TSG-6基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化

[目的] 探讨TSG-6基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化。[方法] 采用细胞培养和RT-PCR技术，检测细胞诱导分化不同时段脂肪细胞中TSG-6基因的表达水平。[结果] ①随着脂肪细胞逐渐分化成熟，TSG-6基因mRNA表达水平逐渐升高；②TSG-6基因表达水平除在细胞分化第0-2d、第3-5d和第7-10d各时段内差异无显著性(P＞0.05)外，其余各时段之间表达水平差异均有显著性(P＜0.05)。[结论] TSG-6基因与细胞分化以及脂原形成可能相关。     

苯乙基异硫氰酸盐对小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞过程中基因表达影响的研究

目的探讨苯乙基异硫氰酸盐(PEITC)对小鼠胚胎干细胞(mESCs)体外定向诱导分化为神经样细胞中PKCα及其相关发育基因(pax-6、netrin-1)表达的影响。方法mESCs经RA法诱导后,第7天用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因等神经细胞特异性标志物。不同浓度PEITC作用条件下,分别取诱导后1、3、5、7及14天后的细胞,用RT-PCR方法测定细胞的PKCα及其相关发育基因pax-6和netrin-1的mRNA表达情况。结果诱导后第7天,分化的神经样细胞中nestin、glutaminase、Brn-3基因均高表达。正常诱导1天后,PKCα、pax-6和netrin-1基因的mRNA表达急剧下降,3、5、7天逐渐升高,至14天恢复至正常水平。PEITC作用下,PKCα、pax-6、netrin-1的mRNA在诱导后细胞中各阶段的表达水平与正常诱导条件下相比均下降,且随着作用浓度和作用时间的增加,下降趋势明显。结论PEITC对mESCs定向分化为神经样细胞过程中相关发育基因(pax-6、netrin-1)的表达的干扰作用可能与抑制PKCα的表达有关。     

PM_(2.5)染毒干扰心肌细胞分化发育的体外实验

[目的]研究PM_(2.5)染毒对心肌细胞分化发育的影响。[方法]利用P19畸胎瘤干细胞,建立体外心肌定向分化模型,MTT法检测PM_(2.5)染毒对P19细胞毒性,PM_(2.5)染毒浓度为0、1、10、100 mg/L,选择未产生明显细胞毒性的10 mg/L PM_(2.5)于P19细胞未分化时期染毒48 h后启动分化。显微镜下观察形态学改变,实时荧光定量PCR检测不同分化期OCT4、ISL-1、MLC2V的表达变化(OCT4、ISL-1、MLC2V分别为干细胞全能性阶段、心肌前体期、成熟心肌期标志基因),免疫荧光及流式细胞术检测成熟心肌肌钙蛋白cTNT的表达效率。[结果]与对照组相比,PM_(2.5)组细胞形态学发生改变;分化各阶段的标志物表达异常:OCT4在未分化时期表达降低约80%(P0.01),分化启动后反而增高(P0.05);ISL-1于心肌前体期表达降低为对照组的59%(P0.01);MLC2V于成熟细胞期表达降低为对照组的39%(P0.01)。成熟心肌cTNT表达比例由对照组的61%下降到47%,但差异无统计学意义。[结论]心肌分化早期染毒PM_(2.5),可阻碍干细胞向心肌细胞的分化过程。     

辛伐他汀对人骨髓基质细胞成骨、成脂分化的作用及其机制

[目的]研究辛伐他汀对体外培养的成人骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化的影响,并探讨其作用机制。[方法]分离健康成人骨髓基质细胞进行培养,传代后骨分化诱导组和脂肪分化诱导组分别添加10-7mol/L的辛伐他汀,同时进行空白对照。实时荧光定量PCR检测转录因子Cbfa1在成骨细胞中的分化,PPARγ2和LPL在脂肪细胞分化过程中的表达;碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测成骨细胞ALP比活性;流式细胞仪、油红O(oilredO)染色检测细胞成脂分化能力。[结果]骨分化诱导组Cbfa1表达(P﹤0.01)、ALP比活性(P﹤0.05)均高于对照组,脂肪分化诱导组PPARγ2(P﹤0.01)、LPL(P﹤0.05)表达均低于对照组;流式细胞仪脂肪细胞计数及脂肪细胞形成脂滴能力实验组均低于对照组。[结论]10-7mol/L辛伐他汀能促进Cbfa1的表达,增强成骨细胞ALP比活性和细胞外基质矿化;抑制PPARγ2、LPL的表达及脂肪细胞分化。     

