PNH患者骨髓红系祖细胞体外培养的研究

采用造血祖细胞体外培养技术研究了阵发性睡眠性血红蛋白尿症（ＰＮＨ）患者骨髓红系祖细胞（ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ）的增殖能力；骨髓细胞经新鲜酸化ＡＢ型血清处理后培养的ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ的增殖能力；以及ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ对红细胞生成素（Ｅｐｏ）的反应能力。发现ＰＮＨ患者骨髓ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ集落数明显低于正常；骨髓细胞经新鲜酸化ＡＢ型血清处理后培养的ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ集落数明显低于经热灭活酸化ＡＢ型血清处理后培养的集落数；ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｅ对Ｅｐｏ的反应回归直线呈低平状态。认为ＰＮＨ患者骨髓红系祖细胞膜缺陷可导致其在酸性条件下对补体的敏感性增高和导致其对Ｅｐｏ的敏感性降低。     

人骨髓巨核系祖细胞(CFU-M)体外半固体培养的方法探讨

为了探索一种较理想的人骨髓巨核系祖细胞CFU-M的体外半固体培养方法,本文对血浆凝块法和甲基纤维素法进行比较,证实血浆凝块法培养的CFU-M开始出现于第5天,集落高峰在第10～12天,消失于第16天。甲基纤维素法CFU-M开始出现于第5～6天,集落高峰在第14～16天,集落消失在20天以后。前者集落呈弥散状或紧密状不一,可原位固定染色计数,标本易保存;后者集落呈紧密状,不能原位固定,可在倒置镜下根据细胞形状计数,或吸出细胞涂片染色,培养皿不能保存。当两种培养体系中加入相同的条件培养基时,CFU-M数无显著性差别。本文还介绍一种改良的血浆凝块法,该方法以PHA-LCM为条件培养基,并用抗血小板糖蛋白单抗和ABC染色法来鉴别生长的巨核细胞。此法集落产率高,鉴别指标客观特异,不需要荧光显微镜。14例正常骨髓标本的CFU-M的产率为136.4～42.5/5×10_5((?)±SD)。当培养体系中加入不同的条件培养基CFU-M的产率不同,其中以PHA-TCM所得CFU-M数最高。本文结果提示:用PHA-TCM作条件培养基的血浆凝块法结合用抗血小板GPⅡa单抗的ABC染色,是研究CFU-M体外增殖分化和探讨血小板性疾病发病机制的理想方法。     

人脐血红系祖细胞体外培养观察

<正>脐血代替骨髓移植重建造血的成功,已引起人们对脐血造血功能研究的兴趣。笔者等曾在国内首先报告了脐血粒—单核系祖细胞(CFU-GM)体外培养观察,证实人脐血富含粒单核细胞系造血干/祖细胞。通过进一步以体外甲基纤维素法培养人脐血的红系祖细胞,包括红系集落形成单位(CFU-E)和爆式红系形成单位(BFU-E),笔者观察了人脐血红系祖细胞造血情况,现将结果报告如下。     

人脐血前红系祖细胞(BFU-E)体外培养的动态观察

<正> 脐血含各系造血干/祖细胞和多种造血集落刺激因子,是继骨髓、外周血、胎肝之后第4个新开发的、可移植的造血干细胞来源;还可静脉输注,用于一切放化疗后血细胞减少的病人、刺激造血功能,从而扩大了血源供应。笔者通过对37份人脐血和11份正常骨髓的BFU-E体外培养观察,再次证明脐血含有丰富的造血干细胞,并对脐血红系定向祖细胞的2个亚群(CFU-E、BFU-E)进行了动态观察,结果报告如下。     

骨髓增生异常综合征骨髓原始细胞祖细胞体外培养

以植物血凝素－白细胞条件培养液（ＰＨＡ－ＬＣＭ）作为刺激源，研究确定了白血病原始细胞祖细胞（ＢＣＰ）体外培养方法的一些细节。用此方法观察了骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）患者去除Ｔ细胞和粘附细胞的骨髓单个核细胞中ＢＣＰ体外生长情况。２７例ＭＤＳ中１０例（３７％）有原始细胞集落（ＢＣＣ）生长。ＢＣＣ阳性率和产率与ＦＡＢ亚型之间有一定的相关性；阳性率并与姐妹染色单体分化（ＳＣＤ）显著相关。对照组中无一例有ＢＣＣ生长。本文结果表明ＢＣＰ能够反映ＭＤＳ的恶性细胞克隆；ＢＣＣ是评估ＭＤＳ病期的重要生物学指标。     

