肾小球系膜细胞在高糖、胰岛素作用下F-actin的变化

目的 :探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞骨架蛋白F -actin的影响 ,进一步探讨F -actin在糖尿病肾病发生发展中的作用。方法 :将培养的鼠 10 97系膜细胞分为 8组 :正常对照组 ,生理浓度胰岛素组 (10 -9M) ,低浓度胰岛素组 (10 -8M) ,高浓度胰岛素组 (10 -6M) ,高糖组 (30mM) ,甘露醇组 ,高糖加高浓度胰岛素组 ,高糖加生理浓度胰岛素组。采用rhodamine-phalloidin染色 ,激光共聚焦显微镜观察F -actin形态并测定荧光强度。结果 :高糖组F -actin荧光强度为对照组的 4 4 5 % ;10 -8M胰岛素组、 10 -6M胰岛素组分别为对照组的 12 2 4 %(P <0 0 5 )和 12 9 6 % (P <0 0 1) ;高糖加 10 -6M胰岛素组为高糖组的 183 8% (P <0 0 5 )。结论 :(1)高糖可促进F -actin解聚 ,胰岛素有一定拮抗作用 ,且呈剂量依赖性。 (2 )F -actin是糖尿病肾病发生发展中的重要因子。     

P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义

目的:探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达的影响及其与系膜细胞肥大的关系。方法:将培养的大鼠1097系膜细胞株分为8组:正常对照组,高糖组,甘露醇组,不同浓度胰岛素组,高糖加不同浓度胰岛素组。用RT-PCR法检测各组系膜细胞P21mRNA表达。流式细胞仪定量检测各组系膜细胞前向角度散射光(FSC)大小。结果:正常对照组系膜细胞中P21mRNA有一定表达。高糖组P21mRNA表达明显增加为正常对照组的3.89倍(P<0.01);FSC为正常对照组的1.42倍(P<0.01)。不同浓度胰岛素组系膜细胞P21mRNA表达及FSC大小随胰岛素浓度增加而增加,但无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)P21mRNA在正常肾小球系膜细胞有一定表达。(2)高糖刺激可使系膜细胞P21mRNA表达上调,且与渗透压无明显关系。(3)P21mRNA表达上调可导致系膜细胞肥大,在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。     

脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞表达VEGF及PEDF的影响

目的观察脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)的影响,探讨脂联素对糖尿病肾病的保护作用机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,随机分为7组:常糖组、高糖A组、B组(培养液葡萄糖浓度分别为5.6 mmol/L、15 mmol/L、30 mmol/L,其中以高糖B组作为脂联素干预的对照组);脂联素A、B、C、D组(各组培养液葡萄糖浓度均为30 mmol/L+脂联素,脂联素浓度依次分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml),作用24 h,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR法)测定各组细胞VEGF mRNA、PEDFmRNA表达水平;ELISA法测定各组上清液中VEGF、PEDF蛋白的含量。结果与常糖组相比,高糖各组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及其蛋白表达升高(P﹤0.05),PEDF mRNA及PEDF蛋白表达降低(P﹤0.05);与高糖B组相比,脂联素各组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及其蛋白表达降低(P﹤0.05),PEDF mRNA及PEDF蛋白表达升高(P﹤0.01)。结论高糖可上调大鼠肾系膜细胞VEGF表达,抑制PEDF的表达;脂联素可抑制高糖环境下系膜细胞对VEGF的表达并提高其对PEDF的表达。     

高糖对大鼠肾系膜细胞Smad2/3及Smad7表达的影响

目的:观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞内Smad2/3和Smad7蛋白的表达,探讨糖尿病时肾脏Smad信号通路的改变。方法:将体外培养的大鼠肾系膜细胞分别设正常对照组(葡萄糖浓度5.6mmol/L)、20mmol/L高糖组、30mmol/L高糖组、甘露醇组。用细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞Smad2/3及Smad7蛋白的表达。结果:正常对照组系膜细胞Smad2/3蛋白表达较弱,Smad7蛋白表达较强。两高糖组Smad2/3表达较正常对照组强(P﹤0.05),呈浓度依赖性;Smad7表达较正常对照组弱(P﹤0.05),呈浓度依赖性。甘露醇组与正常对照组无明显差异(P﹥0.05)。结论:高糖可诱导肾系膜细胞Smad2/3蛋白表达增强,Smad7蛋白表达减弱。提示Smad信号通路参与了糖尿病肾病的发病机制。     

