骨髓增生异常综合征患者外周血树突细胞数量、亚群及其表面协同刺激分子表达的研究

目的 检测骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血树突细胞（DC）总量、亚群（pDC和mDC）比例及其表面协同刺激分子（CD80、CD86和CIMO）表达，探讨MDS患者细胞免疫异常的形成机制。方法 选取38例MDS患者及19名正常对照，采用荧光素单克隆抗体标记法和流式细胞术检测MDS患者外周血中Lin1^—HLA-DR^＋细胞（DC）、Lin1^-HLA—DR^＋CD123^＋细胞（pDC）、Lin1—HLA—DR^＋CD11c^＋细胞（mDC）的数量以及CD80、CD86和CIMO在DC膜上的表达。结果低危MDS组、高危MDS组和正常对照组外周血DC总量分别为（33．7±7．0）×10^6／L、（56．3±29．0）×10^6／L和（12．1±1．4）×10^6／L（P〈0．05），pDC数量分另U为（12．6±4．1）×10^6／L、（3．6±1．0）×10^6／L和（6．6±0．7）×10^6／L（P〉0．05），mDC数量分别为（16．7±6．3）×10^6／L、（28．7±17．6）×10^6／L和（5．5±0．9）×10^6／L（P〈0．05）。低危MDS组、高危MDS组和正常对照组DC占外周血单个核细胞（PBMNC）百分比分别为（2．37±0．53）％、（3．58±1．39）％和（0．68±0．08）％（P〈0．05），pDC占PBMNC百分比分别为（0．82±0．29）％、（0．31±0．06）％和（0．37±0．04）％（P〉0．05），mDC占PBMNC百分比分别为（0．96±0．35）％、（1．51±0．70）％和（0．32±0．05）％（P〈0．05）。低危MDS组、高危MDS组和正常对照组外周血中CD80^＋DC分别为（30．6±11．8）×10^6／L、（2．3±0．9）×10^6／L和（2．3±0．6）×10^6／L（P〈0．05），CD86^＋DC分别为（25．1±7．4）×10^6／L、（12．4±6．3）×10^6／L和（6．2±3．2）×10^6／L（P〈0．05），CD40^＋DC分别为（2．8±1．0）×10^6／L、（1．5±0．9）×10^6／L和（3．2±2．3）×10^6／L（P〉0．05）。结论 MDS患者外周血中DC数量增多、比例异常；以mDC增多为主，pDC无明显增多；MDS患者DC高表达CD80和CD86，CD40表达不增高。提示MDS患者诱导抗肿瘤细胞免疫的抗原呈递细胞（pDC）数量及功能不足；而与正常造血克隆炎性损伤有关的抗原呈递细胞（mDC）却增多。这可能是导致MDS患者细胞免疫异常的重要机制之一。     

高强度超声对荷U14宫颈癌小鼠脾细胞Th1/Th2亚群的影响

目的探讨高强度超声（HIU）对荷U14宫颈癌小鼠脾细胞Th1／Th2亚群的影响。方法将32只雌性BALB／c小鼠随机分为HIU治疗组、手术治疗组、荷瘤对照组及正常对照组，每组8只。各组于种植肿瘤或生理盐水后第7天，分别接受相应治疗；于第17天制备并培养小鼠脾淋巴细胞，收集上清液，应用双抗夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠脾淋巴细胞分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-4的浓度。结果受刀豆球蛋白A（Con A）刺激时，HIU治疗组IL-2浓度为（1110．13±338．10）pg／ml，较手术治疗组[（641．50±93．29）pg／ml]、荷瘤对照组[（215．75±62．54）pg／ml]明显增高（P〈0．05）；HIU治疗组IFN-γ浓度为（64984．86±9778．80）pg／ml，较荷瘤对照组[（42613．75±4050．75）pg／ml]明显增高（P〈0．05）；HIU治疗组IL-4浓度为（224．94±55．89）pg／ml，较手术治疗组[（330．56±94．63）pg／ml]、荷瘤对照组[（418．13±104．78）pg／ml]明显减少（P〈0．05）。未受ConA刺激时，HIU治疗组IL-2浓度为（1099．25±233．51）pg／ml，较手术治疗组[（241．00±35、44）pg／ml]、荷瘤对照组[（136．75±37．52）pg／ml]、正常对照组[（277．50±57．59）pg／ml]明显增高（P〈0．05）；HIU治疗组IFN-γ浓度为（45390．00±9961．26）pg／ml，较荷瘤对照组[（33662．50±14111．99）pg／ml]明显增高（P〈0．05）。结论HIU固化的U14肿瘤细胞可能激活机体免疫功能，促使其由Th2占优势向Th1占优势逆转，从而提高小鼠抗肿瘤免疫功能，抑制肿瘤生长。     

