约氏疟原虫感染诱导大劣按蚊AdSP1 和AdSP3的转录

目的观察丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊主要组织中的表达,分析血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞AdSP1 和AdSP3转录的影响.方法离心收集血细胞,解剖分离大劣按蚊蚊胃和唾液腺,提取相应的总RNA,RT-PCR扩增;然后将同批3～5 d龄大劣按蚊分为正常组(N)、吸正常血组(B)和感染约氏疟原虫组(I),分别在血餐后1、2、3、4、7 d和11 d,收集3组各50只雌大劣按蚊血细胞和提取总RNA,以Ads7为内参照,进行半定量RT-PCR分析.结果丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊血细胞和唾液腺中表达,不在蚊胃表达;吸血和约氏疟原虫感染后,大劣按蚊血细胞中AdSP1 和AdSP3的转录上调,尤以约氏疟原虫黑化期间明显.结论 AdSP1和AdSP3可能参与大劣按蚊对约氏疟原虫的黑化反应,并可能是大劣按蚊的PPAE.     

大劣按蚊AdS7基因的克隆及分析

目的克隆AdS7基因cDNA序列,为大劣按蚊基因定量研究提供内参照.方法采用RT-PCR扩增、TA克隆技术获得AdS7 cDNA部分序列,标记地高辛AdS7探针,从大劣按蚊cDNA文库中筛选得到AdS7全长克隆,以半定量RT-PCR方法研究血餐和约氏疟原虫感染对其表达水平的影响.结果从大劣按蚊cDNA克隆得到长464 bp的AdS7基因cDNA部分序列,从大劣按蚊cDNA文库筛选获得了长871 bp的AdS7基因全长克隆,大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫后24 h,AdS7表达水平没有显著变化.结论 AdS7基因可作为大劣按蚊基因定量研究的内参照.     

与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库构建

目的 构建与按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵相关的差异表达cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入侵差异新基因奠定基础.方法 以大劣按蚊-约氏疟原虫为实验模型,分别将饱吸约氏疟原虫感染鼠血和正常鼠血后14 d的大劣按蚊作为T 组和D 组,采用抑制差减杂交方法和T/ A克隆技术构建按蚊唾液腺抗疟原虫子孢子入...     

大劣按蚊AdPPO2、AdPPO3基因cDNA克隆与组织定位

目的克隆大劣按蚊PPO基因家族新成员的cDNA部分序列,并对所克隆基因进行蚊体组织定位研究.方法根据已报道的多种昆虫PPO的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊总RNA为模板进行RT-PCR扩增、目的片段克隆入T载体,然后,用PCR方法筛选新的PPO克隆并测序;以RT-PCR方法分析AdPPO2和AdPPO3在蚊血淋巴、蚊胃和唾液腺的分布情况.结果 AdPPO2和AdPPO3基因cDNA部分序列长均为597 bp,编码199个氨基酸;它们在血淋巴、蚊胃和唾液腺均有分布.结论从大劣按蚊成功克隆获得2种新的PPO基因家族成员的cDNA部分序列,为进一步克隆其全序列奠定了基础.     

大劣按蚊TEP1 cDNA的克隆和生物信息学分析

目的 克隆大劣按蚊(Anopheles dirus)含硫酯键蛋白1(thioester-containing protein 1,TEP1)的cDNA,并分析其序列.方法 根据已报道的冈比亚按蚊等多种昆虫的TEP1氨基酸保守序列设计简并引物,以大劣按蚊血淋巴细胞总RNA为模板,进行RT-PCR扩增.对目的 片段纯化回收,经TA克隆后测定其核苷酸序列.利用DNASIS程序分析该序列,并推导其氨基酸序列,最后利用BLAST和DNASIS等进行不同昆虫TEP1氨基酸序列的比对.结果 RT-PCR扩增出一约770 bp的条带,TA克降后DNA测序发现,阳性克隆的核苷酸序列长774 bp,推导其氨基酸序列长258 aa.生物信息学分析表明,该序列与冈比亚按蚊、阿拉伯按蚊、斯氏按蚊TEP1基因的氨基酸序列同源性分别达72%、72%和59%,与冈比亚按蚊的TEP4氨基酸序列同源性为59%.结论 从大劣按蚊血淋巴细胞中成功克隆出了TEP1的cDNA部分序列.     