高危出血尿毒症患者的血液透析(摘要)

对12例使用肝素有出血危险的尿毒症患者进行了63例次血透。9例60例次按 Gotch 简化肝素动力学模型行低剂量肝素化血透,维持透析中活化全血凝固时间(ACT)在150～180秒。其中慢性肾衰(CRF)并发心包炎5例54例次;CRF 伴消化道出血1例2例次;升汞中毒急性肾衰(ARF)伴消化道出血1例2例次;移植肾滴     

正常人骨髓红系集落的琼脂培养

培养正常人造血组织的红系集落惯用甲基纤维素(MC)或血浆凝块法。用MC的主要弊端是不能制备用于细胞学或细胞化学分析的永久性标本。本研究的基本目的是:确定琼脂是否象MC一样有效地支持正常人红系细胞的体外生长,其次是通过缩小培养体系来节省红细胞生成素(Epo)。 MC培养依据Guilbert和Iscove的方法。其培养体系为:含终浓度30%的胎牛血清(FBS)的Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)。Epo的终浓度为2u/ml,细胞浓度为2×10~5/ml。全部实验用同一批     

在体外再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征骨髓红系干细胞(CFU-E和BFU-E)对重组人红细胞生成素的反应

再生障碍性贫血(AA)23例中,重型9例,非重型14例;14例骨髓增生异常综合征(MDS)中,难治性贫血(RA)6例,难治性贫血伴环铁粒幼细胞(RAS)1例,难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)6例,转化型难治性贫血伴原始细胞过多(RAEB-T)1例。结果显     

特发性血小板减少性紫癜患者骨髓巨核祖细胞体外培养及其临床意义

目的探讨特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者的骨髓巨核祖细胞体外培养集落形成能力及临床意义.方法用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术(APAAP)检测ITP患者的外周血T淋巴细胞亚群的表达;采用胶原半固体培养法,对33例ITP及12例正常人行骨髓巨核祖细胞培养.结果 ITP组巨核祖细胞集落数与对照组差异无显著性(P>0.05);ITP中骨髓巨核细胞(MK)增高组(23/33)的CFU、BFU及总集落数与对照组比较,差异无显著性(P>0.05),而MK不增高组(10/33)CFU、总集落数显著低于对照组(P<0.05);CD4+/CD8+比值减低组较对照组CFU-MK及总集落数明显减低.结论 ITP患者巨核祖细胞培养集落数可正常或减少,可能与免疫异常有关.巨核祖细胞体外培养对ITP患者治疗方案的选择具有一定的指导意义.     

特发性血小板减少性紫癜患者骨髓巨核祖细胞体外培养及其临床意义

目的　探讨特发性血小板减少性紫癜 (ITP)患者的骨髓巨核祖细胞体外培养集落形成能力及临床意义。方法　用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标技术 (APAAP)检测ITP患者的外周血T淋巴细胞亚群的表达 ;采用胶原半固体培养法 ,对 33例ITP及 12例正常人行骨髓巨核祖细胞培养。结果　ITP组巨核祖细胞集落数与对照组差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;ITP中骨髓巨核细胞 (MK)增高组 (2 3/33)的CFU、BFU及总集落数与对照组比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,而MK不增高组 (10 /33)CFU、总集落数显著低于对照组 (P <0 .0 5 ) ;CD4 /CD8 比值减低组较对照组CFU MK及总集落数明显减低。结论　ITP患者巨核祖细胞培养集落数可正常或减少 ,可能与免疫异常有关。巨核祖细胞体外培养对ITP患者治疗方案的选择具有一定的指导意义     

人诱导多能干细胞体外扩增生成红系集落并构建红系祖细胞株的研究

目的将人诱导多能干细胞(hi PSCs)分化成为红系祖细胞并构建稳定的红系祖细胞株。方法采用与滋养层细胞共培养的方式,添加10 ng/m L的TPO、5 U/m L的EPO、25 ng/m L的SCF、5 ng/m L的Flt-3、20 ng/m L的IL-3的诱导因子,诱导hi PSCs分化成为红系集落,构建稳定的红系祖细胞株;倒置显微镜观察获得的细胞株形态,瑞氏染色并计数,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞表面标志物。结果 hi PSCs诱导构建的红系祖细胞株遗传性状稳定并可长期传代,细胞呈集落样生长,外观上与正常红系祖细胞无差异。分类计数构建的红系祖细胞株比例(%):P0与P5代细胞为84.90±4.93 vs 72.20±6.24(P0.05);流式检测,hi PSCs诱导构建的红系祖细胞株细胞表面标志物CD235a阳性率(%)表达:P0与P5代细胞为3.02±0.75 vs 5.87±0.37(P0.05)。结论诱导hi PSCs生成的红系祖细胞株在表面标志继承性和遗传性状方面都是稳定的。     

