嵌合抗体技术研究进展

综述基因工程抗体中的重要组成部分———嵌合抗体的研究进展。基因工程抗体是第三代抗体,其应用日益受到重视,但是在临床治疗中人抗鼠抗体(HAMA)反应导致鼠源性抗体的应用受到了极大的限制。利用基因工程技术对鼠源性抗体进行改造,保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性、减少鼠源成分,从而克服鼠源性单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。     

人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M重组抗体制备及J链对其聚体形成的影响

目的 体外制备人鼠嵌合弓形虫免疫球蛋白M(TOX-IgM)抗体,并验证加入J链对IgM抗体蛋白聚体、效价及稳定性的影响.方法 从美国国家生物信息中心数据库获取抗体的重链可变区、轻链可变区以及J链序列,通过DNA重组技术分别将TOX抗体轻重链可变区和人源恒定区进行拼接,构建人鼠嵌合IgM表达载体,转染HEK 293F细胞...     

重组抗B细胞淋巴瘤嵌合抗体的构建及鉴定

目的:构建重组抗B细胞淋巴瘤嵌合抗体SM03,并进行特性鉴定。方法:分别克隆鼠抗人CD22单抗轻/重链可变区基因VL/VH,构建重组SM03嵌合抗体轻链表达载体(SM03pEkappa)和重链表达载体(SM03pEgamma)。转染细胞经选择培养和克隆化,筛选出高效表达细胞株。采用SDS-PAGE、ELISA、流式细胞仪和免疫组化分析,检测纯化产物的相对分子质量、特异性和亲和力、淋巴瘤细胞毒效应,以及人体组织交叉反应性。结果:构楚了重组人CD22嵌合抗体SM03表达系统,SM03嵌合抗体相对分子质量约1．5×10~5,还原为轻链和重链两条带,相对分子质量分别为2．7×10~4和5．0×10~4。SM03嵌合抗体特异于B细胞CD22抗原,对恶性淋巴瘤细胞具有生长抑制效应。结论:成功构建重组人CD22单克隆抗体,为恶性B细胞淋巴瘤的临床治疗和应用奠定了基础。     

鸡-人嵌合抗体表达载体的构建

由于鸡与哺乳动物亲缘关系较远，因此，可以对一些高度保守的哺乳动物分子产生烈强的抗体应答。而且鸡可通过DNA重组、基因转移而产生具有不同型别的抗体库。鸡抗体重链和轻链的基因座仅含有单一功能可变区和连接区基因，通过一对引物就可扩增可变区基因库。但是由于鸡抗体对人体具有免疫原性，因此其临床应用受到限制。     

重组抗人CD25嵌合单克隆抗体的表达及纯化

采用NSO工程细胞表达重组抗人CD25嵌合单克隆抗体,在5 L细胞反应器进行批次培养,细胞悬液中目标单抗的平均表达量为108 mg/L,每批细胞悬液总体积为4 L.细胞悬液离心后上清液经rProtein A Sepharose FF和SPSepharose FF两步色谱纯化,得纯度大于95%的单抗,回收率约33%.纯化产物经Western blotting验证为目标单抗,具有免疫原性.N-端15个氨基酸序列测定结果与理论序列相符.     

应用抗体"框架重塑"技术构建人源化抗体fSM03

目的：应用抗体“框架重塑”（framework-reengineering）技术构建人源化抗体iSM03。方法：互补决定区（CDRs）克隆来源于嵌台抗体SM03；VL框架FR1，FR2，FR3和FR4分别优选自人源基因JOH，Vd’CL，WES和RZ；VH框架FR1，FR2，FR3和FR4优选自人源基因WAS，WAS，GAL和DOB，无须涉及任何鼠源残基的回复突变。分别合成轻链表达载体pEk及重链表达载体pEγ，转染宿主细胞SP2／O。结果：fSM03保持了原有亲本抗体的功能特性，如CD22特异性和亲和力、细胞内化以及淋巴瘤细胞毒效应等。结论：应用框架重塑技术成功构建了人源化抗体fSM03，无须引入新的鼠源残基，较CDRs移植更为简便灵活。     