体外培养肾小球系膜细胞转化生长因子β1和血管紧张素Ⅱ表达与过氧化物酶体增殖物激活受体α激动剂的影响

目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome proliferators-actived receptor-alpha,PPARα)激动剂对体外培养的肾小球系膜细胞的作用。方法:实验于2005-12/2006-05在泸州医学院附属医院传染免疫实验室完成。实验分组:将培养的大鼠HBZY-1肾小球系膜细胞株分为6组,将高糖作为刺激因子,PPARα激动剂WY14643作为干预因素。分别设①正常组:5.6mmol/L葡萄糖。②高糖组:30mmol/L葡萄糖;③高糖 10,100,500μmol/LWY14643组:30mmol/L葡萄糖 10,100,500μmol/L WY14643。④高糖 WY14643溶剂组:30mmol/L葡萄糖 250μmol/L二甲亚砜 250μmol/L无水乙醇。实验评估:①采用反转录-聚合酶链反应半定量法测定各组肾小球系膜细胞PPARαmRNA和血管紧张素ⅡmRNA表达。②采用免疫细胞化学法检测各组转化生长因子β1蛋白表达。结果:①肾小球系膜细胞PPARαmRNA表达:高糖组肾小球系膜细胞PPARα表达低于正常组(分别为0.21±0.14,0.97±0.25),差异有显著性意义(t=7.742,P<0.05);10,100,500μmol/L WY14643组肾小球系膜细胞PPARα表达高于高糖组(分别为0.52±0.06,0.92±0.22,0.94±0.34,0.21±0.14),差异有显著性意义(t=4.438,7.182,7.213,P<0.05)。②转化生长因子β1表达和血管紧张素ⅡmRNA表达:高糖组肾小球系膜细胞转化生长因子β1、血管紧张素ⅡmRNA表达高于正常组(分别为25.76±0.24,16.43±0.38;0.79±0.23,0.46±0.13),差异有显著性意义(t=4.029,3.563,P<0.05);10,100,500μmol/LWY14643组肾小球系膜细胞转化生长因子β1、血管紧张素ⅡmRNA表达低于高糖组(分别为20.18±0.15,18.59±0.37,16.46±0.31,25.76±0.24;0.43±0.16,0.21±0.09,0.19±0.05,0.79±0.23),差异有显著性意义(P<0.05)。结论:转化生长因子β1、血管紧张素Ⅱ是糖尿病肾病发病的重要致病因子;PPARα激动剂减少转化生长因子β1、血管紧张素Ⅱ的表达可能与其增加PPARα的表达有关。     

活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达

背景:研究发现,癌胚纤维连接蛋白系新合成细胞外基质的重要标志,而高糖环境氧化应激与癌胚纤维连接蛋白的关系尚未见报道。目的:观察高糖作用对人系膜细胞活性氧和癌胚纤维连接蛋白mRNA表达的影响。方法:将培养的系膜细胞分为以下各组:正常对照组(5mmol/LD-葡萄糖);渗透压对照组(5mmol/LD-葡萄糖+20mmol/LL-葡萄糖);高糖组(25mmol/LD-葡萄糖);α-硫辛酸干预组,分为高糖+LA50组(25mmol/LD-葡萄糖+50μmol/Lα-硫辛酸)、高糖+LA100组(25mmol/LD-葡萄糖+100μmol/Lα-硫辛酸)、高糖+LA200组(25mmol/LD-葡萄糖+200μmol/Lα-硫辛酸)。以RT-PCR法检测癌胚纤维连接蛋白mRNA表达水平,荧光显微镜和荧光酶标仪测定细胞内活性氧水平。结果与结论:高糖促进系膜细胞活性氧的产生,亦增加癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,α-硫辛酸可显著降低高糖负荷下细胞内活性氧水平,同时减少癌胚纤维连接蛋白mRNA的表达,且呈浓度依赖性,提示活性氧介导高糖负荷致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达,α-硫辛酸可部分逆转这一效应。     

高糖对心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1的影响

背景:糖尿病心肌病的发病机制尚不清楚,神经调节蛋白1具有促进血管再生等作用,糖尿病心肌病的发病是否和心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1下降有关值得进一步研究.目的:观察高糖对心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1的影响.方法:取生长良好的第2代心肌微血管内皮细胞,高糖组加入10 mmol/L的葡萄糖,高糖+胰岛素组加入10 mmol/L的葡萄糖及10-5U/L的胰岛素,对照组正常培养.培养24 h后收集细胞,RT-PCR及Western blot方法检测神经调节蛋白1 mRNA和蛋白的表达.结果与结论:与对照组比较,高糖组心肌微血管内皮细胞神经调节蛋白1 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05);与高糖组比较,高糖+胰岛素组心肌微血管内皮细胞神经调节蛋白1 mRNA和蛋白的表达明显升高(P<0.05),与对照组间差异无显著性意义(P>0.05).说明高糖可抑制心肌微血管内皮细胞表达神经调节蛋白1 mRNA和蛋白,而胰岛素可拮抗此作用.     