siRNA对腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖的影响

目的应用RNA干扰技术靶向阻断survivin基因表达，探讨其蛋白表达水平及对细胞增殖抑制作用。方法将siRNA真核表达载体Pgenesil-sur通过脂质体介导转染腺样囊性癌细胞，采用免疫组化法检测survivin基因蛋白表达；并用图象分析仪分析蛋白表达强度及表达抑制率。MTT法检测对腺样囊性癌细胞增殖的抑制作用。结果空白对照组、空质粒载体组、RNA干扰组survivin蛋白表达强度分别为：2．52±0．10，2．48±0．11，0．53±0．10。经统计学分析表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后。survivin基因蛋白表达水平明显减低（P〈0.05），其抑制率达到79％；转染空质粒载体与空白对照组差异无统计学意义（P〉0．05）；MTT法结果表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后细胞增殖受到显著抑制，抑制率为38．80％（P〈0．05）；转染空质粒载体细胞增殖未受到抑制（P〉0．05）。结论靶向survivin siRNA能抑制体外培养的腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖作用。     

rhG-CSF对健康供者外周血和骨髓免疫特性影响的比较

本研究探讨rhG—CSF对健康供者外周血采集物（G—PB）和骨髓采集物（G—BM）免疫学特性影响的异同。用MTT法和夹心酶联免疫复合物（ELISA）法检测G—PB和G—BM中T淋巴细胞增殖能力和IL-4、IFN-7的分泌，并用流式细胞术测定两种移植物的T细胞亚群、树突状细胞（DC）亚群、单核细胞及共刺激分子CD28的表达。结果表明：G—PB中淋巴细胞，CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞，DC1、DC2以及单核细胞的含量，CD4／CD8的比值高于G—BM（P〈0，001）。G—PB的T淋巴细胞增殖能力高于G—BM（P〈0．05）；每微升G—PB移植物中T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ,IL-4的量均明显高于G—BM，且G—PB中IL-4／IFN-γ比值小于G-BM（P〈0．001），DC2与T淋巴细胞的比值也低于G—BM（P〈0．01）；而G-PB中CD4^＋、CD8^＋细胞上CD28表达的百分比和总体表达均高于G—BM（P〈0．001）。结论：rhG—CSF体内应用诱导G—PB和G—BM产生的T细胞免疫低反应性是有差异的，而两者之间的差异是G—PB和G—BM移植后移植物抗宿主病（GVHD）发生率和程度不同的免疫学基础。     