大劣按蚊卵黄蛋白原cDNA的克隆及转录水平研究

目的克隆大劣按蚊卵黄蛋白原c DNA,进行序列分析,并研究该基因在不同蚊期的转录水平变化。方法首先提取大劣按蚊总RNA,反转录成c DNA;然后设计昆虫卵黄蛋白原简并引物,以该c DNA为模板进行PCR扩增和测序,对所获取的序列进行生物信息学分析;最后利用实时荧光定量PCR方法检测卵黄蛋白原基因在蚊卵、幼虫、蛹和成蚊各时期的转录水平变化。结果 PCR成功扩增出了清晰的单一目的条带,经测序为一段1 071 bp的序列,BLAST比对分析显示该序列与浅色按蚊、库态按蚊和斯氏按蚊的卵黄蛋白基因同源性高达90%,与冈比亚按蚊、微小按蚊和美彩按蚊的同源性达89%。对大劣按蚊各时期卵黄蛋白原转录水平的研究结果显示,4 d龄按蚊卵黄蛋白原m RNA水平是3 d龄按蚊的15.2倍,而吸血后卵黄蛋白原m RNA水平高效上调,是未吸血组的955.7倍(P0.01);吸血组6 d龄按蚊卵黄蛋白原m RNA表达较吸血组4 d龄按蚊骤降(下降近1 870倍),而与未吸血组6 d龄按蚊相比,差异无统计学意义。结论本研究成功地克隆了大劣按蚊卵黄蛋白原基因的c DNA;大劣按蚊血餐后24 h卵黄蛋白原基因高效表达,提示卵黄蛋白原基因可能参与了大劣按蚊蚊卵的发育。     

大劣按蚊感染约氏疟原虫defensins基因的克隆及生物信息学分析

目的为探讨大劣按蚊对约氏疟原虫侵入的免疫反应,克隆大劣按蚊的抗菌肽defensins基因并对基因序列进行生物信息学分析。方法分别提取感染疟原虫的大劣按蚊的蚊胃总RNA,根据冈比亚按蚊defensins基因设计、合成简并引物,进行RT-PCR扩增目的片段,TA克隆后测序并进行序列分析。结果用简并引物的RT-PCR扩增出约氏疟原虫感染的大劣按蚊的189bp目的片段,序列分析表明与冈比亚按蚊defensins有87%同源性,与白蚊伊蚊defensinsD有88%同源性,为大劣按蚊的defensins基因。结论成功克隆并分析了大劣按蚊抗菌肽defensins基因,为进一步的重组表达和研究按蚊抗菌肽的生物活性奠定基础。     

大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶的交叉免疫活性

目的 探讨大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶之间是否存在交叉免疫反应性.方法 首先利用生物信息学方法分析不同昆虫间丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的保守性,尤其是大劣按蚊与烟草天蛾间丝氨酸蛋白酶的序列相似性;然后,PinPoint Xa-1表达载体对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶进行体外原核表达,利用Western blot方法检测表达产物与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清之间的免疫反应性.结果 生物信息学分析结果显示,不同昆虫间(包括大劣按蚊与烟草天蛾)丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有较高保守性;成功进行了大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的体外原核表达,western blot结果显示,烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清能够能够识别表达产物.结论 大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶具有交叉免疫活性,利用烟草天蛾丝氨酸蛋白酶抗血清研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶是可行的.这将为下一步从蛋白水平研究大劣按蚊丝氨酸蛋白酶的生物学特性奠定基础.     

吸血和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中rpS7转录的影响

目的　观察血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中核糖体蛋白S7(Ribosomalprotein ,rpS7)转录的影响。方法　同批 3～ 5d龄大劣按蚊分为正常组 (N)、吸正常血组 (B)和感染约氏疟原虫组 (I) ,分别在血餐后 1、2、3、7d ,离心法同时收集 3组各 5 0只雌大劣按蚊血细胞总RNA ,所有样品进行RT PCR后 ,各吸取 10ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶图像分析系统扫描并读取数据 ,并对所得数据进行统计学分析。结果　 3组大劣按蚊血细胞rpS7mRNA的RT PCR扩增产物量无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　类似于人类和小鼠 β actin ,以及冈比亚按蚊rpS7,大劣按蚊血细胞rpS7可作为从分子水平研究大劣按蚊抗约氏疟原虫感染防御相关因子的内参照     

感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白分析

目的获得并分析感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白.方法利用二维电泳方法分别分离感染约氏疟原虫前后的大劣按蚊血淋巴蛋白,进行考马斯亮蓝染色,并利用PDQuest 2D Elite软件分析和比较凝胶结果;对感染约氏疟原虫前后的差异表达蛋白进行质谱分析,获得肽质量指纹图谱;利用Mascot软件系统,在Swiss-Prot等数据库中检索和分析所获得的肽质量指纹图谱.预测差异表达蛋白的生物学特性和在卵囊黑化中的功能.结果获得了分辨率和重复性均较好的二维电泳图,感染组凝胶可见120个蛋白点,正常组凝胶可见95个蛋白点,二者比较分析后发现有37个差异蛋白点;质谱分析获得3个肽质量指纹图谱,于蛋白数据库检索后未发现匹配分值很高的相关蛋白,其中差异蛋白点1与冈比亚按蚊一蛋白具有较高的同源性.结论获得了感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异蛋白和部分差异蛋白的相关信息,这为从蛋白水平认识蚊媒和疟原虫的相互关系和更深入地利用大劣按蚊-约氏疟原虫模型开展卵囊黑化的相关研究奠定了基础.     

