慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞HBV感染状态研究初报

有研究发现,树突状细胞(DC)的功能低下是引起慢性HBV感染的关键因素之一,治疗前DC功能状态对疫苗和细胞因子等治疗慢性HBv感染的效果有明显影响,我们通过在慢性HBv感染者PBMC中诱导分化DC,免疫组化法及原位杂交法检测DC内HBV标志(包括HBsAg、HBcAg和HBV DNA),以便为进一步研究DC的功能状态、导致HBV感染慢性化中DC     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞诱导特异性T淋巴细胞应答

目的 探讨慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(Dc)是否诱导特异性T细胞应答。方法(1)将研究对象分为慢性乙型肝炎患者组、急性乙型肝炎痊愈组、健康志愿者组,分离各组研究对象的外周血单个核细胞(PBMC),细胞内细胞因子染色方法检测其对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异表位多肽乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)18-27的记忆性免疫应答;(2)培养慢性乙型肝炎患者DC,将负载有乙型肝炎抗原表位多肽的DC诱导特异的T细胞应答。采用细胞内细胞因子染色方法检测诱导的T细胞分泌的细胞因子,乳酸脱氢酶释放法测定诱导的T细胞杀伤活性。结果(1)急性乙型肝炎患者PBMC对HBcAg 18-27 CTL特异表位多肽存在记忆的免疫应答,其分泌干扰素-γ的CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的(4.3±2.5)％,分泌白细胞介素-2的占总细胞数的(4.8±2.2)％,分泌肿瘤坏死因子-α占总细胞数的(4.6±2.3)％。而慢性乙型肝炎患者和健康志愿者对其记忆应答很低,与急性乙型肝炎患者比较差异有显著性,t值为2.508-3.305,P<0.05。(2)用多肽共孵育过的慢性乙型肝炎患者DC多次诱导的T细胞慢性乙型肝炎患者组,加肽孵育的靶细胞比例为30:1、10:1、3:1时,其杀伤率分别为(57.0±20.3)％、(49.5±20.2)％、(21.8±12.9)％,均高于对照组,表明慢性乙型肝炎患者DC可以诱导特异的T     

干扰素治疗慢性乙型肝炎与外周血树突状细胞表型的关系

在干扰素抗病毒治疗中，其疗效与树突状细胞(DC)的功能状态关系如何现在还不清楚，为此对干扰素治疗前、后24例CHB患者外周血DC的一些重要表面分子进行检测，试图对此进行初步探讨。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的成熟度研究

目的：研究慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血树突状细胞（DC）的成熟度及其占单核细胞的比例,探讨CHB患者DC免疫治疗的机制。方法选取20例CHB患者和10例健康人,分别采集外周抗凝全血2 mL,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、CD83的表达量及单核细胞表面CD14的表达。结果两组DC表面CD80、CD86、CD83分子表达无差异（P＞0．05）;CHB组较健康对照组单核细胞表面分子 CD14表达明显增多,具显著统计学差异（P＜0．05）;CHB组CD80、CD86、CD83三者表达之和占CD14的比例明显高于CHB组,两者有显著统计学意义（P＜0．05）。结论CHB患者外周血存在单核细胞增多、成熟DC减少现象,恢复DC功能是治疗CHB的手段之一。     

乙型肝炎肝硬化患者外周血树突状细胞亚群的鉴定及其临床意义

目的：探讨检测乙型肝炎肝硬化患者外周血树突状细胞（DC）亚群的临床意义。方法采用流式细胞分析技术检测42例乙型肝炎肝硬化患者、45例慢性乙型肝炎患者和30例健康人外周血 DC 细胞亚群和淋巴细胞亚群的构成,比较三者间的差异。结果乙型肝炎肝硬化患者外周血 DC1和 DC2百分数分别为（0.2±0.1）%和（0.2±0.04）%,慢性乙型肝炎患者为（0.3±0.1）%和（0.2±0.1）%,均显著低于健康人群[（0.4±0.1）%和（0.3±0.1）%, P＜0.01];13例 HBeAg 阳性乙型肝炎肝硬化患者外周血 DC2亚群细胞绝对计数为（5.62±1.28）个/μL,显著低于29例 HBeAg 阴性的乙型肝炎肝硬化患者[（8.75±2.32）个/μL,P＆lt;0.05],但是两者 DC1细胞水平无明显差别;乙型肝炎肝硬化患者外周血 CD4＋T 淋巴细胞和 CD8＋T 淋巴细胞计数分别为（588.4±124.2）个/μL 和（338.5±97.4）个/μL,均显著低于慢性乙型肝炎患者[（686.7±106.5）个/μL 和（432.1±102.6）个/μL,P＜0.05],而且乙型肝炎肝硬化患者和慢性乙型肝炎患者外周血 CD8＋T 细胞数均显著低于健康对照人群[（560.2±105.6）个/μL,P＜0.05]。结论乙型肝炎肝硬化患者外周血 DC1和 DC2数量减少,伴 CD8＋T 细胞数降低,可能是导致肝硬化形成的原因之一。     