女性系统性红斑狼疮患者血清性激素及相关细胞因子水平分析

目的了解女性系统性红斑狼疮（SLE）患者血清性激素及相关细胞因子水平,并探讨其与患者病情发生、发展的关系。方法用电化学发光法检测雌二醇（E2）、睾酮（T）、孕酮（Prog）、泌乳素（PRL）;放射免疫法检测雌三醇（E3）、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）,ELlSA法检测白介素-4（IL-4）和γ干扰素（IFN-γ）。结果女性SLE患者E2[（53．44±32．10）μg／L]、E3[（4．98±1．60）μg／L3、Prog（（1．78±0．97）μg／L]、PRL[（18．18±13．74）μg／L]水平均明显高于健康对照组（P〈0．05）,患者活动期的E2[（67．63土33．55）μg／L]、μg/L]、Prog[（1．82土0．79）μg／L]和PRL[（23．48±16．04）μg／L]水平明显高于稳定期和健康对照组（P〈0．05）。患者IL-4水平活动期[（21．35±3．60）ng／L]和稳定期[（19．93±3．93）ng／L]均明显比健康对照组高（P％0．05）,而IFN-γ水平活动期[（12．67±0．74）ng／L]和稳定期[（13．02±1．96）ng／L]却明显比健康对照组低（P〈0．05）。结论E2、Prog、PRL水平与SLE病情活动密切相关。IL-4水平明显高于健康对照组,IFN-γ水平明显低于健康对照组（P〈0．05）,支持SLE患者体内存在Th1细胞向Th2细胞转化,表现为以Th2细胞为主的免疫应答。     

慢性非瓣膜心房颤动患者TNF-α与IFN-γ水平及其意义

目的：观察慢性非瓣膜心房颤动患者血浆TNF-α、IFN-γ的变化，探讨炎症与慢性非瓣膜心房颤动的关系。方法：45例住院患者分为持续性非瓣膜心房颤动组（NVAF组）24例，对照组（非房颤组）21例。检测其血浆TNF-α、IFN-γ水平并对结果进行统计学分析。结果：NVAF组TNF-α（0．08±0．04和0．10±0．02）、IFN—γ（0．10±0．02和0．13±0．02），（均P〈0．05）均显著高于对照组，且两者呈直线相关关系。结论：炎症反应参与慢性非瓣膜，22房颤动的发生与发展过程。     

MODS大鼠外周血单个核细胞内核因子-κB和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的表达

目的探讨多器官功能障碍综合征（MODS）大鼠外周血单个核细胞（PBMC）内核因子-κB（NF—κB）和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）的表达及相互关系。方法健康雄性SD大鼠40只，随机分为四组（每组10只），正常对照组，脂多糖（LPS）刺激组，罗格列酮（ROSI）预处理组，选择性拮抗剂2-氯-5-硝基苯胺（GW9662）预处理组。免疫细胞化学法检测PBMC内PPARγ、NF—κB p65的表达活性，并进行图像分析。结果（1）在正常组大鼠PBMC内NF-κB p65、PPARγ表达均较少。LPS刺激组NF—κB p65表达与正常组比较显著增加（P〈0．01）；PPARγ表达稍有增高，与正常组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。ROSI组NF-κB p65表达与LPS刺激组比较显著降低（P〈0．01）；PPARγ表达与LPS刺激组比较显著增加（P〈0．01）。GW9662组NF—κB p65表达与LPS刺激组比较差异无统计学意义（P〉0．05）；PPARγ表达显著降低，与正常组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。（2）相关分析结果表明，PBMC内NF-κB和PPARγ活性变化在LPS刺激组、ROSI组、GW9662组呈显著负相关（LPS刺激组：r=-0．916，P〈0．01；ROSI组：r=-0．605，P〈0．05；GW9662组：r=-0．961，P〈0．01）。在正常对照组无明显相关性（r=0．185，P〉0．05）。结论PPA脚可能是通过抑制NF—κB的活性而对MODS大鼠起保护作用。     

