半巢式PCR检测FOXC2基因多态性实验条件研究

目的:研究半巢式PCR方法检测FOXC2基因5’非翻译区C-512T多态性的实验条件。方法:对实验研究中的主要影响因素设置各系列浓度和梯度,进行PCR反应后观察电泳结果,选取最适条件。结果:最适温度为58℃,最适Mg2+浓度为3.0mmol/L,最适dNTP浓度为2.5mmol/L。最适扩增循环为第一次扩增35个循环,第二次扩增30个循环。结论:摸索最适实验条件是进行批量实验的前提和关键。     

PCR-RFLP方法检测PARL基因Leu262Val多态性的实验研究

目的探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测PARL基因Leu262Val多态性的最适实验条件.方法在PCR实验中,运用降落PCR（touchdown PCR,TD-PCR）方法优化PCR条件;对引物终浓度设定0.8μmol/L、0.6μmol/L、0.4μmol/L和0.32μmol/L四个浓度梯度进行扩增;通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.在RFLP实验中,在内切酶量10 U不变的情况下,PCR产物量分别设定为5μL、10μL、15μL;酶切时间分别设定为12 h、8 h、4 h、2 h、1 h酶切,反应完毕后通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.结果 （1）降落PCR方法能有效降低或避免非特异性扩增;（2）引物浓度为0.4μmol/L时,PCR产物量高且引物二聚体较少;（3）10μL的PCR产物进行酶切,电泳结果清晰;（4）在37℃条件下酶切4 h能完全消化一个酶切体系中的PCR产物.结论 PCR实验中,TD-PCR优化了PCR条件,为扩增目的条带提供了快速、特异、可靠的方法,最适引物浓度为0.4μm/L;RFLP实验中,最有效酶切方案为20μL的体系中加10μL产物和10 U内切酶,37℃消化4 h.     

PCR-RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C/G多态性的实验研究

目的为研究PCR—RFLP技术检测RANTES基因启动子区-28C／G多态性的最适实验条件．方法对主要影响因素设系列浓度梯度进行PCR后观察电泳结果，设置不同的体系对RFLP方法进行了研究．结果最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．6μmol／L；最经济有效的酶切体系为12μL体系中加4μL产物用3U的酶消化．结论最佳的实验条件的摸索是进行大批量实验研究的关键．     

PCR重叠延伸法结合分段克隆技术构建高GC含量基因突变载体

目的:构建人类KAP-1基因定点突变载体,为研究该基因的功能奠定基础。方法:综合运用PCR重叠延伸法和分段定向克隆技术。结果:DNA测序结果表明定点突变载体构建成功。结论:成功构建高GC含量(局部高达80.50%),全长为2 500bp的人类KAP-1基因定点突变载体pCMV6-En-try-KAP-1,为全面深入研究KAP-1基因的功能奠定了基础。     

PCR-RFLP检测Apo CⅢ基因T-455C多态性的反应条件优化

目的：探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）反应体系中各种成分的优化,建立检测载脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）T-455C多态性的方法。方法：采用PCR—RFLP检测ApoCⅢ基因T-455C多态性,同时通过对参与反应体系的成分,在一定范围内设置不同的浓度或参数组,进行正交试验和单因素逐项试验,观测各成分在不同条件下对结果的影响。结果：ApoCⅢ基因检测到3种基因型。PCR反应体系中不同模板含量、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg^2＋浓度、退火温度和酶切体系中PCR产物量、内切酶量、酶切时间等对反应结果均有不同程度的影响。结论：该研究建立的PCR—RFLP体系检测Apo CⅢ基因T-455C多态性技术,是一种高效快速、简单敏感、准确可靠的分析方法,适合常规实验室开展。     

