球药隔重楼HMGR功能基因保守区序列的克隆与分析

目的 研究球药隔重楼次生代谢产物甾体皂苷甲羟戊酸合成途径的一个关键酶即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）的基因，有助于对活性物质的合成进行调控，从而提高产量。方法 比较NCBI上公布的11种植物11条HMGR基因mRNA的同源保守区域，设计简并引物，利用RT-PCR技术，以球药隔重楼新鲜茎总RNA反转录的cDNA为模板成功扩增出404 bp的保守区基因片段。结果 序列分析表明，球药隔重楼HMGR基因片段与其他7种植物的一致性达到76%～81%，球药隔重楼HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性，经Genbank查询为一新的cDNA。结论 通过蛋白质特征区、保守区以及进化树分析，初步确定该基因为HMGR基因，这是首次从药用植物球药隔重楼中克隆得到甲羟戊酸途径关键酶HMGR的基因片段，也是百合科植物首次获得的HMGR基因。     

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的 克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列,对比不同毒力弓形虫株(PRU、RH、ME49)中SAG2C基因序列,进行生物信息学分析.方法 根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从Prugniaud(PRU)株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因,克隆入pMD19-T载体并进行序列测定.应用DNAMAN软件、NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性;利用生物信息学网站ExPASy(http://us.expasy.org/)对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析.结果 PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列,酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒,测序结果表明,获得SAG2C基因序列1 225 bp,全长cDNA序列1 095 bp.编码364个氨基酸.同源性分析显示,弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97.14%:Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96.89%;编码氨基酸序列同源性为92%.N端为信号肽,C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白,存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域.结论 成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列,序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白.     

红鲫Sox4基因保守区的克隆与序列分析

目的 为进一步全面理解鱼类Sox基因的复制与进化,从红鲫基因组DNA中克隆Sox基因HMG盒保守区.方法 参照Sox基因HMG盒保守区的氨基酸序列设计一对兼并引物,以红鲫基因组DNA为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行亚克隆和测序.结果 获得2个序列(序列Ⅰ和序列Ⅱ).同源性比较显示,序列Ⅰ和序列Ⅱ编码的氨基酸序列均与小鼠Sox4的同源性最高,分别为88.9%和90.7%;氨基酸序列排序比较,序列Ⅰ和序列Ⅱ也都与人Sox4的同源性最高.结果表明,红鲫序列Ⅰ和序列Ⅱ均是小鼠、人Sox4基因的直向同源基因,分别命名为RcSox4-1和RcSox4-2.结论 Sox4基因在红鲫进化过程中发生了基因复制,Sox4基因复制可能发生在红鲫、斑马鱼及草鱼分化之前.     

大鼠β-防御素rBD-2的分子克隆及其在皮肤组织的诱导表达

从大鼠皮肤提取总RNA, 以P1 5′→3′TTCAGTCATGAGGATCCATTAC和P2 5′→3′ GGTTCTTGGTCTTTTTATCTAC引物,采用RT-PCR技术扩增得到一cDNA片段,经核苷酸序列测定,并根据其推导的氨基酸序列与人β-防御素-2和大鼠β-防御素-1进行同源性比较,结果显示,该cDNA片段编码的氨基酸序列具高度同源性(其成熟肽与hBD-2的同一性为50%,相似性为32%),均含6个典型的半胱氨酸,这表明所克隆的cDNA为大鼠β-防御素-2亚类,因此命名为rBD-2.大鼠β-防御素-2基因在大肠杆菌感染性损伤皮肤组织中的表达明显增强,与人hBD-2的表达相似,能够被诱导表达.以上结果提示,β-防御素-2可能是皮肤组织对感染性损伤的防御反应所产生的重要免疫介质.     

三七法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析

目的对三七法呢基焦磷酸合酶(FPS)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增法,以三七根总RNA为模板扩增出三七FPS基因。结果序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长1 409 bp,开放阅读框共编码343个氨基酸残基,推测的氨基酸序列与积雪草、灰白银胶菊、黄花蒿的FPS的氨基酸序列同源性最高,分别达95%、87%、86%。结论首次分离并报道了三七FPS cDNA克隆,为进一步研究三萜皂苷生物合成机制及其在提高植物药用价值方面的应用奠定基础。     

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段，获得其序列，并进行序列分析。方法：利用简并引物，进行RT-PCR，扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm-T载体，进行鉴定、测序；利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列，并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果：RT-PCR扩增出了-500bp左右的cDNA片段，对阳性克隆测序后获得其核酸序列，长498bp。推导出的氨基酸序列长166；氨基酸序列的同源性分析显示，该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性，组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论：本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱近酸蛋白酶cDNA片段。     