不同时间电刺激训练对大鼠骨骼肌IGF-1不同拼接体mRNA表达的时序性影响

目的：观察不同时间电刺激训练对肌肉组织IGF—1不同变构体mRNA表达的时序变化，探讨电刺激促进肌肉生长和修复的机制。方法：SD大鼠30只，随机分为5组，每组6只，分别为对照组和1、2、3、4周电刺激组，刺激部位为右侧腓肠肌。训练后采用实时荧光定量PCR法对腓肠肌IGF-1Ea和MGF mRNA表达进行检测。结果：各电刺激组MGFmRNA表达较对照组分别增长了3．97±0．86、4．05±0．71、4．13±0．80、4．24±0．77倍（P〈0．01）。但MGF mRNA表达在4个实验组间依序比较没有显著性差异（P〉0．05），呈现训练后迅速升高并达平台;而IGF-1Ea的mRNA表达比对照组分别增长了1．55±0．29、3．99±0．83、5．11±0．82、5．27±0．86倍（P〈0．01），1、2、3、4周训练的实验组依序比较显示，随刺激时间延长，表达量逐渐升高，在第3周达平台。3周后两者都达到较高水平。结论：①MGF的mRNA受外界机械刺激迅速大量表达至高峰，没有时序性变化，表明MGF在启动肌肉生长修复早期事件中起关键性作用：②IGF—1Ea在促进肌肉生长修复中与MGF有序贯性作用：③IGF-1生长因子变构体是电刺激训练引起的肌肉适应性肥大的分子生物学机制之一，在电刺激训练中需要至少3周才能发挥两者共同的功效。     

高原红细胞增多症患者骨髓单个核细胞GATA-1和GATA-2的表达研究

目的探讨高原红细胞增多症患者骨髓单个核细胞（MNC）GATA-1、GATA-2 mRNA及蛋白表达的变化及作用。方法采用RT—PCR法检测高原红细胞增多症患者骨髓MNCGATA-1、GATA-2mRNA表达水平，并采用免疫细胞化学方法检测骨髓细胞GATA-1、GATA-2蛋白水平。同时以13例非血液病患者及7名正常人为对照。结果①高原红细胞增多症患者GATA-1和GATA-2 mRNA的相对表达水平分别为1．033±0．146和0．451±0．073，对照组GATA-1和GATA-2相对表达水平分别为0．458±0．076和0．185±0．074，高原红细胞增多症患者明显高于对照组（P〈0．01）。免疫细胞化学检测结果显示高原红细胞增多症患者GATA-1和GATA-2蛋白表达均为阳性，阳性细胞数分别为77．3±33．3和29．4±11．4，阳性细胞积分分别为135．4±75．4和48．4±19．7。20例对照均表达GATA-1蛋白（阳性细胞数为18．1±11．3，阳性细胞积分为24．2±13．4），仅12例表达GATA-2蛋白（阳性细胞数为5．4±3．0，阳性细胞积分为7．3±4．2），高原红细胞增多症患者明显高于对照组（P〈0．01）。②GATA-1、GATA-2 mRNA与蛋白表达水平呈正相关（P〈0．01），高原红细胞增多症患者GATA-1 mRNA和蛋白表达水平与血红蛋白浓度呈正相关（P〈0．01）。③GATA-1和GATA-2蛋白表达分布在细胞质而非细胞核。结论高原红细胞增多症患者骨髓细胞中GATA-1、GATA-2表达升高，进一步影响红系血红蛋白基因表达增强，可能是高原红细胞增多症的重要发病机制之一。     

稀土化合物氯化镧对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞分泌-一氧化氮的影响

目的探讨氯化镧（LaCl3）由对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠巨噬细胞（RAW264．7）分泌一氧化氮（nitric oxide，N01的影响。方法RAW 264．7细胞随机分成四组：空白对照组（培养基中不含LaCl3和LPS），氯化镧组（含LaCk2．5，5，10，20μmol／L培养24h）、氯化镧＋LPS组（分别以含LaCl3 2．5、5、10、20μmol／L的培养基培养24h后．更换含LPS 1mg／L的培养基继续培养24h）及LPS组（含LPS 1mg／L的培养基培养24h）。采用硝酸还原酶法测定各组细胞培养液上清一氧化氮（NO）的含量。结果LPS组培养上清NO浓度为52．82±12．60μmol／L与空白对照组（2．90±2．36μmol／L）和LaCl3组[（6．50±4．67μmol／L、9．52±4．47μmol／L、11．14±7．42μmol／L、6．74±2．00μmol／L]比较有显著性差异（P〈0．05）；LaCl3＋LPS组NO的浓度分别为26．00±5．83μmol/L（2．5μmol／L LaCl3＋LPS）、29．86±7．26μmol／L（5μmol／L LaCl3＋LPS）、34．62±6．24μmol／L （10μmol／L LaCl3＋LPS），与LPS组相比显著减少（P〈0．05），20μmol／L LaCl3＋LPS）组NO的产生为45．61±6．68μmol／L与LPS组比较无显著性差异。结论一定浓度的LaCl3可抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞产生NO的水平。     

