75.0%(6/8)和60.0%(3/5)。与人食管上皮永生化细胞株相比,Aurora-A在ESCC细胞株中的表达水平也明显升高。 结论 Aurora-A激酶表达水平与食管癌癌前病变严重程度呈正相关(r=0.548,P=0.000),提示Aurora-A可能参与食管鳞癌的发生与发展,有望为食管鳞癌的早期诊断及治疗提供新的方向。     

Response of mink, skunk, red fox and raccoon to inoculation with mink virus enteritis, feline panleukopenia and canine parvovirus and prevalence of antibody to parvovirus in wild carnivores in Ontario

Mink virus enteritis, feline panleukopenia and canine parvovirus-2 were inoculated separately into groups of raccoon, mink, red fox and striped skunk. Raccoons were highly susceptible to mink virus enteritis and feline panleukopenia, with animals developing clinical illness, and several dying within six to ten days of inoculation with lesions typical of parvovirus infection. Both viruses were shed in high titre in the feces of infected raccoons, and high antibody titres were stimulated. Raccoons inoculated with canine parvovirus-2 showed no signs; shedding of virus was sporadic though moderate titres of antibody developed. Mink inoculated with mink virus enteritis and feline panleukopenia developed signs and lesions of early parvovirus infection. No signs or significant lesions followed canine parvovirus-2 inoculation. Shedding of virus was heavy (mink virus enteritis) or sporadic (feline panleukopenia and canine parvovirus-2), though good serological responses were elicited to all three viruses. Red fox showed no signs of infection, shed all three viruses only sporadically, and the serological response was strong only to feline panleukopenia. Skunks developed low antibody titres, but no signs, and did not shed virus. Antibody to parvovirus was found in 79.2% of 144 wild red foxes; 22.3% of 112 wild raccoons; 1.3% of 157 wild skunks and 6/7 coyotes in southern Ontario. The likely significance of these viruses to wild and captive individuals and populations of these carnivores is discussed.     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

肿瘤及对照人群血清细小病毒H1抗体检测

细小病毒能抑制自发和诱发的肿瘤形成，具有明显的抗肿瘤作用。人群血清流行病学研究表明细小病毒ＡＡＶ感染和宫颈癌的低发生率有关。本文用血凝抑制试验检测肿瘤患者乾和健康对照人群血清细小病毒Ｈ１抗体。结果表明，４１４例肿瘤患者血清中３例抗细小病毒Ｈ１抗体阳性（０．７５％），对照血清４２０例中有２１例阳性（５．０％）。肿瘤患者血清细小病毒Ｈ１抗体阳性率明显低于对照人群（Ｐ〈０．００１）。提示细小病毒Ｈ１感染     

The Viral Load of Epstein-Barr Virus in Blood of Children after Hematopoietic Stem Cell Transplantation

ObjectiveTo detect the Epstein-Barr virus (EBV) viral load of children after hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) using chip digital PCR (cdPCR).MethodsThe sensitivity of cdPCR was determined using EBV plasmids and the EBV B95-8 strain. The specificity of EBV cdPCR was evaluated using the EBV B95-8 strain and other herpesviruses (herpes simplex virus 1, herpes simplex virus 2, varicella zoster virus, human cytomegalovirus, human herpesvirus 6, and human herpesvirus 7). From May 2019 to September 2020, 64 serum samples of children following HSCT were collected. EBV infection and the viral load of serum samples were detected by cdPCR. The epidemiological characteristics of EBV infections were analyzed in HSCT patients.ResultsThe limit of detection of EBV cdPCR was 110 copies/mL, and the limit of detection of EBV quantitative PCR was 327 copies/mL for the pUC57-BALF5 plasmid. The result of EBV cdPCR was up to 121 copies/mL in the EBV B95-8 strain, and both were more sensitive than that of quantitative PCR. Using cdPCR, the incidence of EBV infection was 18.75% in 64 children after HSCT. The minimum EBV viral load was 140 copies/mL, and the maximum viral load was 3,209 copies/mL using cdPCR. The average hospital stay of children with EBV infection (184 ± 91 days) was longer than that of children without EBV infection (125 ± 79 days), P = 0.026.ConclusionEBV cdPCR had good sensitivity and specificity. The incidence of EBV infection was 18.75% in 64 children after HSCT from May 2019 to September 2020. EBV cdPCR could therefore be a novel method to detect EBV viral load in children after HSCT.     

儿童特发性血小板减少性紫癜病因学的初步研究

应用 Ｐ Ｃ Ｒ 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 技术对３２ 例急性特发性血小板减少性紫癜（ Ｉ Ｔ Ｐ） 患儿的外周血进行了人细小病毒 Ｂ１９（ Ｈ Ｐ Ｖ Ｂ１９） 、 Ｅ Ｂ 病毒（ Ｅ Ｂ Ｖ） 、巨细胞病毒（ Ｃ Ｍ Ｖ） 及乙型肝炎病毒（ Ｈ Ｂ Ｖ） 系列检测。结果：病例组 Ｈ Ｐ Ｖ Ｂ１９ Ｄ Ｎ Ａ 阳性８ 例（２５ ．０ ％ ） ,与正常对照组比较有显著性差异（ Ｐ＜ ０ ．０５） 。 Ｅ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 阳性２ 例, Ｃ Ｍ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 阳性３ 例, Ｈ Ｂｓ Ａｇ 和 Ｈ Ｂｅ Ａｇ 同时阳性２ 例,４种病毒的总阳性率为４６ ．９ ％ （１５／３２ 例） 。提示：近半数儿童 Ｉ Ｔ Ｐ 病例的发生可能与上述病毒感染有关,而 Ｈ Ｐ Ｖ Ｂ１９ 较其他病毒与 Ｉ Ｔ Ｐ 的关系更为密切。