采用PCR技术从高GC含量绿脓杆菌模板中扩增长片段外毒素A全基因

从高GC含量的模板中用PCR方法扩增长片段DNA序列是相当困难的。本室通过对PCR反应体系和条件的优化 ,成功地从绿脓杆菌高GC含量的染色体模板中扩增到了 1966bp的外毒素A(PseudomoneasaeruginosaexotoxinA ,PEA)全长结构基因 ,为实现PEA的高效表达奠定了基础。1　材料与方法1 1　绿脓杆菌PA10 3菌株染色体DNA和PCR引物的制备　　按常规方法提取绿脓杆菌PA10 3染色体DNA。参照Gray等公布的序列设计一对分别位于PEA结构基因两侧的引物。5′引物 :5′ GATCAGCCTCATCCTTCAC 3′(Tm =66) ;3′引物 :5′ GGTCGCGGCAGT…     

AS-PCR方法检测中国人群CYP2C19基因多态性

目的:建立一种快速、灵敏的细胞色素氧化酶P4502C19基因多态性检测方法。方法:分离外周血淋巴细胞基因组DNA,分别用一对等位基因特异性(allele-specific,AS)的反向引物与共用正向引物进行PCR扩增,通过电泳分析对应的PCR产物来判断CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒数第三位或第二位引入错配碱基改进特异性。采用优化后方法对278例健康人进行CYP2C19基因型分析。结果:AS-PCR可检测CYP2C19基因多态性,引入第二个错配碱基可提高检测特异性。经直接测序验证结果完全一致。结论:建立和优化的AS-PCR方法适用于CYP2C19基因多态性快速检测。     

芜湖市输入性登革热1例的实验诊断与分析

目的:对芜湖市1例输入性登革热病例进行实验室检查,为临床病例的确诊提供参考依据。方法:对患者的病史、诊疗经过等资料进行归纳、分析,用登革病毒通用引物和血清型特异引物进行巢氏PCR检测和分析患者是否感染登革病毒及其登革病毒血清分型,并对扩增产物进行克隆测序和比对分析。结果:基因扩增产物显示与Ⅰ型登革病毒位置一致,产物序列在NCBI上比对分析,再次证实为Ⅰ型登革热病毒。结论:该患者确诊为登革热Ⅰ型病毒感染。     

PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V(16)A多态性的实验条件研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件．方法：对影响MnSOD基因PCR反应以及用限制性内切酶BsawI切割主要因素进行了系统研究．结果：最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15止体系中加8pL产物用2U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

PCR-RFLP方法检测CCR5基因启动子区59029G/A多态性的实验研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测CCR5基因启动子区59029G／A多态性的最适实验条件．方法：对主要影响因素设系列浓度梯度分别进行PCR后观察电泳结果。结果：最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．4μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以1．0U为最适Taq酶量．结论：酶切体系为20μL体系中加5μL产物用4U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

重叠延伸聚合酶链反应克隆大鼠Foxo3a基因及序列测定

目的获得大鼠Foxo3a基因全长编码区基因。方法运用重叠延伸PCR方法从大鼠脾脏总RNA中扩增Foxo3a编码区基因全长,将其插入pMD19-T载体中进行酶切及测序鉴定。结果Foxo3a编码区基因全长2019bp,与GenBank中大鼠Foxo3a基因同源性为99.9%。结论运用重叠延伸PCR技术可成功克隆高GC含量大鼠Foxo3a的cDNA,为进一步研究该基因奠定了基础。     

Shank3基因多态性与汉族儿童孤独症的关联研究

目的 研究Shank3基因的单核苷酸多态性（SNPs）与汉族儿童孤独症的相关性。 方法 采用Illumina CNV 370-Duo芯片对280个汉族人群孤独症核心家系的Shank3基因单核苷酸多态性位点rs9616816、rs736334、rs2040487、rs6009951、rs715586、rs8137951进行基因分型检测,对基因分型数据采用haploview4.1软件进行连锁不平衡检测和家系为基础的关联分析（FBAT）。 结果 家系为基础的关联分析结果显示Shank3基因的rs715586、rs6009951位点的等位基因和rs715586-rs8137951的G-A,A-G单体型在孤独症中的传递差异具有统计学意义（P＜0.05）,但经1000次模拟的置换检验后不再具有统计学意义（P＞0.05）。 结论 Shank3基因可能不是汉族儿童孤独症的致病基因,至少不是其致病的主效基因。     