树突细胞分泌的exosomes生物学特性及功能的初步研究

目的建立树突细胞（DC）分泌的exosomes的制备方法，分析其生物学特性及其在抗肿瘤免疫中的功能。方法从正常人外周血单个核细胞中诱导未成熟DC（imDC），并使其负载K562细胞的抗原，然后用脂多糖（LPS）诱导DC成熟（mDC），通过超速离心结合膜超滤的方法分别提取imDC和mDC分泌的exosomes。检测exosomes的粒径并通过电子显微镜分析exosomes的形态，Western blot法检测exosomes的表面分子。比较mDC和imDC分泌的exosome8引起的针对K562抗原特异性T细胞的增殖、CD69的上调、细胞因子IFN．1的分泌及对肿瘤细胞的杀伤能力。结果制备的exosomes为碟状小囊泡，平均直径为72．3nm，表达CD80、CD86、HLA．DR、FasL、CD54和乳脂肪球-表皮生长因子-因子Ⅷ（MFG-E8）。与imDC相比，mDC分泌的exosomes CD80表达较高而MFG-E8的表达较低，并且在体外mDC分泌的exosomes能够更显著地引起特异性T细胞的增殖和免疫应答：在exosomes最适浓度下，T细胞增殖的吸光度值为O．50±0．01，激活T细胞的CD69上调，并且有（13．4±5．8）％T细胞扩增，（22．8±2．4）％的T细胞产生细胞因子IFN-1，对肿瘤细胞的杀伤率为（21．3±8．6）％。结论建立了简便、快速的exosomes分离纯化方法，所分离的exosomes具有引起抗肿瘤免疫应答的功能     

慢性特发性血小板减少性紫癜患者外周血树突细胞的变化及意义

目的 探讨慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者体内树突细胞(DC)数量和功能的变化.方法 慢性ITP患者予以大剂量地塞米松(HD-DXM)冲击治疗,剂量40 mg/d,口服,连续4 d,观察短期疗效.用流式细胞术检测患者外周血中髓系DC(mDC)和浆细胞样DC(pDC)在治疗前后绝对数量的变化及与CD4+CD25+调节性T(Treg)细胞的相关性;流式细胞术检测外周血总Dc表面协同刺激分子的表达.将慢性ITP患者外周血单核细胞来源的DC、CD4+T淋巴细胞与自身血小板或健康人同源异基因血小板混合培养,观察CD4+T淋巴细胞增殖情况,检测DC血小板相关抗原的呈递功能.结果 与正常对照组比较,慢性ITP患者外周血pDC和mDC绝对数量均无明显变化(P值均》0.05);而外周血CD4+FOXP3+T细胞数明显降低(P《0.01),pDc和mDC与CD4+FOXP3+T细胞数之间均存在负相关性(r=-0.396,P=0.045和r=-0.410,P=0.037).HD-DXM治疗初始反应率达92.3%,pDC绝对数量较治疗前减少达75.5%(P《0.01);而mDC较治疗前虽增加了24.3%(P《0.05),但mDC上CD11c表达的平均荧光强度(MFI)从治疗前340±30降至199±21(P《0.01);CD4+F0xP3+T细胞数较治疗前显著增加(P《0.01),治疗后pDC与CD4+F0XP3+T细胞存在负相关(r=-0.524,P=0.006),而mDC与CD4+F0XP3+T细胞间无相关性(r=-0.360,P=0.071).慢性ITP患者外周血DC表面协同刺激分子CD86表达的MFI明显高于正常对照组(P《0.05);CD86、CD40、CD80表达阳性率及CD40、CD80表达的MFI与正常对照组比较差异均无统计学意义(P值均》0.05).慢性ITP患者CD4+T淋巴细胞增殖反应强度高于对照组(P《0.05),DC对血小板相关抗原呈递功能亢进.结论 DC可能参与了慢性ITP的免疫发病机制,并与CD4+CD25+Treg细胞有一定的关联.     