B7-1人-鼠嵌合抗体对小鼠慢性移植物抗宿主病(cGVHD)狼疮样肾炎的免疫干预效应

目的探讨在诱导c GVHD小鼠狼疮样肾炎模型并通过各项指标鉴定其造模成功的基础上,运用自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体阻断B7/CD28共刺激信号通路对小鼠狼疮样肾炎模型病理损伤的逆转效应。方法将6~8周龄雌性(C57BL/6×BALB/c)BCF1小鼠随机分为4组,模型组于0、3、7和11 d经眼眶静脉注射100μL雌性亲代BALB/c小鼠脾脏细胞107/只。抗体干预组在造模后第1、3、5、8、15、30及60天分别经眼眶静脉注射100μL B7-1人-鼠嵌合抗体(克隆号2B11)200μg/只,环磷酰胺(CTX)干预组在末次注射淋巴细胞后第1、3、5、8、15天分别腹腔注射100μL CTX 2.5 mg/只。按照上述时间点分析小鼠抗ds DNA抗体、ANA及尿蛋白含量,12周时处死小鼠观察肾脏组织HE染色、免疫复合物(IC)沉积等情况。结果模型组100%小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为++~++++,抗体干预组12周时仅有30%的小鼠出现蛋白尿,尿蛋白含量为+~++;12周时与模型组相比,抗体干预组小鼠血清抗ds DNA抗体阳性率由50%降至0;抗体干预组ANA阳性率由90%降至40%,且荧光面积与荧光亮度均下降;HE染色镜下观察,抗体干预组肾小球囊腔大小较为均一,炎性细胞浸润减少;直接免疫荧光法可见抗体干预组肾小球血管襻IC沉积减少。结论 B7-1人-鼠嵌合抗体可通过阻断或削弱B7/CD28共刺激信号通路,减少自身抗体和IC生成,逆转狼疮肾炎的病理损伤,提示该自行研制的B7-1人-鼠嵌合抗体对狼疮肾炎具有潜在的防治作用。     

人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗-空间稳定脂质体的制备及其体外靶向

目的研究人鼠嵌合抗肿瘤细胞核单抗(chTNT-3)-空间稳定脂质体的制备方法、免疫活性及体外靶向性。方法合成聚乙二醇末端带吡啶二硫丙酰基的磷脂衍生物(PDP-PEG-HSPE)，制备含PDP-PEG-HSPE的空间稳定脂质体，经二巯基苏糖醇还原后共价连接马来酰亚胺衍生化抗体。荧光胺法和钼蓝法测定脂质体与抗体的连接效率及抗体密度，激光散射粒度仪测定其粒径分布，ELISA法检测脂质体表面的抗体免疫活性。体外实验考察该免疫脂质体与固定Raji细胞的结合活性。结果chTNT-3-空间稳定脂质体的粒径分布为(115±33) nm。当初始Ab/PDP-PEG-HSPE=1∶10时，脂质体与抗体的连接效率为71%，抗体密度为106 μg Ab/μmol PL。chTNT-3经化学修饰后连接到脂质体表面，其免疫活性基本保留。chTNT-3-空间稳定脂质体能特异性地结合固定Raji细胞。结论通过PDP-PEG-HSPE法共价连接抗体制备的chTNT-3-空间稳定脂质体能基本保留chTNT-3的免疫活性，具有体外靶向细胞核抗原的能力。     

EMEA警告重组人凝血因子Ⅶ产生抗体的风险

欧洲药品监督管理局（EMEA）警告患者和医疗专业人员，一些曾经用过重组人凝血因子Ⅷ治疗A型血友病的患者产生了针对此凝血因子的抗体，结果导致出血不能得到有效控制。     

抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤的治疗作用

目的 检测抗血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤的治疗作用.方法 40只4周龄雄性BALB/c裸鼠建立肝癌H22细胞移植瘤模型后随机均分为Fab抗体(A)组和生理盐水对照(B)组.比较两组裸鼠生存时间、移植瘤病理变化及微血管密度(MVD).结果 成功建立裸鼠H22肝癌原位移植瘤模型,HE染色显示肝细胞肝癌.A组裸鼠中位数生存时间明显长于B组(20.0 d vs.14.0 d)(P＜0.01);A组肝脏实体瘤内MVD较B组显著减少(8.65±1.79 vs.25.64±1.53)(P＜0.05).结论 抗VEGFR-2嵌合Fab抗体对裸鼠肝癌原位移植瘤有治疗作用.     