马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆、测序及同源性分析

【目的】从中草药马兜铃中获得酪氨酸脱羧酶基因(tyrDC)互补DNA(cDNA)序列并进行同源性分析，以进一步达到敲除tyrDC，减轻该药肾毒性的目的。【方法】参照已知的植物酪氨酸脱羧酶的保守性氨基酸序列设计简并引物，并通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从马兜铃中扩增出cDNA片段。将扩增的cDNA序列克隆并测序，用以设计特异引物，并通过cDNA末端快速扩增(Rapid Ampli6cation of cDNA Ends，RACE)从马兜铃中扩增出全长tyrDC cCNA。【结果】该克隆的tyrDC cDNA的总长度为1678bp，包括一个编码516个氨基酸的1551bp开读框(ORF)和一段127bp的下游非翻译区(3’UTR)。序列比较结果表明，由马兜铃tyrDC核苷酸序列推导的氨基酸序列分别与已发布的罂粟酪氨酸脱羧酶和唐松草酪氨酸／多巴脱羧酶享有76％和79％的同源性。【结论】从马兜铃中扩增得到tyrDC cDNA全序列，且对酪氨酸脱羧酶的同源检索显示，不同植物的酪氨酸脱羧酶之间都存在普遍的序列相似性。为去除马兜铃肾毒性奠定了基础。     

狭叶松果菊 3-脱氢奎尼酸合成酶基因 cDNA 的克隆及其组织表达特征

目的 克隆狭叶松果菊 〖WTBX〗Echinacea angustifolia 3-脱氢奎尼酸合成酶基因并考察其在各个组织中的表达情况。方法 采用快速扩增 cDNA 末端技术,以狭叶松果菊组培苗 cDNA 为模板,克隆出狭叶松果菊 3-脱氢奎尼酸合成酶基因全长序列并通过半定量 RT-PCR 分析其在不同器官中的表达模式。结果 克隆到的基因 (命名为EanaroB) 全长为 1 424 bp,编码一个 442 个氨基酸残基组成的多肽。其氨基酸序列与植物来源的 3-脱氢奎尼酸合成酶同源性都在 80% 左右。将得到的序列提交 Genbank,序列号为EU293857。半定量 RT-PCR 结果表明,狭叶松果菊EanaroB 基因在狭叶松果菊的根、茎、叶、花中均有表达,但花和叶中的表达量较高,在根和茎中较少。结论 采用 RACE 和 PCR 的方法从狭叶松果菊中克隆出了咖啡酸类化合物生物合成途径上的一个基因 EanaroB,为进一步研究咖啡酸类衍生物生物合成代谢途径提供一定依据,为今后利用基因工程技术提高咖啡酸类衍生物,包括苯乙醇苷类物质松果菊苷的代谢工程打下一定基础。     

白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因分子进化机制初探

为了初步探讨白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6家族新基因分子进化机理,根据已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株一新的细胞色素P450CYP6基因cDNA片段,设计反向引物,进行5’-cDNA末端快速扩增（rapid　amplification　of　cDNA　ends,RACE）;以正向引物进行3’-RACE。然后分别进行克隆、测序和鉴定。根据获得白纹伊蚊CYP6家族新成员全长cDNA序列,运用PC/GENE软件分析其5’-UTP区DNA序列相似性及编码区氨基酸残基相似性、构建系谱树。结果获得的3个全长序列中5’-UTP区DNA序列完全相同;编码区氨基酸残基相似性为3/497或4/497个氨基酸差异,而且此种差异均位于蛋白质功能非保守的基因区域;构建的系谱树显示CYP6N3基因与冈比亚按蚊CYP6N1-2亲缘关系最近,而与致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1亲缘关系较远。说明白纹伊蚊CYP6N3基因较致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1基因更为古老;白纹伊蚊CYP6N3各等位基因变异体是通过整个CYP6N3基因座的新近复制而产生。     

建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析

目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶（squalene synthase,SS）进行基因全长的克隆和生物信息学分析。方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究。结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1 577 bp,包含一个长1 230 bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性。预测该蛋白的相对分子质量为4.68×10⁴,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸（DXXDD）的保守功能域。结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据。     

用RAPD技术评估苍术居群间的亲缘关系

用ＲＡＰＤ方法分析了苍术不同居群间的亲缘关系。选取１０个１０碱基的随机引物对苍术的１０个居群共８３个个体进行扩增,获得了１００个ＤＮＡ片断。用ＲＰＡＰＤｉｓｔａｎｃｅ软件计算了不同居群间的Ｊａｃｃａｒｄ遗传距离,得距离矩阵,分别用单联法、全联法、类平均法作聚类图,结果表明,该１０个居群可划分为３个类群：即类群１,大别山类群;类群２,南苍术类群（Ｗｕ,Ｌｕ,Ｈｕ,Ｘｕ,Ｃａ,Ｌｉ＿）;类群３,北苍术     