树突状细胞与慢性乙型肝炎

树突状细胞（DC）是体内功能最强大的抗原提呈细胞,在HBV感染及CHB发病过程中起着重要的作用。近年来,DC已作为特异性免疫治疗手段被应用于CHB的治疗。     

慢性乙型肝炎树突状细胞表型和功能的变化与免疫耐受

目的 观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者树突状细胞（DC）形态和功能的改变。方法 从13例慢性乙型肝炎患者和11例健康人外周血中分离和培养DC,观察DC的形态,用流式细胞仪检测DC表面标记HLA－DR、CD1a、CD80和CD86的表达,用^3H-TdR掺入法测定DC诱导混合性淋巴细胞反应（MLR）的能力。结果 正常DC较慢性乙型肝炎患者在形态上更为典型,不规则,HLA－DR、CD80和CD86分子的表达水平较高（P＜0.05）,诱导MLR的能力较强（P＜0.05）。结论 慢性乙型肝炎患者外周血DC处于不完全成熟状态,其免疫刺激能力较低。     

补肾清毒法对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞表型和功能的影响

目的:观察研究慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血树突状细胞(DC)表型及功能的变化,探讨补肾清毒法治疗CHB的作用机制。方法:筛选血清HBV DNA>105拷贝/mL且无其他肝脏疾病及自身免疫性疾病的CHB患者49例。其中补肾清毒法治疗组28例,核苷类似物治疗组21例,疗程均为24周。治疗前后均从患者外周血分离单个核细胞,体外诱导培养DC。用流式细胞仪检测DC表型HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达,MTT法检测DC的自体淋巴细胞反应,ELISA法测定IL-12、IL-10的水平。结果:CHB患者DC的扩增数量、速度低于正常人。CHB患者治疗后HLA-DR、CD80、CD83、CD86的表达均高于治疗前,补肾清毒法组HLA-DR、CD80、CD86表达率高于核苷类似物组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者经治疗后,DC自体混合淋巴反应中刺激能力较治疗前升高,但仍低于健康人水平,差异有统计学意义(P<0.05)。CHB患者和正常人DC上清液中IL-10的量,各组间差异无统计学意义。混合淋巴细胞反应上清液中IL-l2的量两组经治疗后,较治疗前升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾清毒法能改善DC的表型表达率和抗原递呈能力及其分泌功能,部分恢复CHB患者免疫功能。     

CpG-ODN对慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞表型和功能的影响

研究含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(CpG-ODN)对慢性乙型肝炎患者(CHB)外周血树突状细胞(den- dritic cell,DC)表型和功能的影响。以CpG-ODN刺激CHB和健康者外周血单核细胞衍生的DC成熟,结果显示,与 non-ODN和PBS组比,CpG-ODN能明显提高CHB患者DC的HLA-DR、CD86表达,使其IL-12分泌增加,刺激T 细胞增殖的能力亦显著增强(P<0．05),但不能明显提高CD1a表达。因此,CpG-ODN与TNF-α一样能促进CHB 患者外周血DC成熟进瓶增强其抗原提呈功能;CHB患者的細胞因子环境可能是DC功能沉默的重要原因。     

树突状细胞与慢性乙型肝炎

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者免疫功能发生紊乱,导致持续性肝细胞损害,影响对病毒的清除能力.树突状细胞(dendriticcells,DCs)是体内最主要的抗原递呈细胞,激发机体能够针对外界病原体的侵入产生足够的免疫反应,其数量、功能正常与否直接影响机体的免疫应答.他不仅可以作为宿主抗病毒的功能细胞,也可以作为有利于病毒传播和逃避免疫损伤的载体.因此,对CHB状态下DCs性质的研究及功能提高途径的探索具有重要意义.     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞干扰素β的表达