体外诱导胚胎干细胞分化为神经细胞特性的实验研究

目的研究体外利用全反视黄酸(RA)诱导小鼠胚胎干细胞(mESC)分化为神经细胞的培养方法。方法悬滴3天转悬浮1天两者结合的培养方法得到胚体(EBs),再利用RA对其处理4天后,进行免疫组织化学、RT-PCR以及兴奋性功能的检测,观察神经细胞获得的效率及其生理特性。结果利用RA诱导方法得到的神经细胞,免疫组化表明nestin蛋白表达的阳性率为(53.49±6.02)%,且RT-PCR法分析其能表达nestin、glutaminase和Brn-3等神经细胞特异基因,同时在Glu刺激下具有与脑来源神经元相似的特性和功能。结论利用本实验诱导方法,获得神经细胞的比例较高,且具有与神经元相似的生物学特性。     

胚胎干细胞在心肌样环境中向心肌样细胞的分化情况

目的探讨心肌细胞促进胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)分化为心肌样细胞的诱导作用。方法收集小鼠3.5d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3d的拟胚体(embryoid bodies,EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、а-肌动蛋白(а-Actin)的表达。结果诱导d3起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12d时共培养组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于对照组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、а-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,分化的细胞形态较单一。结论心肌细胞与胚胎干细胞直接接触能促进胚胎干细胞向心肌细胞分化。     

MAPK8基因在小鼠源性3T3-Ll脂肪细胞诱导分化中表达水平的变化

[目的]观察小鼠源性3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中MAPK8基因表达水平的变化,探讨MAPK8基因与肥胖发生之间的关系.[方法]体外培养3T3-L1前体脂肪细胞,在诱导3T3-L1脂肪细胞分化成熟的不同时段,采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中MAPK8基因的mRNA表达水平.[结果]MAPK8基因高表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,随细胞分化成熟该基因表达水平逐渐下调.MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至第4 d、第2～5 d、第6～10 d时段内差异无显著性外,其余各时段间差异均有显著性(P＜0.05).[结论]MAPK8基因与肥胖发生有关,在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚.     

体外诱导兔胚胎干细胞分化为神经细胞

目的:探讨体外诱导兔胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的方法。方法:应用多种诱导剂联合诱导兔ESCs,免疫荧光和流式细胞仪检测巢蛋白(Nestin)的表达。结果:诱导后兔ESCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,Nestin阳性表达。结论:在体外采用定向分化诱导,兔ESCs可直接定向分化为神经干细胞。     

人胚胎干细胞向肝脏样细胞诱导分化中限定性内胚层分化的研究进展

胚胎干细胞(ESC)是来源于囊胚内细胞团的一种高度未分化细胞,具有无限增殖和发育全能性等特点,可自发分化为多种细胞类型,如神经细胞、肝脏细胞、胰腺细胞和心肌细胞等.在之前的诱导分化方案中,主要通过ESC形成拟胚体后,再进一步进行各种细胞的诱导分化,诱导分化效率较低.目前的研究表明,直接添加诱导因子能够使ESC直接分化成限定性内胚层,并在此基础上进一步诱导分化形成肝脏细胞,从而显著提高向肝脏细胞的诱导分化效率.通过鉴定限定性内胚层的表面标记因子SOX17和FOX2来评定限定性内胚层的诱导分化效率.但是,何种诱导因子的组合诱导分化效率最高并最接近人胚胎正常发育过程并不十分明确.     