单用A23187快速诱导K562细胞分化成树突细胞的研究

目的探索一种快速、简便、廉价而高效获取树突细胞(DC)的方法。方法通过单用A23187、A23187+GMCSF或联合细胞因子(GMCSF、IL4及TNFα)将K562细胞诱导分化为DC(K562DC),倒置显微镜下观察细胞形态并摄相,流式细胞术检测K562DC表面分子表达情况。用MTT法检测K562DC刺激异基因淋巴细胞增殖及介导T细胞杀伤靶细胞的能力。结果上述3种细胞因子组合均能诱导K562细胞向成熟DC分化,均高表达CD1a、CD80、HLADR、CD83和CD86;含A23187的两组诱导72h获得DC数量分别为(69.5±17.2)%、(73.1±13.9)%,均高于细胞因子组的诱导率[(28.5±12.3)%],也高于细胞因子组诱导7d后的诱导率[(51.2±10.7)%](P值均<0.05);诱导7d后,含A23187的两组诱导的DC低表达CD1a,分别为(8.2±2.3)%和(10.3±5.1)%,而CD83表达分别高达(85.6±8.8)%和(82.4±9.1)%,而细胞因子组CD1a和CD83表达率分别为(17.2±1.6)%和(77.4±12.9)%;3组所获得的DC在对异基因淋巴细胞的刺激增殖能力及其致敏T细胞对靶细胞的杀伤作用差异无统计学意义(P值均>0.05)。结论单用A23187可快速(72h以内)诱导K562细胞向成熟DC转化,与联合细胞因子相比,该方法所获得的DC更趋成熟从而更适用于临床免疫治疗。单用A23187快速诱导白血病细胞生成DC是一种快速、简便、廉价而高效获取DC的方法。     

树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养增强其体内外抗肿瘤活性

目的探讨与树突细胞(DC)共培养能否增强正常人细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的体内外抗瘤活性.方法分别按照常规方法从正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将NB4白血病细胞冻融物(LCL)冲击或未冲击的DC与CIK细胞共培养(LCL-DC+CIK、DC+CIK),以CIK细胞单独培养作为对照.用流式细胞术分析细胞表型,酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定分泌IFN-γ的细胞数,51Cr释放实验测定体外细胞毒活性,同时用NB4细胞系建立荷瘤裸鼠模型研究其体内抗肿瘤活性和归巢情况.结果在培养第15天, LCL-DC+CIK与CIK细胞单独培养相比,增殖速率明显提高 [(18.2±2.1)倍vs(11.6±2.3)倍, P<0.05],CD3+CD56+ 表达水平也明显提高 [(51.05±2.63)% vs(30.18±1.45)%, P<0.05],分泌IFN-γ的细胞数量明显增高 [(86.33±5.51)/104细胞 vs(44.61±3.05)/104细胞, P<0.05],同时LCL-DC+CIK对NB4、K562、KG1a的体外细胞毒活性增强.体内实验显示与单独培养CIK细胞相比,LCL-DC+CIK细胞共培养后,可明显抑制接种瘤细胞裸鼠的成瘤率,提高裸鼠的长期无瘤存活率(100% vs 66.7%, P<0.05),以DiI标记的LCL-DC+CIK细胞在接种后7 d内可在脾脏、淋巴结及肿瘤局部被检测到.LCL-DC+CIK与DC+CIK细胞在抗瘤效应上没有明显差异.结论与DC共培养可使CIK细胞获得更高的增殖速率和更强的体内外抗肿瘤活性,可以作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略.     