套式PCR在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值

目的采用套式PCR（二次扩增）替代传统PCR（一次扩增）扩增痰中结核分枝杆菌embB基因。探讨其在检测结核分枝杆菌embB基因突变中的应用价值。方法选取本院已确诊的活动性肺结核住院病人68例和非结核肺部感染病人16例，嘱其留取晨痰，分别进行套式PCR扩增和传统PCR扩增，再行产物分析。结果68例活动性肺结核病人传统PCR扩增embB基因阳性结果为29例，阳性率为42．6％。套式PCR扩增embB基因阳性结果为47例。阳性率为69．1％，两者比较差异有显著性（X^2=9．66，P〈0．05）；16例非结核病人传统PCR和套式PCR和检测结果均为阴性，两者特异度均为100％。结论检测结核分枝杆菌embB基因突变，套式PCR灵敏度高于传统PCR．两者特异度相同，套式PCR能快速、敏感、特异地扩增结核分枝杆菌embB基因片段。     

性别特异性高胆固醇血症与Syndecan-3(SDC3)基因C1330T多态性的关联研究

目的研究syndecan-3(SDC3)基因的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)C1330T在中国汉族农村人群中与高胆固醇血症,血脂水平的相关性。方法高胆固醇血症(HTC)定义为血清中总胆固醇水平≥200 mg/dL。本研究中男性336人(其中HTC161人,胆固醇正常者(NTC)175人),女性1491人(其中HTC935人,NTC556人)。研究对象中应用多聚酶链反应(PCR),限制性内切酶酶切进行基因分型,测定血清高密度脂蛋白(HDL-C),低密度脂蛋白(LDL-C),总胆固醇(TC),甘油三脂(TG),葡萄糖(GLU)。结果在男性研究对象中SDC3基因C1330T基因型及等位基因频率在HTC组和NTC组的分布有显著性差异(P<0.05),1330C与高胆固醇血症相关(OR=1.42,95%CI=1.040-1.926,P<0.03),在校正年龄,BMI和其他危险因素(吸烟饮酒等)后仍保持显著相关(OR=1.51,95%CI=1.06-2.14,P<0.03),而在女性研究对象中未发现明显相关(OR=1.06,95%CI=0.92-1.24,P=0.41),1330C与性别的交互作用呈临界统计学显著性(borderline statistically significant)(P=0.0742)。进一步应用显性模型分析C1330T与男性血脂水平(HDL-C,LDL-C)相关。结论SDC3基因C1330T多态性与男性高胆固醇血症及血脂水平有关。     

靶向克隆法构建pET15b-VP3原核表达载体

目的 探索利用PCR产物靶向克隆法构建能够表达凋亡素的pET15b-VP3原核表达载体.方法 以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板,PCR扩增VP3基因的366 bp片段,应用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性pET15b,得到重组表达载体pET15b-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体.结果 PCR产物经过电泳鉴定可见366 bp特征性的VP3片段,重组质粒经双酶切电泳获得了一个大小为366 bp的VP3片段,重组质粒测序证实VP3 cDNA编码区成功地插入了pET15b,且其序列与Gene     

3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态与血浆高浓度低密度脂蛋白的风险

目的:研究潮汕人群3-羟-3甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶基因多态性与血浆高浓度低密度脂蛋白(LDL)的风险.方法:收集潮汕籍汉族高浓度LDL 792例,并与1 073名健康人对照,用SNPstream技术检测样本HMG-CoA还原酶基因多态性.结果:2个单核苷酸多态性位点(rs3846662和rs12916)与高浓度LDL均有相关性(P＜0.05),2个单倍型G-T-C和A-C-C在两组中的分布差异有统计学意义(P＜0.05).结论:HMG-CoA还原酶2个单核苷酸多态性和2个单倍型均与血浆高浓度低密度脂蛋白LDL存在相关性.     

