富含血小板血浆凝胶结构用于组织工程载体可能性的扫描电镜观察

目的：富含血小板血浆中含有较高浓度的生长因子，对骨的再生和修复都有一定的促进作用。通过大体和扫描电镜两种方法观察富含血小板血浆凝胶的结构，探索其用于组织工程载体的可能性。方法：实验于2004-01／03在第四军医大学口腔医学院动物中心完成。①制备牛凝血酶溶液：作为使富含血小板血浆结固成凝胶的催化剂。②制备富含血小板血浆液：将清洁级新西兰兔4只，解剖颈内静脉，抽取静脉血10mL，离心后将红细胞与血浆分离，再将血浆离心，使富含血小板血浆与乏血小板血浆分开，得到富含血小板血浆。③制备富含血小板血浆凝胶：将富含血小板血浆与牛凝血酶溶液按体积比6：1充分混合为凝胶。④冻干及观察：将富含血小板血浆凝胶冻干，进行大体观察和扫描电子显微镜检查。结果：①富含血小板血浆凝胶大体观察结果：可见大量的纤维彼此细密交织。②富含血小板血浆凝胶扫描电子显微镜观察结果：材料内大量的纤维交织，形成支架，其间含有大量的孔隙，孔隙彼此相通，孔径为200-1000μm，孔隙率80％。结论：富含血小板血浆凝胶呈典型的多孔性结构，孔径大小、孔隙率均比较符合骨组织工程支架材料的要求，而且又含有丰富的、对成骨有利的生长因子，提示富含血小板血浆可用作骨组织工程支架材料。     

富含血小板血浆凝胶的超微结构

目的观察富含血小板血浆(PRP)凝胶的超微结构。方法采用二次离心法制备PRP,分别计数全血和PRP血小板,用酶联免疫吸附法测定全血和PRP凝胶中转移生长因子(TGF)-β1及血小板源性生长因子(PDGF)-AB的浓度;同时,对PRP凝胶行大体观察、HE染色、透射及扫描电镜观察。结果 PRP中的血小板浓度达到全血的4.58倍;PRP凝胶中含有高浓度的TGF-β1、PDGF-AB;扫描电镜及透射电镜观察均显示PRP凝胶主要由大量纤维蛋白网和血小板构成。结论 PRP可能是构建可注射组织工程髓核的理想支架材料。     

脂肪间充质干细胞复合血小板凝胶修复兔椎间盘退变

背景:富含血小板的血浆凝胶作为三维支架使其中干细胞可以呈立体生长,同时富含血小板的血浆凝胶又释放大量生长因子,促进脂肪间充质干细胞增殖及分化.目的:探讨脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体注入兔椎间盘退变模型后的修复作用.方法:取兔动脉血采用二次离心法制备自体富血小板血浆,取兔肩胛间区脂肪分离培养脂肪间充质干细胞,制备脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体.新西兰大白兔随机分为对照组、模型组、富含血小板的血浆凝胶组和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组,后3组以穿刺法制备椎间盘退变模型,退变模型制备完成2周后,富含血小板的血浆凝胶组和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体组分别对退变间盘中注射相应材料.结果与结论:兔椎间盘退变后,间隙明显降低,髓核信号明显降低,髓核内基质高,密度染色较深;而经富含血小板的血浆凝胶和脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体治疗后,上述症状明显改善,且脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体的治疗效果更好.提示对退变椎间盘内注射富含血小板的血浆凝胶支架及脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体均有利于减少退变对椎间盘的影响,其中脂肪间充质干细胞-富含血小板的血浆凝胶复合体注射效果更为突出.     