体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞及其生物学特性鉴定

背景:现阶段急需建立一种稳定的体外分离培养内皮祖细胞的方法,骨髓中内皮祖细胞的含量丰富,增殖能力强,而且容易获得,操作简单.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓内皮祖细胞,并对其生物学特性进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-08/12在重庆医科大学附属第一医院中心实验室完成.材料:清洁级2周龄SD大鼠20只,由重庆医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,用预冷至4℃的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔,以密度梯度离心法收集单个核细胞层,含体积分数为20%胎牛血清的M199培养液重悬细胞,制成单细胞悬液后进行细胞计数,按1×109L-1浓度接种到预先用纤维连接蛋白包被的培养瓶中,37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞形态变化,免疫细胞化学检测内皮祖细胞表面特异性抗原CD133、内皮祖细胞表面抗原CD34和血管内皮生长因子受体KDR的表达,并进行流式细胞仪定量分析和细胞生长曲线分析.结果:新分离获得的骨髓单个核细胞为小圆形,培养4 d后贴壁细胞呈"集落"样生长,中间为圆形贴壁细胞,外周梭形细胞较多,传代后梭形细胞首尾相连,呈"毛细血管"样排列.培养第4,7,10,14天贴壁细胞CD34,KDR,CD133均呈阳性表达,CD133阳性细胞第10天时开始减少.流式细胞仪检测结果显示,CD133/KDR双阳性细胞率逐渐升高,10 d时达峰值,随后下降.KDR阳性细胞率随培养时间的延长而逐渐升高.原代细胞生长曲线显示细胞在第3～6天处于指数生长期,贴壁细胞大量增殖,呈"集落"样生长.结论:采用密度梯度离心法可成功从SD大鼠骨髓中分离获得内皮祖细胞,加入M199培养液后能够贴壁增殖,并可以分化为内皮细胞.     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低.实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法.方法:实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成.①实验材料:2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133, 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达.结果:①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长.培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观.2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长.②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达.结论:采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增.     

体外扩增法分离培养兔骨髓来源的血管内皮祖细胞

背景:体外扩增法培养血管内皮祖细胞操作简便、费用低廉是实验中获取内皮祖细胞的主要方法。目的:拟从兔的骨髓中通过体外扩增法分离培养出血管内皮祖细胞,为进一步观察自体血管内皮祖细胞移植促进血管内皮的修复提供细胞学基础。设计、时间及地点:开放性实验,于2005-03/2006-02在解放军第二军医大学长征医院内科实验室完成。材料:6~8月龄新西兰大白兔8只,雌雄不拘,体质量(2.5±0.5)kg,抽取骨髓,密度离心法分离骨髓单个核细胞方法:将骨髓单个核细胞接种于密度为1×106cm-2,加入含有血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的M199培养基中体外扩增培养7d,通过DiL标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞,显示红色荧光的为吞噬了乙酰化低密度脂蛋白的细胞,绿色荧光为结合BS-1的细胞,双染色为橙色荧光。免疫荧光染色及流式细胞仪检测CD133,CD34,Flk-1的表达。主要观察指标:①细胞形态观察。②血管内皮祖细胞的增殖能力。③乙酰化低密度脂蛋白和凝集素BS-1双染法鉴定血管内皮祖细胞结果。④血管内皮祖细胞免疫组织化学鉴定结果。⑤血管内皮祖细胞表面标志物流式细胞仪检测结果。结果:①细胞形态观察:新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养72h后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接,呈梭形的内皮样细胞。②血管内皮祖细胞的增殖能力:培养2~4d血管内皮祖细胞增殖较快,之后增殖速度减缓,生长曲线呈典型"S"形外观,培养第6,7天血管内皮祖细胞生长再次增快,吸光度值分别达到0.58±0.15和0.62±0.23。③在血管内皮祖细胞的胞质中,出现与乙酰化低密度脂蛋白结合的红色荧光聚集,阳性率达95%以上;与凝集素BS-1结合率几乎达100%;两者双染色率达90%以上。④血管内皮祖细胞免疫组织化学及流式细胞仪检测细胞表面标志物CD133,FlK-1,CD34均呈阳性。结论:体外扩增法成功地从兔骨髓中分离培养出具有血管内皮祖细胞特征的细胞群体。