小鼠髓源性树突状细胞的体外扩增及生物学特性的鉴定

目的以小鼠骨髓细胞为前体,建立一种高效、简便的体外扩增、分离培养树突状细胞(DC)的方法。方法实验分为GM/4组和GM/4-α组,以重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组鼠白介素-4(rmIL-4)对小鼠骨髓细胞联合诱导培养,GM/4-α组在第5天添加rmTNF-α继续培养48 h,GM/4组不加并于第5天时终止培养;分别收集第5天、第7天的悬浮及疏松贴壁细胞,扫描电镜观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面分子,同种异体混合淋巴细胞反应(MLR),检测2组细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果所收集的2组细胞均具有典型DC形态,细胞表面高表达小鼠髓源性DC相对特异性标志CD11c,表达率达75%以上;GM/4组DC细胞表面CD40、CD86、MHC-Ⅱ的表达率分别为30.5%、34.2%、45.1%,GM/4-α组则分别为78.7%、88.3%、96.7%;MIR中GM/4组DC刺激同种异体T细胞活化增殖的能力不如GM/4-α组强。结论此种方法能于体外定向诱导和扩增出大量髓源性DC,这为后续研究DC在器官移植后诱导机体免疫耐受的机制奠定了基础。     

转化生长因子β1对树突细胞功能的影响

目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对树突细胞(dendritic cells,DC)功能的影响.方法在培养体系中应用不同的细胞因子培养未成熟DC(imDC,GM-CSF)和TGF-β1处理的DC(TGFβ-DC,GM-CSF+TGF-β1),观察其对脂多糖(LPS)刺激的反应.透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞仪检测细胞表型,BrdU ELISA法检测DC刺激异基因T细胞增殖的能力,ELISA法检测DC在LPS刺激后分泌IL-12p70的水平,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Toll-like受体4(TLR4)表达.结果与imDC相比,TGFβ-DC在LPS刺激后仍能保持未成熟的细胞形态.TGFβ-DC的CD80,CD86表达明显低于imDC[(4.14±0.95)%和(13.90±7.22)%;(8.60±0.75)%和(20.63±5.03)%,P值均＜0.05].ImDC对LPS有更强的反应性,其中I-Ab、CD80升高的幅度明显高于TGFβ-DC(P值分别＜0.01及＜0.05).TGFβ-DC在96 h的混合淋巴细胞反应中,DC/T细胞为14,11时,TGFβ-DC的异基因刺激能力较imDC弱(P值均＜0.05).LPS刺激TGFβ-DC 24 h后分泌IL-12 p70的能力显著低于imDC(P＜0.01),TGFβ-DC较imDC弱表达TLR4(P＜0.05).结论TGFβ能抑制DC共刺激分子的表达,且能抵抗LPS的促成熟作用,并可能与其TLR4的表达下降有关.     

Effective strategy of dendritic cell-based immunotherapy for advanced tumor-bearing hosts: the critical role of Th1-dominant immunity

Although dendritic cell (DC)-based cancer-specific immunotherapy is a potent strategy for various types of carcinomas, few clinical studies have yielded optimal antitumor effects. Systemic immunodeficiency is observed in patients with advanced malignant disease. In this study, we explored the ability to induce antitumor immunity of the cultured monocyte-derived DCs from hosts with advanced malignant disease, using a mouse model. We found remarkable dysfunction of DCs from mice with advanced cancer, which exhibited T helper (Th)2-dominant immunity, and subsequent reduced antitumor immune response. On the other hand, we found dramatic restoration of the ability of DCs to induce optimal antitumor immune responses after systemic administration of streptococcal preparation OK-432 to the tumor-bearing mice, which induced Th1-dominant immunity. In therapeutic experiments, intratumoral injections of immature DCs from the OK-432-treated mice, designated OK-DCs, enhanced inhibition of tumor growth compared with injections of immature DCs from mice with advanced malignancies, designated T-DCs (P < 0.05), leading to significant prolongation in overall survival (P < 0.05). In analysis of cell surface antigens, antigen-presenting capability and interleukin 12 production, we showed functional skewing in T-DCs and significant restorations in OK-DCs. More CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes were detected in the mice treated with OK-DCs; furthermore, CTL assays showed that intratumoral injection of OK-DCs induced tumor-specific immune response to spleen as great as those of N-DCs. These results suggested that Th1-dominant immunity might play a crucial role in the differentiation of DCs, and OK-432 might be useful for inducing optimal antitumor effects in DC-based immunotherapy in tumor-bearing hosts.     