超临界流体技术合成复合型骨替代生物材料的理化性质特点

目的:在复合材料理论基础上,将天然的皮质骨粉与聚乳酸混合,通过超临界流体合成技术,制备复合型骨组织替代支架材料,并评价其理化性质。方法:实验于2005-12/2006-04在暨南大学化学系实验室和南方医科大学生物力学实验时完成。①材料制备:将同种异体皮质骨粉与山东医疗器械研究所提供的聚乳酸按质量比0∶100,10∶90,20∶80,30∶70,40∶60分别混合后,在超临界CO2作用下复合成多孔骨生物替代材料。②材料的理化特征评价:对不同质量比的材料进行大体观察、生物力学检测,扫描电镜观察内部孔隙结构及检测孔径,乙醇排除法测量材料孔隙率,体外模拟降解检测pH值和质量的变化。结果:①表面形态观察:形状与铸模相同,表面可见均匀的孔隙结构,孔径适中,有较好的硬度。②生物力学实验结果:当骨粉含量为30%时,其抗压强度和压缩模量最高,分别为14.5 MPa,72.2 MPa,骨粉含量进一步提高时,复合材料的力学强度开始下降。③孔隙率:添加40%骨粉颗粒后,材料的孔隙率可由79%升至85.3%。④扫描电镜结果:不同材料的截面孔隙结构相似,孔径为50～200μm,孔隙连通性好。⑤体外降解pH值:复合材料最初2周pH值有所下降,但是2周后,可以稳定在pH值6.6左右,而含有40%骨粉的材料可以稳定在6.8左右。结论:应用超临界CO2技术合成的复合材料形状、大小、材料的孔隙可控,其孔隙率、生物力学强度、降解时间等理化性质方面良好,适合做为细胞工程支架和骨组织替代材料。     

不同抗凝剂和激活剂联合应用对富血小板血浆凝胶释放生长因子影响的比较

背景:富血小板血浆凝胶生物效应的发挥受多种因素的影响,如富血小板血浆制备的方法、血小板的完整性、抗凝剂及激活剂的选择等.目的:比较不同抗凝剂与激活剂联合应用对富血小板血浆凝胶释放生长因子影响的差异.方法:抽取新西兰兔全血制备富血小板血浆,再用牛凝血酶和Ⅰ型胶原激活,实验共分4组:依地酸钠钙-凝血酶组,依地酸钠钙-Ⅰ型胶原组,肝素-凝血酶组,肝素-Ⅰ型胶原组.分别计数各组富血小板血浆血小板数目.在激活富小板血浆后2 h,1 d,3 d,5 d使用酶联免疫吸附法测定空白对照组(全血)和各组富血小板血浆凝胶中转化生长因子β1及血小板源性生长因子AB的浓度,比较各组间2种生长因子释放方式和浓度的差异.结果与结论:依地酸钠钙-Ⅰ型胶原组合制备的富血小板血浆凝胶中转化生长因子β1和血小板源性生长因子AB累积释放量最大(P < 0.05);使用Ⅰ型胶原作为激活剂的富血小板血浆凝胶中上述2种生长因子的释放方式均为持续缓慢,并且转化生长因子β1的释放与激活时间呈正相关关系(r=0.873);而凝血酶激活的富血小板血浆凝胶释放生长因子的速度则较为快速(P > 0.05).结果证实,依地酸钠钙与Ⅰ型胶原制备的富血小板血浆凝胶所释放生长因子的浓度较大.     