雷公藤内酯醇对高糖时人肾小球系膜细胞MC P-1表达的影响

目的探讨高糖及雷公藤内酯醇（TP）对人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响。方法将培养的人肾小球系膜细胞分为6组：正常对照组（5 mmol/L 葡萄糖）、高糖组（30 mmol/L 葡萄糖）、甘露醇组（5 mmol/L 葡萄糖＋25 mmol/L甘露醇）、TP甲组（30 mmol/L 葡萄糖＋5μg/L TP）、TP 乙组（30 mmol/L 葡萄糖＋10μg/L TP）、TP丙组（30mmol/L 葡萄糖＋15μg/L TP）,分别在24 h、48 h、72 h采用 RT-PCR法检测TP对高糖条件下系膜细胞内 MCP-1 mRNA 及蛋白表达的影响。结果高糖组人肾小球系膜细胞 MCP-1 mRNA及蛋白较正常对照组增加,且差异有显著性（P＜ 0.01）;TP各组比高糖组有明显下降（P＜ 0.01）;不同浓度的TP对高糖诱导的系膜细胞 MCP-1的表达抑制程度不同（P ＜ 0.05）。结论 TP可抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞 MCP-1的表达,且呈时间、剂量依赖关系,其可能对延缓糖尿病肾病中肾小球硬化有一定作用。     

罗格列酮对高糖时人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

【目的】探讨高糖对人肾小球系膜细胞（HRMC）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响，以及过氧化物酶增殖体激动剂罗格列酮对其影响及作用机制。【方法】将HRMC分为三组处理：①正常对照组（糖浓度5．5mmol／L）；②高糖（30mmol／L）组；③高糖加罗格列酮（5μmol／L，10μmol／L）组。用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测MCP-1mRNA表达，用EIISA方法测定细胞上清MCP-1蛋白浓度。【结果】高糖刺激系膜细胞后MCP-1mRNA表达明显升高，蛋白浓度增加，加入罗格列酮后MCP-1表达明显下降。且随罗格列酮浓度增大，作用更明显。【结论】高糖刺激HRMC，其MCP-1表达增强，可能是糖尿病肾病（DN）发病机制中的一个重要途径。罗格列酮能抑制MCp-1mRNA表达及蛋白合成，说明其具有抑制炎症的作用，在预防DN的发生发展中可能有重要意义。     

尾加压素Ⅱ对肾小球系膜细胞FN、Col ⅣmRNA表达的影响

目的观察尾加压素Ⅱ(UⅡ)对体外高糖培养的肾小球系膜细胞(MC)FN、Col ⅣmRNA表达的影响。方法体外高糖培养MC,加入UⅡ(终浓度10-8mol/L),设立空白对照组及UⅡ抑制组,RT-PCR检测各组MC FN、Col ⅣmRNA表达水平。结果与对照组比较,UⅡ组MC FN、Col ⅣmRNA表达明显增加(P0.05),UⅡ抑制组MC FN、Col ⅣmRNA表达水平明显低于UⅡ组(P0.05)。结论 UⅡ能增加MC FN、Col ⅣmRNA表达。     

Coordinate regulation of glucose transporter function, number, and gene expression by insulin and sulfonylureas in L6 rat skeletal muscle cells.