约氏疟原虫卵囊与唾液腺子孢子不同时相点的CSP与MAEBL基因表达研究

目的为研究约氏疟原虫在蚊体内发育过程中,卵囊子孢子与唾液腺子孢子不同时相点的环子孢子蛋白(circumsporozoite protein, CSP)与红细胞结合蛋白(erythrocyte binding protein, MAEBL)基因表达水平的变化.方法分别在约氏疟原虫感染斯氏按蚊后5、7、10 d取蚊腹部、12、15、18 d取蚊头胸部分离疟原虫总RNA,以rRNA 28S为对照,通过RT-PCR法半定量分析CSP与MAEBL mRNA表达量.结果蚊期疟原虫子孢子CSP与MAEBL转录显著上调(P<0.01),在侵入唾液腺后达到峰值.结论疟原虫唾液腺子孢子CSP和MAEBL mRNA高水平表达,提示CSP和MAEBL可能与侵入脊椎动物宿主密切相关.     

斯氏按蚊MyD88基因生物信息学分析及其在抗约氏疟原虫感染中的作用

目的 对斯氏按蚊MyD88基因进行生物信息学分析,并研究其在抗约氏疟原虫感染中的作用。方法 首先,通过VectorBase数据库获取斯氏按蚊MyD88基因cDNA序列,并利用VectorNTI、DNAMAN等软件对MyD88基因cDNA序列进行生物信息学分析。然后,根据MyD88的cDNA序列设计Real-time PCR引物,提取斯氏按蚊总RNA,通过反转录合成 cDNA,利用Real-time PCR方法检测MyD88基因在蚊各个生活史阶段转录水平情况及其在约氏疟原虫感染后的转录水平变化。结果 斯氏按蚊MyD88基因位于斯氏按蚊KB664619号染色体155 163~158 066 bp的反义链上,包含两个外显子,其cDNA全长1 383 bp,编码460个氨基酸。系统发育树结果显示,斯氏按蚊与大劣按蚊和冈比亚按蚊系统发育的距离近,其氨基酸序列同源性达79%。对斯氏按蚊各时期MyD88基因转录水平的研究结果显示,吸食正常血和感染血均能够上调MyD88的转录,吸血后3 d和5 d吸感染血组MyD88基因转录水平上调明显,显著高于正常血组和未吸血组。结论 本研究证实了Toll信号通路中的MyD88基因在蚊抗疟原虫感染的天然免疫中发挥了重要作用,在感染后3 d时作用明显。     

温度对斯氏按蚊传疟能力的影响及分子机制初探

目的 研究环境温度对按蚊传疟能力的影响,并通过比较分析不同温度下斯氏按蚊天然免疫关键分子TEP1转录水平,初步探讨相关分子机制,为气候变化对疟疾传播和流行的影响提供理论依据。 方法 本研究利用斯氏按蚊-约氏疟原虫动物模型,分别在24 ℃和28 ℃的环境温度下利用约氏疟原虫感染斯氏按蚊,感染后9 d解剖蚊中肠,荧光显微镜下观察疟原虫卵囊发育情况并计数,比较不同温度条件下疟原虫感染率和感染度。然后,利用荧光定量PCR方法比较不同温度条件下,感染前后不同时间点的斯氏按蚊TEP1分子的转录水平。 结果 在24 ℃的环境温度下,斯氏按蚊的感染率为91.7%,感染度为(403.9 ± 37.09)个/蚊。在28 ℃的环境温度下,斯氏按蚊的感染率为38.8%,感染度为(38.63 ± 13.91)个/蚊。24 ℃组的按蚊感染率和感染度均显著高于28 ℃组（P<0.001）。于吸血感染当天但尚未吸血时和吸血感染疟原虫后的第5天、第7天及第9天,斯氏按蚊的TEP1转录水平在28 ℃的条件下均高于24 ℃,提示斯氏按蚊TEP1参与的感染前基础免疫力和疟原虫感染中后期的免疫杀伤力28 ℃组均高于24 ℃组。结论 环境温度对按蚊传疟能力的影响较大,24 ℃较28 ℃的环境更适宜于约氏疟原虫感染斯氏按蚊;TEP1参与的天然免疫反应可能是温度对按蚊传疟能力影响的原因和分子机制之一。     

蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育影响

目的 研究蒿甲醚对约氏疟原虫在大劣按蚊体内发育的影响及其机制.方法 本课题利用已经建立的斯氏按蚊-约氏疟原虫模型,通过吸饲蒿甲醚糖水的方法,观察蒿甲醚是否影响约氏疟原虫在斯氏按蚊体内的发育.通过RT-PCR方法,分析NOS、TEP1和PPO三个斯氏按蚊重要的免疫反应相关基因的表达变化,以了解青蒿素类药物蒿甲醚影响疟原虫...     

约氏疟原虫子孢子感染对大鼠腹腔巨噬细胞B7.1﹑B7.2分子表达的影响

目的 研究约氏疟原虫感染后协同刺激分子B7.1、B7.2在大鼠腹腔巨噬细胞的表达情况,探讨B7.1、B7.2分子在宿主抵抗疟原虫感染免疫中的作用.方法 利用约氏疟原虫感染大鼠的动物模型,分别在感染约氏疟原虫子孢子后2、12、24、48、72 h分离获得大鼠腹腔巨噬细胞,通过免疫荧光及激光扫描共聚焦显微镜技术定量分析B7.1、B7.2分子表达情况.结果 在宿主感染约氏疟原虫后巨噬细胞B7.1、B7.2分子表达增加;B7.1上调较缓慢,并在72 h后出现回落;B7.2上调非常迅速,在48 h达到峰值,从72 h开始略有下降;在所选时间范围内B7.2的表达水平始终高于B7.1(P＜0.05). 结论 疟原虫子孢子感染大鼠后,B7.1、B7.2分子表达水平发生改变,提示协同刺激因子参与了宿主免疫系统活化,推测该现象与受疟原虫感染哺乳动物机体的免疫防御、免疫调控密切相关.     

伯喹对疟原虫的配子体、配子生殖和孢子增殖的影响

给感染约氏疟原虫尼日利亚亚种的小鼠灌服怕喹1.25mg/kg和1.95mg/kg8h后,小鼠血内配子体数可减少一半,有些配子体胞质出现空泡,甚至虫体变小,随着伯喹剂量的增加与延长药后感染蚊虫的时间,形成动合子的数量,卵囊的感染率、感染度以及子孢子进腺率均降低;同时显示伯喹可致动合子和卵囊的形态结构发生变异,胞质出现空泡,虫体收缩等。在给药1.25mg/kg后8h,1.95mg/kg后4h,2.5mg/kg和5mg/kg后2h感染蚊媒,均未见子孢子进腺。证实伯喹既可作用于疟原虫配子体,又可影响其配子生殖和孢子增殖。     

大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的：探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶（PO）与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法：以大劣按蚊/约氏疟原虫模型，利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法，比较、分析血餐后5、7、11、15d时不吸血组、吸正常血组和感染组3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶（MPO）和双酚氧化酶（o-DPO)活性；同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果：感染组的血淋巴MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组（P＜0.05)；但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高，感染组血淋巴MPO和o-DPO活性逐渐下降。另外，吸正常血组的MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组（P＜0.05)。结论：吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应，而大劣按蚊血淋巴酚氧化酶可能在大劣按蚊对黑化约氏疟原虫卵囊中发挥重要作用。     

约氏疟原虫红外期发育相关基因的研究

目的 寻找约氏疟原虫红外期发育相关基因,进行序列分析并推测其功能.方法 分别提取约氏疟原虫感染大鼠(IL)和正常大鼠(UL)肝脏总RNA,根据疟原虫基因A T含量高(＞70%)的特点,设计可选择性扩增约氏疟原虫基因的G C含量为40%的引物,采用差异显示PCR(differential display RT-PCR,DD-PCR)技术进行扩增,筛选差异片段,经TA克隆后测序并进行序列分析.结果 找到6个与约氏疟原虫红外期发育相关基因(PyHs4、PyHs5、PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9);其中PyHs4与约氏疟原虫乙酰葡萄糖胺磷酸变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase,AGM)具有相似性,PyHs5与约氏疟原虫红细胞膜蛋白3(erythrocyte membrance protein,PyHs5)具有同源性,PyHs6、PyHs7、PyHs8、PyHs9为功能未知基因.结论 应用DD-PCR技术成功扩增了与约氏疟原虫红外期发育相关基因,为进一步的重组表达进行功能和疫苗研究奠定基础.