热致相分离法制备聚（乳酸-乙醇酸）/羟基磷灰石复合骨组织工程支架材料的生物相容性

目的：观察热致相分离方法制备的聚（乳酸-乙醇酸）/羟基磷灰石复合骨组织工程支架的生物相容性,为其临床应用提供生物学依据. 方法：①采用热致相分离法制备聚（乳酸-乙醇酸）/羟基磷灰石复合组织工程支架,用扫描电镜观察支架的微观形貌,应用比重瓶法测定支架的孔隙率.②将兔骨髓基质细胞与多孔支架进行体外联合培养,观察和测定细胞在支架上的黏附率和生长情况.③将支架植入兔背部皮下组织,观察活体情况,并于第4周麻醉后处死动物,剖开植入材料部分肌肉,分别用肉眼和苏木精-伊红染色切片观察肌肉组织周围有无明显的炎症反应、有无组织生长. 结果：①支架的微观结构和孔隙率：支架的表面和内部都有着较均匀的孔径分布,孔径在100～150 μm,孔隙呈近圆形,孔壁上还存在着很多小孔,孔隙之间有着较好的连通性,羟基磷灰石掺量在5%时候复合支架的孔隙率能达到80%以上.②细胞黏附情况：细胞能在复合支架上黏附、增殖,4 h后材料的平均黏附率达到41.9%,体外培养7 d后,细胞在支架孔隙内黏附铺展.③体内植入实验结果：材料植入体内4周后取出,肌肉组织无明显的炎症反应,表现出很好的组织相容性. 结论：运用热致相分离的方法制备的聚（乳酸-乙醇酸）/羟基磷灰石复合骨组织工程支架孔径大小适当、孔隙率高,材料无明显毒性,具有较好的细胞亲和性和良好的生物相容性,具备了临床应用的前提.     

不同比例壳聚糖胶原复合骨、软骨缺损支架材料的制备及性状比较

背景:骨组织工程支架材料由最初的自体骨,软骨材料到生物活性陶瓷,乃至后来的有机材料胶原蛋白等细胞外基质材料,其生物相容性及性能越来越优越,越来越接近体内的真实情况.但是这些材料在抗压性及强度方面还有待进一步提高.目的:应用胶原与壳聚糖制备生物支架并对其检测其生物学性质,为骨、软骨缺损提供移植替代物.方法:将不同比例壳聚糖-胶原蛋白溶解,经冷冻冻干后紫外线交联后冷冻干燥,二次冻干制备好支架.检测不同比例支架的孔隙率,降解率,溶胀率.扫描电镜观察孔径的大小及形态.结果与结论:制备的支架外观呈海绵多孔状.支架的孔径大小随着胶原比例增加而减小.胶原比例的增加对支架孔隙率的影响较轻微.支架的溶胀率可达到80%左右,支架的溶胀程度随胶原比例增加而减少.胶原含量越大支架柔韧度增加明显.支架的降解率随着胶原比例增加而增加,而壳聚糖含量越高,降解速度越慢.结果提示,通过调整壳聚糖-胶原蛋白比例使支架具有作为骨、软骨缺损移植材料的替代物可能.     

应用溶剂浇铸-颗粒滤沥法制备气管软骨组织工程管状泡沫支架

背景:孔径和孔隙率是三维多孔状材料的两个主要评价指标,孔隙率越高越利于软骨细胞的长入及增殖,但是,随着孔隙率的进一步增高支架的抗压强度随之下降,并且一定孔径的有效孔也下降。因此合适的孔径及孔隙率的三维多孔支架材料的制备是气管组织工程成败的重要一环。目的:以溶剂浇铸-颗粒滤沥法制备管状泡沫支架,为气管软骨组织工程寻找实用、理想的支架。设计:观察性实验。单位:郧阳医学院附属太和医院耳鼻咽喉科,四川大学华西医院耳鼻咽喉科。材料:实验于2002-03/05在中科院成都分院化学所完成。外消旋聚乳酸原料,Mr=4.23×104,氯化钠颗粒(直径50～200μm)为致孔剂。方法:在半球形玻璃容器中,将外消旋聚乳酸溶于氯仿中,配制成100g/L的溶液,然后按800,850,900,920,940,960g/L不同质量分数加入氯化钠颗粒(50～200μm)作为致孔剂(1～6号支架),搅拌混匀,制成混悬液,呈糊状。将混悬液浇铸于管柱状模具中加热(90℃)、加压,然后置于通风柜中48h待溶剂挥发,残余溶剂抽真空除去。取出已定型干燥管柱状泡沫支架,放入盛有双蒸水的烧杯中浸泡48h,间隔8h换水1次,去除致孔剂氯化钠。然后将所有管柱状材料放入真空干燥箱中24～48h,即得多孔管柱状外消旋聚乳酸三维支架材料。经过大体及扫描电镜的观察支架形状及强度,同时进行孔隙参数的测定及分析。主要观察指标:①管状泡沫支架大体和扫描电镜观察结果。②孔隙参数的测定。结果:①支架外观为白色、管柱状泡沫,内径8mm,外径12mm。孔径80～250μm、孔隙率90.6%的支架具有一定的强度及韧性。②扫描电镜观察外消旋聚乳酸支架中有大小不等的孔分布,支架内孔与孔之间相互连通,并且大孔中又包含无数小孔。③随着氯化钠质量分数的增加支架的孔隙率也增加,但有效孔并不随着氯化钠质量分数的增加而增加。孔径为80～250μm,各样品有效孔不同,4号样品有效孔为76%,对应的孔隙率为90.6%。4号样品为较理想的支架。结论:通过溶剂浇铸-颗粒滤沥法制备的管状泡沫支架是气管软骨组织工程合适的支架。     