The extrapancreatic actions of sulfonylureas on the glucose transport system were studied in the L6 line of cultured rat skeletal muscle cells. Insulin (10(-7) M) increased 2-deoxyglucose uptake in differentiated L6 myotubes by 30-40% after 8 h of incubation. The sulfonylurea tolazamide (0.6 mg/ml, 22 h) had no effect on glucose uptake in the absence of insulin, but increased insulin-stimulated 2-deoxyglucose uptake twofold. The total cellular content of glucose transporters was assessed with a monoclonal anti-transporter antibody by a solid-phase ELISA method. Insulin (8 h) increased the quantity of glucose transporters, with a maximal twofold increase at 10(-7) M and a dose-response curve similar to that for insulin stimulation of glucose uptake. In spite of its lack of effect on glucose uptake, tolazamide alone (0.6 mg/ml) increased the cellular content of transporters by 70%. The effects of insulin and tolazamide on transporter gene expression were studied with probes derived from Hep G2 glucose transporter cDNA. Insulin increased the transporter mRNA level 1.7-fold, tolazamide increased it 1.5-fold, and the combination of insulin and tolazamide increased transporter mRNA 3-fold. It is concluded that sulfonylureas, together with insulin, enhance glucose uptake in L6 skeletal muscle cells by increasing the number of functioning glucose transport molecules. The long-term regulation of the glucose transport system in skeletal muscle by insulin and sulfonylureas in vivo may involve similar changes in transporter function, number, and gene expression.     

Mechanism of impaired glucose-potentiated insulin secretion in diabetic 90% pancreatectomy rats. Study using glucagonlike peptide-1 (7-37).

Chronic hyperglycemia causes a near-total disappearance of glucose-induced insulin secretion. To determine if glucose potentiation of nonglucose secretagogues is impaired, insulin responses to 10(-9) M glucagonlike peptide-1 (GLP-1) (7-37) were measured at 2.8, 8.3, and 16.7 mM glucose with the in vitro perfused pancreas in rats 4-6 wk after 90% pancreatectomy (Px) and sham-operated controls. In the controls, insulin output to GLP-1 was > 100-fold greater at 16.7 mM glucose versus 2.8 mM glucose. In contrast, the increase was less than threefold in Px, reaching an insulin response at 16.7 mM glucose that was 10 +/- 2% of the controls, well below the predicted 35-40% fractional beta-cell mass in these rats. Px and control rats then underwent a 40-h fast followed by pancreas perfusion using a protocol of 20 min at 16.7 mM glucose followed by 15 min at 16.7 mM glucose/10(-9) M GLP-1. In control rats, fasting suppressed insulin release to high glucose (by 90%) and to GLP-1 (by 60%) without changing the pancreatic insulin content. In contrast, in Px the insulin response to GLP-1 tripled in association with a threefold increase of the insulin content, both now being twice normal when stratified for the fractional beta-cell mass. The mechanism of the increased pancreas insulin content was investigated by assessing islet glucose metabolism and proinsulin biosynthesis. In controls with fasting, both fell 30-50%. In Px, the degree of suppression with fasting was similar, but the attained levels both exceeded those of the controls because of higher baseline (nonfasted) values. In summary, chronic hyperglycemia is associated with a fasting-induced paradoxical increase in glucose-potentiated insulin secretion. In Px rats, the mechanism is an increase in the beta-cell insulin stores, which suggests a causative role for a lowered beta-cell insulin content in the impaired glucose-potentiation of insulin secretion.     

血小板活化因子诱导大鼠肺微血管内皮细胞Src抑制的蛋白激酶C底物基因表达

目的 研究血小板活化因子(PAF)对大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)mRNA表达的影响及其信号转导途径.方法 体外培养RPMVEC,采用细胞原位杂交技术检测不同刺激条件下RPMVEC中SSeCKS mRNA的表达变化.结果 正常RPMVEC中有少量SSeCKSmRNA表达,为棕黄色细颗粒状杂交信号,分布于胞质;用10~(-10)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L的PAF分别孵育RPMVEC 1.5 h,SSeCKS mRNA表达随其浓度增加而升高(分别为0.054 9±0.000 7、0.059 9±0.001 8、0.069 0±0.001 8、0.075 4±0.001 9),与正常对照组(0.036 8±0.003 7)比较差异均有统计学意义(均P<0.05);10~(-7) mol/L PAF刺激RPMVEC 0.5、1.5、3、6、12、24 h,SSeCKS mRNA表达水平于0.5 h即显著升高(0.071 0±0.001 5),1.5 h达峰值(0.075 6±0.001 7),之后逐渐下降,24 h时(0.043 9±0.001 0)仍高于正常对照组(0.038 2±0.004 1,均P<0.05);10 μmol/L核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二巯基氨甲酸(PDTC)预处理RPMVEC 1 h可显著下调Par对SSeCKS mRNA的诱导效应(0.049 7±0.003 2比0.071 9±0.001 9,P<0.05),而蛋白激酶C(PKC)抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺(BIM)预处理RPMVEC0.5 h则不影响此效应(0.069 7±0.002 1比0.071 9±0.001 9,P>0.05).结论 PAF呈浓度和时间依赖的方式上调RPMVEC中SSeCKS基因转录;NF-κB信号通路而非PKC参与了PAF的诱导效应.     