NGF对大鼠胚胎脊髓神经细胞分化和增殖作用

[目的]研究神经生长因子(NGF)对大鼠胚胎脊髓神经细胞分化和增殖的作用。[方法]加入NGF到大鼠胚胎脊髓神经细胞进行培养,显微镜下计数存活脊髓神经细胞集落数及测定细胞相对蛋白质的含量。[结果]脊髓神经细胞胞体增大、突起延长且有丰富的神经纤维连结成网络状,细胞集落数增加,细胞相对蛋白质含量增加,显示出剂量—效应关系。[结论]一定剂量的NGF能促进大鼠脊髓神经细胞分化和增殖,增强其活性。     

KL-6粘蛋白和E-钙粘蛋白在大肠癌组织中的表达及其临床意义

目的研究KL-6粘蛋白和E-钙粘蛋白在结直肠癌中的表达和其对应的临床病理之间相互关系及KL-6粘蛋白作用机制。方法于手术中收集大肠癌组织与癌旁组织各60例（所有手术患者在术前均未进行全身化疗、放疗及其他治疗）,采用逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测大肠癌组织及癌旁组织中KL-6粘蛋白与E-钙粘蛋白的RNA表达水平的变化。结果 1RT-PCR法检测结果显示,大肠癌组织中KL-6粘蛋白的表达明显高于癌旁正常组织,而E-钙粘蛋白表达明显低于癌旁正常组织,差异均有统计学意义（P〈0.05）。KL-6粘蛋白和E-钙粘蛋白RNA的表达与性别、年龄、临床TNM分期无关,差异无统计学意义（P〉0.05）;但与不同肿瘤的分化程度以及有无淋巴结转移有关,且差异有统计学意义（P〈0.05）。2相关性分析显示,KL-6粘蛋白和E-钙粘蛋白在大肠癌中的表达呈显著负相关（P〈0.05）。结论 1KL-6粘蛋白和E-钙粘蛋白的表达异常在大肠癌的发生、发展中起重要作用,KL-6粘蛋白和E-钙粘蛋白的表达与大肠癌的分化程度及淋巴结转移情况有相关性;联合检测两者在大肠癌中的表达可能有助于恶性程度的评估与预后判断。2KL-6粘蛋白其发挥作用的作用机制可能与其抗粘附作用以及Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关。     

铅对小鼠肝脏超氧化物歧化酶活性及CuZn-SOD mRNA表达的影响

[目的]以醋酸铅染毒小鼠为模型,研究铅对肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性及CuZn-SODmRNA表达的影响。[方法]分别以浓度为0、0.1%、0.2%、0.4%醋酸铅喂养小鼠。6周后取肝脏,试剂盒测定SOD活性;RT-PCR法测定CuZn-SODmRNA表达水平。[结果]与对照组比较,染毒组SOD活性明显下降(P﹤0.01),CuZn-SODmRNA表达显著下调(P﹤0.01),且两指标均存在剂量-效应关系(r=0.901,P﹤0.01)。[结论]铅可致小鼠肝脏SOD活性下降,CuZn-SODmRNA表达下调,两者存在良好效应关系,呈正相关。     

大肠癌患者外周血中CK19、CK20基因表达的检测及临床意义

[目的]探讨细胞角蛋白19(CK19)、细胞角蛋白20(CK20)在正常对照组和大肠癌患者外周血中表达情况及其临床意义。[方法]采用RT-PCR方法检测正常对照组和大肠癌患者外周血中CK19、CK20mRNA表达。[结果]CK19、CK20mRNA在正常对照组中均无表达,在大肠癌中患者中阳性率分别为31.7%、41.3%,且CK19、CK20mR-NA阳性表达率与患者性别、年龄、细胞分化程度无明显相关,而与Dukes分期及淋巴结转移有明显的相关性(P<0.05)。[结论]大肠癌患者外周血中CK19、CK20随Dukes分期的增加而表达率增加,可作为预测肿瘤细胞转移的评估指标。     

顺铂对A549细胞DNA修复酶MGMT和DNA-PKcs表达的影响

[目的]探讨在DNA损伤剂顺铂作用下，A549细胞内DNA修复基因六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖的蛋白激酶复合物催化亚单位(DNA-PKcs)的表达变化。[方法]MTT法分析顺铂对A549细胞生存力的影响；彗星实验研究顺铂对DNA损伤的程度；RT-PCR分析不同顺铂作用时问修复酶mRNA水平的变化。[结果]顺铂对A549细胞的生长有明显的抑制作用，且为剂量依赖性。低浓度(IC20剂量)顺铂作用下，DNA损伤程度的变化与作用时间成正比，且伴随MGMT和DNA-PKcs的表达上升。停止作用后，DNA损伤程度减轻，修复基因的表达也逐渐恢复至正常水平。[结论]短期顺铂染毒所导致的急性DNA损伤对MGMT和DNA-PKcs的表达有明显的正性诱导作用。     