海螵蛸富血小板血浆液复合物修复兔软骨损伤的可行性

背景:富血小板血浆是自体血小板的浓集物,富含大量生长因子,可以促进组织中细胞和基质的再生,促进组织修复,但其容易流动,不能有效固定于损伤部位。目的:以海螵蛸生物支架固定富血小板血浆,观察海螵蛸富血小板血浆复合物修复兔软骨损伤的效果。方法:将21只大耳白兔随机均分为3组,在兔右膝关节负重髁软骨面制作类似Hulth骨软骨损伤模型,实验组于骨损伤处植入海螵蛸支架-自体富血小板血浆复合物,对照组于骨缺损处植入明胶海绵-富血小板血浆复合物,空白对照组不植入任何材料。术后12周取材,进行大体观察与组织学观察。结果与结论:术后12周,实验组软骨缺损区域明显缩小,组织学观察缺损区域出现类软骨细胞,排列整齐,成柱状分布,非常接近正常软骨组织;对照组软骨缺损区域有轻度缩小,组织学观察骨基质表面可见类软骨细胞基质组织,但排列较为紊乱;空白对照组软骨缺损区域有轻度缩小,组织学观察到只有骨细胞及骨基质,血管组织存在,未见到软骨及类软骨组织。实验组缺损直径及深度均低于其他两组(P<0.05)。结果表明海螵蛸支架-富血小板血浆复合物可促进软骨缺损愈合。     

胶原蛋白复合壳聚糖支架的制备及生物学性状:壳聚糖及胶原比例筛选

背景:壳聚糖和胶原类支架已成为组织工程常用的载体材料.但是,现阶段如何能够通过调节二者比例而达到理想的细胞载体仍是目前需要解决的问题之一.目的:调节胶原与壳聚糖二者配制比例制备支架材料,检测及对比不同比例支架材料生物学性质.方法:制备1:1,1:2,1:3,1:4,1:5比例的壳聚糖、Ⅰ型胶原蛋白成分,经紫外线交联后冷冻干燥,再将其用NAOH与蒸馏水进行中和,二次冻干制备好支架.观察不同比例支架的材料性质、孔隙率、降解率、溶胀率;扫描电镜观察孔径的大小及形态.结果与结论:在壳聚糖含量固定,支架的大体孔径经统计比较差异有显著性意义(P<0.05).1:3比例制备的孔径最大,达到(298.0+36.0)μm;支架总体的孔隙率为93.9%～97.5%,胶原比例的增加对支架孔隙率的影响较轻微.各组支架的溶胀率可达到80%左右,支架的溶胀程度随胶原比例增加而减少.在支架的降解率随着胶原比例增加而增加,而壳聚糖含量越高,降解速度越慢.结果证实,通过紫外光交联法,按照1:3配比的胶原和壳聚糖的支架材料更加适合软骨组织工程的要求.