高脂环境对大鼠成肌细胞糖代谢的影响及Ghrelin的保护作用

[目的]探讨生长激素释放肽(Ghrelin)对高脂环境下大鼠成肌细胞糖代谢的影响,为深入研究2型糖尿病的发病机制和防治提供理论依据.[方法]在给予原代培养大鼠成肌细胞0.3 mM棕榈酸(PA组)处理12 h的同时用加入10-11 M、10-9 M、10-7 M Ghrelin(干预组),用同位素示踪法检测葡萄糖摄取,分别用RT-PCR和Western blotting法检测GLUT4 mRNA表达和蛋白水平.[结果]与对照组相比,在0.3 mM棕榈酸的PA组中,葡萄糖摄取明显下降,但是GLUT4 mRNA表达和蛋白水平未见明显改变.与0.3 mM的PA组对比,随着Ghrelin干预浓度的逐渐增加,葡萄糖摄取也逐渐增加,并呈剂量反应关系,其中10-7M Ghrelin组葡萄糖摄取增加最为明显,然而GLUT4 mRNA表达和蛋白水平在各Ghrelin剂量组中未见明显改变.[结论]Ghrelin可增加高脂环境下大鼠成肌细胞的糖摄取,并且存在剂量依赖关系,而未见对GLUT4产生影响.     

白血病中FHIT基因的异常表达和缺失

FHIT基因位于染色体 3p14 .2 ,实验室的研究证实FHIT基因具有抑癌基因活性。FHIT基因异常表达或表达缺失出现在多种实体肿瘤和造血系统恶性疾病。为了探讨白血病细胞中FHIT基因的异常表达及意义 ,采用巢式RT PCR法对急性髓性白血病 (AML)、急性淋巴细胞白血病 (ALL)、慢性粒细胞白血病 (CML)以及骨髓增生异常综合症 (MDS)、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、骨髓瘤 (MM )等不同类型白血病患者FHIT基因转录本进行检测 ,并对FHIT基因转录本进行序列测定。 98份血液系统恶性疾病患者的骨髓或外周血标本中AML 38例 ,ALL16例 ,CML 34例 ,其它恶性血液病 10例。全部患者经骨髓细胞形态检查 ,诊断符合FAB诊断标准。肝素抗凝骨髓或外周血 2 - 3ml,分离单个核细胞 ,取 5× 10 7个细胞 ,用RTIZOL 试剂一步法提取细胞总RNA ,行PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。回收目的片段 ,克隆到PGEM T载体 ,进行序列测定。结果表明 :在 5 5 / 98(5 6 % )的被检测病例有FHIT基因的异常表达 ,在AML、ALL和CML异常表达的发生率分别为 2 2 / 38(5 8% ) ,9/ 16(5 6 % )和 19/ 34(5 6 % )。正常骨髓或外周血标本未见有FHIT基因的异常表达。 4 3/ 98(44 % )的患者表达正常转录本 (Ⅰ型 ) ,4 0 / 98(41% )的患者同时表达正常转录本和异常     

SALIA及BMI-1在急性白血病中的表达

本研究旨在探讨SALL4及BMI-1基因在急性白血病患者中的表达及其临床意义。运用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）半定量检测62例急性白血病患者和10例对照者（非恶性血液病患者）骨髓细胞中SALL4及BMI-1的mRNA的表达水平。结果表明：①SALL4mRNA在除M3及T—ALL外的急性白血病中均高表达，在髓系白血病中表达显著高于B淋巴细胞白血病（P=0．022，〈0．05）；在对照者中9例不表达，1例低表达；②SALL4 mRNA在初治AL中表达较对照组明显增高，完全缓解组的表达明显下降，与初治组有显著差异（P〈0．05）；复发组的表达也明显增高，且略高于初治组患者（P=0．414）；③BMI-1除在M3型中也高表达外与SALL4的表达规律一致，两者表达呈显著正相关（r=0．684，P〈0．01）。结论：SALIA及BMI-1在急性白血病中异常高表达，影响白血病的发生和发展，它可作为急性白血病的发病、复发及预后判断的可能指标。