重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体在类风湿 关节炎患者体内药动学研究

目的：研究连续静脉滴注重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体（anti-TNF rcMAb）在类风湿关节炎患者体内的药动学。方法：按GCP指导原则设计试验方案,选择9例类风湿关节炎患者,年龄（41±16）岁,在2 h内匀速静脉滴注anti-TNF rcMAb,每次3 mg?kg-1,共给药5次,用酶联免疫吸附法（ELISA）测定人血清中各点anti-TNF rcMAb浓度。采用DAS 2.1.1软件进行数据处理,计算药动学参数。结果：受试者多次静脉滴注anti-TNF rcMAb,按非房室模型计算,主要药动学参数t1/2为（9.2±1.8） d,Css max为(0.008±0.001) mg?L-1,Tss max为（0.092±0.018） d,AUCss为(248±38) mg?d?L-1,Vss为（0.10±0.08） L?kg-1,DF为（5.5±0.6）。受试者在给药期间未出现严重不良反应。结论：本研究在给药后第3次时血药浓度可达到稳态,连续给药5次后体内未见蓄积,该方案适宜在临床推广使用。建议临床按此方案用药时,使用时间不宜过长,以减少药物不良反应。     

恶性肿瘤患者应用~(131)I肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体的护理体会

放射免疫治疗是继肿瘤放、化疗后又一全新的治疗方法。^131I肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体（唯美生），放射性浓度约为370MBq／mL，是一种用于实体瘤放射免疫治疗的^131I标记的人鼠嵌合型单抗，该单抗靶向作用于肿瘤坏死区中变性、坏死细胞的细胞核，将其荷载的放射性^131I输送到实体瘤坏死部位，通过其局部放射性而对实体瘤组织细胞产生杀伤作用，达到治疗目的。我院2007年6月至12月，应用^131I肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体治疗恶性肿瘤患者8例，由于涉及到辐射防护和环境保护，在护理的过程中与常规放、化疗治疗有明显区别。现将我们的护理体会报告如下。     

注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白的耐受性

目的研究注射用重组人CTLA4-抗体融合蛋白(CTLA4-Ig,抗类风湿关节炎药)在健康志愿者体内的耐受性和安全性。方法随机选择健康志愿者27例,分别单次静脉滴注CTLA4-Ig 1、10、20 mg·kg~(-1),动态观测健康志愿者用药后的血、尿常规、血沉、心电图检查、胸片检查、血液生化检查等。结果各组受试者体检及实验室检查各项指标均在正常范围。给药后,生命体征和实验室检查均未见有临床意义的改变,试验中未见严重不良反应发生。结论单次静脉滴注rhCTLA4-Ig 1～20 mg·kg~(-1)对人体是安全的,耐受性良好。     

人源化肝癌抗体研制应用前景的分析

非手术治疗是肝癌治疗的重要方面 ,放疗与化疗由于治疗药物对肿瘤组织特异性差 ,对肿瘤外组织有很大的毒副作用 ,经放疗或化疗后的患者生活质量受到很大影响 ,甚至可能会危及生命。肝癌的生物治疗尤其是特异性抗体的针对性治疗成为人们日益关注的焦点。但是从 1975年开始研制了近 2 0年的鼠源性的抗体并不能有效的激发人类效应器的功能 ,却会引发人抗鼠抗体的形成 ,从而引起严重的副反应。DNA重组技术的应用为解决免疫导向存在的问题提供有效的技术手段。鼠单抗人源化与噬菌体人抗体库技术为肝癌治疗提供了新的方法和策略。而国内用于肿瘤治疗的单抗产品均为鼠源或人源化鼠抗体 ,人源抗体的研究还处于初期阶段 ,无相关产品问世 ,而美国FDA从 2 0 0 1年起已不再批准非人源抗体用于人体的临床试验。从发展趋势看 ,人源抗体的研制将会迅速占领市场 ,采用噬菌体抗体库技术研制人源肝癌治疗性抗体将会有良好的应用前景     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子α受体抗体融合蛋白对肺纤维化鼠干预作用的实验研究