家兔pEGFP-N1/rCNP质粒的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

[目的]构建真核表达载体pEGFP-N1/rCNP并转染体外培养的人脐静脉内皮细胞,观察CNP基因在其中的表达。[方法]利用RT-PCR方法从家兔腹主动脉组织扩增获得CNP基因全场全长编码区,克隆到含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组载体pEGFP-N1/rCNP。利用LipofectaminTM 2000脂质体将重组质粒转染人脐静脉内皮细胞。[结果]重组质粒pEGFP-N1/rCNP构建成功;将其转染人脐静脉内皮细胞,观察到目的基因CNP表达。[结论]成功构建了家兔腹主动脉CNP基因的真核表达载体pEGFP-N1/rCNP,并可转染人脐静脉内皮细胞。     

体外诱导成人脂肪干细胞向心肌细胞分化的研究

目的 诱导成人脂肪干细胞（ADMSCs）分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源.方法 培养人脂肪来源的间充质干细胞,采用10 μmol/L的5-氮杂胞苷（5-Aza）诱导ADM-SCs 24 h,分别在第7、14、21天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌肌动蛋白、MHC表达,PT-PCR法检测心肌相关基因心房钠尿肽（ANP）的表达.结果 10μmol/L 5-Aza诱导后7 d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌和MHC表达.14 d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,21 d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并且RT-PCR结果显示ANP呈阳性表达.结论 经过5-Aza的诱导可以分化为心肌细胞,为心肌再生提供了更多的选择.     

甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

[目的]构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体,并在293T细胞中表达.[方法]采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒H1N1毒株提取的病毒总RNA中,扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达.[结果]酶切、测序证明重组真核表达载体PXJ40-HA-NS1构建成功,免疫印迹法可见NS1基因编码蛋白表达.[结论]成功构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体PXJ40-HA-NS1,并在293T细胞中传染表达,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料.     

裙带菜多糖对人食管癌细胞TE-13生长抑制作用的研究

[目的]观察裙带菜多糖(PUP)对食管癌细胞TE-13的生长抑制作用,探讨其诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的机制。[方法]以食管癌细胞TE-13作为研究对象,MTT法检测PUP对其增殖的抑制作用;在电子透镜下观察PUP对TE-13超微凋亡结构的影响;流式细胞技术检测其周期分布和凋亡率;RT-PCR法检测PUP对TE-13细胞中凋亡相关基因Survivin表达的影响。[结果]PUP对食管癌细胞TE-13有显著增殖抑制效应,作用时间越长,在一定范围内的PUP浓度越大,抑制效应越强。PUP作用48h时半数抑制浓度(IC50)为52.17μg/ml。25、50、100μg/ml的PUP作用48h后,TE-13均发生凋亡形态的变化;100μg/ml PUP处理72h后,凋亡率为52.19%;周期分布显示G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少。RT-PCR结果显示PUP能降低食管癌细胞中Survivin mRNA的表达。[结论]PUP在体外显著抑制食管癌细胞TE-13的增殖,其机制与PUP诱导食管癌周期阻滞和下调Survivin mRNA的表达有关。     

端粒和端粒酶相互作用蛋白在真核细胞中的表达

目的从人肝癌细胞系HepG2中获得PinX1基因,构建真核表达载体,转染Hek293细胞。方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增PinX1,克隆入真核表达载体pcDNA3,重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化法检测蛋白的表达。结果RT-PCR方法扩增获得PinX1基因,构建真核表达载体pcDNA3-PinXl-vsv重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化检测结果表明在细胞核内有PinX1表达。结论成功获得PinX1基因,构建的重组载体可在Hek293细胞内表达,为探索PinX1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础。