当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

罗汉果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析

目的 对罗汉果甜苷V生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS）基因的全长cDNA序列进行克隆,为研究罗汉果甜苷V生物合成与基因调控奠定基础。方法 根据植物FPPS基因保守功能域设计简并引物,通过PCR和RACE方法克隆罗汉果FPPS基因的全长cDNA。结果 获得罗汉果FPPS（SgFPPS）基因的全长cDNA序列共1 354个核苷酸,包含一个1 026核苷酸的开放阅读框架（open reading frame, ORF）,cDNA编码的蛋白包含342个氨基酸,推断蛋白质相对分子质量为3.92×10⁴。NCBI Blastx结果显示,SgFPPS基因编码的蛋白与苹果树来源FPPS具有最高同源性,氨基酸一致度达85.1%。SgFPPS具有异戊烯基转移酶的5个典型保守功能域。进化树分析结果显示,SgFPPS基因与苹果树的FPPS具有较近的亲缘关系。结论 首次克隆SgFPPS基因的全长cDNA序列,为分析SgFPPS基因表达特性及其在罗汉果甜苷V生物合成中的功能奠定基础。     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的：发现并克隆缺血再灌可诱导基因,方法：应用mRNA差异显示技术,在猪的心肌组织,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段,随后筛选狸心脏cDNA文库,经克隆,测序,杂交后,分析克隆基因的基本特性,结果：发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段,通过筛选cDNA文库获得一个编码608个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因,蛋白质氨基酸均无同源性,Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高,并且在正常猪的心,肝,肺,肾,脾,肠,脑和骨骼肌组织均可检测到其表达,Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性,结论：克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

缺血再灌可诱导新基因的克隆及其基本特性

目的 :发现并克隆缺血再灌可诱导基因。方法 :应用mRNA差异显示技术 ,在猪的心肌组织 ,分离缺血再灌可诱导基因的cDNA片段 ,随后筛选猪心脏cDNA文库。经克隆、测序、杂交后 ,分析克隆基因的基本特性。结果 :发现和分离到一个缺血再灌上调基因的cDNA片段 ,通过筛选cDNA文库获得一个编码 6 0 8个氨基酸开放式阅读框架的阳性克隆子。序列分析显示该克隆子的DNA和氨基酸序列与已知基因、蛋白质氨基酸均无同源性。Northern杂交分析显示该基因在缺血再灌猪心肌组织的表达明显增高 ,并且在正常猪的心、肝、肺、肾、脾、肠、脑和骨骼肌组织均可检测到其表达。Southern杂交分析显示该基因具有高度的进化保守性。结论 :克隆的基因为缺血再灌可诱导新基因 ,它在缺血再灌的应答中可能起着重要的作用。     

梅花鹿两个管家基因部分 cDNA序列的克隆

目的 :开发吉林双阳梅花鹿的基因资源 ,在分子水平上揭示鹿药材的药理作用。方法 :从鹿脾脏细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA,构建 c DNA质粒文库 ,从中克隆 2个管家基因并进行序列分析。结果 :成功克隆的管家基因的一个核酸序列及其对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠蛋白酶体 α3型亚单位 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源 ;另一个管家基因的序列及对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠转录激活因子 - 4部分 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源。结论 :新发现的双阳梅花鹿蛋白酶体α3型亚单位部分 c DNA序列和转录激活因子 - 4部分c DNA序列 ,已在 Genbank中登录 ( BG67371 3,BG67371 4 )。     

简并引物在克隆盐藻热休克蛋白70基因家族中的应用

目的：利用简并引物扩增盐藻热休克蛋白70(hsp70)家族。方法：根据衣藻、矮牵牛花等真核生物hsp70氨基酸高度保守序列didlgtt，dqgnrttp，payfnds和ATKDAG设计2对简并引物，以盐藻hsp70 cDNA为模板进行巢式PCR扩增，产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中，经筛选后测序，将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果：得到2个分别为372bp和354bp编码126及118个氨基酸残基的部分cDNA片段。推导的氨基酸序列与衣藻、矮牵牛花、番茄、果蝇和酵母hsp70和hsp70b比较有高度同源性。结论：所克隆的序列为盐藻hsp70和hsp70b部分cDNA片段。利用简并引物筛选cDNA文库是克隆基因家族重要的方法。