目的探讨重组人II型肿瘤坏死因子α受体抗体融合蛋白(rhRPTN,免疫球蛋白)对肺间质纤维化鼠的干预作用。方法在给药后第7、21、28和42天,用放射免疫法检测治疗组、模型组和正常组血清中透明质酸、III型前胶原的含量以及大鼠的大体病理形态。结果大体肉眼观察大鼠肺组织的病理形态,治疗组改变较正常组和模型组轻,其透明质酸和III型前胶原含量较后2组亦低(P<0.01),有统计学意义。结论rhRPTN对肺间质纤维化的发生发展具有显著抑制作用。     

重组人转化生长因子β1原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)基因,原核表达TGF-β1蛋白,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法应用RT-PCR技术扩增人TGF-β1基因序列,构建pET-28a-TGF-β1重组质粒。转化至E.coli BL21(DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。Western-blot检测目的蛋白的抗原性。免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接ELISA法检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果获得了TGF-β1编码序列和表达载体,目的蛋白主要存在于超声破碎后的包涵体中;经Western-blot检测目的蛋白存在抗原性;获得纯化的兔抗人多克隆抗体效价达1∶10 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体效价较高,具有良好的特异性。     

抗HER-2嵌合抗体chA21对SKBR3细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用

目的探讨抗HER-2嵌合抗体chA21在体外抑制高表达HER-2的人乳腺癌SKBR3细胞增殖并诱导其凋亡的作用。方法采用MTT比色法、HE染色、透射电镜、流式细胞术(FCM)、原位末端标记技术(TUNEL)等方法观察和检测chA21对人乳腺癌SKBR3细胞增殖的抑制和凋亡的诱导。结果chA21(0.2～5.4mg.L~(-1))可抑制SKBR3细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用呈剂量和时间依赖性。结论chA21在体外可抑制SKBR3细胞的增殖,诱导其凋亡是其主要作用途径之一。     

以重组sICAM-1 Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白作抗原制备抗体建立人血清sICAM-1 RIA

目的探讨用重组可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)Ⅰ～Ⅲ功能区蛋白免疫家兔制备抗体,及用其建立人血清sICAM-1放免方法(RIA).方法对获得的抗体和建立的RIA方法学进行鉴定.测定214例正常人和38例初诊Grave's病(GD)患者的sICAM-1.结果抗体的亲和常数为1.056×108L/mol,最终稀释度为114 000.灵敏度为1.4μg/L;非特异结合＜5.0%;批内变异＜5%,批间变异＜8%;样品平均回收率为102.52%;平行实验的稀释曲线与标准曲线基本平行,参考值范围(x±2s)为(175.15±66.88)μg/L,各年龄、性别组间差别无统计学意义(P＞0.05),初诊GD患者血清sICAM-1显著高于对照组(P＜0.01).结论成功制备出抗体,用其建立了人血清sICAM-1 RIA,具有临床应用前景.     

重组人SOD工程菌发酵表达条件的优化

采用正交试验优化重组人超氧化物歧化酶工程菌的LB培养基,得到培养基最佳配比(g/L):蛋白胨12,酵母膏5,葡萄糖1和氯化钠10.以此为基础优化基因工程菌发酵条件,确定培养基初始pH 6.5～7.5,装液量20％,菌体密度(D600) 0.55～1.4,42℃诱导表达2～3h,目的蛋白相对表达量由优化前的25％提高至4...     

重组人表皮生长因子对冷冻角膜缘上皮细胞PCNA表达的影响

为探讨重组人表皮生长因子(rhEGF)的浓度对冷冻后兔角膜缘上皮细胞增殖活性的影响，采用器官培养方法和SABC免疫组织化学染色法检测角膜缘上皮细胞的PCNA表达。结果表明，器官培养1周时，冷冻角膜缘上皮细胞核中均可见PCNA表达，染色阳性细胞主要在基底细胞层。EGF组的PCNA染色阳性率显著高于无EGF组(P&;lt;0．01)；而不同浓度的EGF组之间阳性率差异无显著意义(P&;gt;0．05)。结论：在体外器官培养中，EGF能增强超低温冷冻保存的角膜缘上皮细胞PCNA的表达，但无量效依赖性。