IFN-γ激活的树突状细胞对患者急性髓性白血病细胞的杀伤作用

为检测干扰素γ(IFNγ)激活的外周血树突状细胞(DC)对患者急性髓细胞白血病(AML)细胞的直接杀伤活性并探讨其杀伤机制,分离健康供者外周血单核细胞,用重组粒巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导生成DC。于诱导第7天在合成培养液中加入IFNγ继续培养12小时,将其激活。从6例初发的急性髓细胞白血病患者外周血分离单个核细胞作为靶细胞,以不同效靶比与DC共同培养18小时,采用51Cr释放试验检测DC激活前后抗肿瘤活性的差异。同时,用流式细胞术检测DC表面共刺激分子,细胞膜及细胞内Fas配体(FasL)、TNFα及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的改变,以明确IFNγ激活的DC对肿瘤细胞直接杀伤活性的作用机制。结果表明:IFNγ可增强DC对AML细胞的杀伤活性,在效靶比为20∶1时杀伤率为(33.8±1.6)%,与未加刺激因子前相比有显著差异(P<0.05);IFNγ可上调DC表面共刺激分子CD86和CD83的表达;IFNγ刺激后,DC细胞内TRAIL表达明显增强,但其在细胞表面仍呈现低表达,而细胞内及细胞表面FasL及TNFα在IFNγ刺激前后均无明显变化。结论:IFNγ激活的DC可有效杀伤患者AML细胞,其作用机制与DC的成熟及TRAIL凋亡途径部分相关,而与FasL及TNFα凋亡途径无关。     

急性髓系白血病细胞总RNA冲击的树突细胞诱导抗自身白血病的T细胞免疫

目的探讨白血病细胞RNA冲击的完全缓解期的急性髓系白血病(AML-CR)患者骨髓单个核细胞(BMMNC)衍生的树突细胞(mRNA-DC)体外刺激自体T细胞抗白血病免疫的可行性及有效性。方法应用联合细胞因子(GM-CSF、IL-4)培养法从AML-CR患者贴壁BMMNC诱导DC,在诱导的第5天用脂质体DOTAP介导法以自体白血病细胞的总RNA冲击DC,然后以含10 ng/m l的TNF-α的培养基继续培养24 h促进其成熟,培养7 d后收获细胞,作为mRNA-DC。以流式细胞术检测DC特征性表型的表达;以MTT法测定mRNA-DC对自体T细胞的促增殖活性;将mRNA-DC与T细胞按1∶3混合,共培养7 d,收获活化的T细胞,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定分泌γ干扰素(IFN-γ)阳性细胞数;乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒活性。结果14例AML-CR患者BMMNC均可在体外分化为具有特征性形态和表型的成熟DC;当刺激细胞与反应细胞比例为1∶16时,mRNA-DC可刺激自体T细胞产生明显的增殖活性[(36.84±5.68)%],与未冲击DC组[(12.20±3.16)%]比较差异具有统计学意义(P<0.05,n=9);ELISPOT分析显示分泌IFN-γ的mRNA反应性的T细胞得到明显扩增;体外活化的T细胞在效靶比为20∶1时,对自体白血病细胞显示明显的杀伤活性[(45.46±6.34)%],与未冲击的DC组[(12.32±1.32)%]及单纯IL-2组[(13.26±2.28)%]比较,差异有统计学意义(P<0.05,n=5)。结论应用白血病细胞RNA冲击的DC疫苗免疫可以作为一种可行、有效的防治微量残留白血病的方法。