CST6在结肠癌中的表达及与肿瘤血管生成的关系

目的 研究半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin 6（CST6）在结肠癌中的表达及其与肿瘤血管生成的关系。方法 利用肿瘤基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）分析CST6在正常结肠上皮、无转移性结肠癌和转移性结肠癌组织中的表达差异,并探讨其表达高低与结肠癌预后的关系。同时,采用基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）及免疫组化方法探究结肠癌中CST6所影响的信号通路及可能的作用机制。结果 （1）CST6在结肠癌中的表达明显高于正常结肠上皮,转移性结肠癌中CST6表达水平明显高于无转移结肠癌;（2）具有高CST6表达水平的结肠癌患者疾病特异性生存期以及无进展生存期显著缩短;（3）GSEA分析提示在结肠癌中CST6高表达的患者中,上皮-间充质转化和血管生成通路显著富集;（4）结肠癌中CST6与血管生成相关因子PDGFR的表达呈现正相关。结论 CST6在结肠癌组织中呈高表达,高表达CST6的结肠癌患者预后更差,可能与其促进肿瘤血管生成作用有关,提示其可能在结肠癌中作为一个新型癌基因发挥作用。     

遗传性痉挛性截瘫基因SPG3A的基因组结构和多态性分析

目的:分析遗传性痉挛性截瘫(HSP)SPG3A基因组结构,探讨部分正常人群SPG3A的基因多态性。方法:应用DNA序列测定对110个年龄大于60岁的正常人进行SPG3A/Atlastin基因多态分析。结果:在外显子2和外显子3的编码序列中有两处基因多态;内含子3,内含子4和内含子6上分别发现了一处基因多态。结论:正常个体的等位基因中发现只有2个编码序列多态性且为高度保留序列,其余3个均位于内含子上。对序列变异、多态性相对频率及SPG3A基因组结构的分析将有助于遗传性痉挛性截瘫疾病和其它轴突变性神经疾病的遗传分析。     

套式PCR及测序法检测痰中结核分枝杆菌耐乙胺丁醇embB基因突变

目的应用套式PCR及测序法直接检测痰中结核分枝杆菌相关的embB基因突变，以期建立一种直接、快速、准确地检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇的实验方法。方法采用套式PCR扩增技术及测序法直接检测130例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌embB基因突变情况，同份痰标本同时做涂片抗酸染色、罗氏培养及菌型鉴定。结果29例耐乙胺丁醇标本有18例发生基因突变，均为306位密码子突变，基因突变率为62．1％（18／29）。结论套式PCR及测序法可望成为一种快速、特异、准确地检测痰中结核分枝杆菌embB基因突变的好方法。     

人芳香二烷基磷酸酯酶基因多态性同步分析研究

目的 :建立一种对PON1 192和PON1 5 5位密码子等位基因同步分型的方法。方法 :在Multiplex PCR RELP基础上 ,通过引物设计错配 ,在一体系中同时扩增分别含密码子PON1 192和PON1 5 5的DNA片段 ,当等位基因为PON1 192R/PON1 5 5L时 ,其PCR扩增产物均被引入唯一的限制性内切酶HinfⅠ的识别位点G ANTC。PCR产物经酶消化 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳后 ,根据不同组合片段 ,确认为不同的基因型 ,从而同时对两个位点进行基因分型。结果 :在检测的 80例健康个体中PON1 192 :Q 4 6 .9% ,R 5 3.1% ;PON1 5 5 :L 95 .6 % ,M 4 .4 % .结论 :此方法同时可分析基因两个位点的多态性 ,省时省力 ,方法简便 ,便于两个位点以及与疾病之间的连锁分析 ,很有推广价值 .