目的探讨慢性乙型肝炎患者树突状细胞干扰素β（IFN—β）表达与乙型肝炎病毒（HBV）感染后宿主免疫清除障碍的关系。方法选择e抗原阳性慢性乙型肝炎患者52例,健康对照48例,用免疫磁珠细胞分选乙型肝炎e抗原（HBeAg）法从外周血获得纯化的CD14^＋单核细胞,并用hOMCSF、hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的髓样树突状细胞（mDC）,加入polyI：C（25ug／ml）刺激后获得成熟的mDC,在刺激后0h、12h、24h、48h用流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD86、HLA-DR、CD1a,real—time PCR检测IFN8的表达变化。用ELISA方法检测mDC细胞上清液中IFN-β、IL-12、IL-10的浓度变化。结果两组mDC上0h IFN-β mRNA表达水平及细胞上清液中IFN—β浓度差异无统计学意义（P〉0．05）。健康对照组mDC在12hIFN—β mRNA表达水平及IFN-β浓度与0h相比显著升高（P〈0．05）,较患者组0h、12h、24h、48h IFN—β表达显著升高（P〈0．05）。而患者组mDC刺激后12h、24h和48hIFN—β mRNA及IFN-β表达水平与0h相比无显著变化。与0h比较,健康对照组12h、24h、48hCD86表达水平较患者组显著上升（P〈0．05）。两组之间CD1a、HLA—DR表达差异无统计学意义。二组IL-10及IL-120h表达水平差异无统计学意义（P〉0．（15）,患者组IL-10表达24h及48h与0h相比明显上升（P〈0．05）。而对照组12h、24h、48hIL-10表达水平没有明显上升。与之相反,患者组12h、24h、48hIL-12表达与0h相比表达水平没有明显上升,对照组在12hIL-12表达水平与0h相比差异有统计学意义（P〈0．05）,24h、48hIL-12表达水平继续升高（P〈0．05）。结论慢性HBV感染者mDC受polyI：C刺激后IFN-β表达异常,协同刺激因子CD86表达低下,可能造成宿主对HBV感染的免疫清除障碍,导致疾病慢性化。     

慢性乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞衍生的树突状细胞表型与功能

目的 通过检测慢性乙型重型肝炎(CSHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)衍生的树突状细胞(MoDC)经聚肌胞苷酸刺激后表型变化及细胞因子分泌情况,了解MoDC的免疫调节功能及其在慢性乙型肝炎(CHB)重症化中的作用.方法 采集CSHB组患者37例、CHB组患者20例和健康对照者20例的外周血,分离PBMC,免疫磁珠细胞分选法获得纯化的PBMC,体外培养诱导为未成熟树突状细胞(iDC),聚肌胞苷酸刺激为成熟树突状细胞(mDC).流式细胞术检测iDC及mDC细胞表面人类白细胞DR抗原(HLA-DR)、CD83、CD86、CD80的平均荧光强度(MFI);ELISA测定聚肌胞苷酸刺激后12、24、48 h的MoDC培养上清液中IL-12、IL-6、TNF-α分泌水平.多组间比较采用单因素方差分析,并进行方差齐性检验.结果 3组iDC表面HLA-DR、CD83、CD86、CD80的MFI比较,差异无统计学意义.CSHB组患者mDC表面HLA-DR、CD83、CD86、CD80的MFI与CHB组、健康对照组比较,显著低下(F值分别为59.73、13.95、34.80和73.02,均P＜0.05).聚肌胞苷酸刺激12、24、48 h时IL-12分泌量为:健康对照组＞CHB组＞CSHB组(F值分别为151.34、126.65、72.76,均P＜0.05),其中24 h时分泌量最高,分别为(48.2±7.6)、(56.7±11.8)、(97.8±16.2)ng/L.IL-6在上述3个时间点的分泌量为:CSHB组＞CHB组＞健康对照组(F值分别为92.50、86.89、64.57,均P＜0.05),其中12 h分泌量最高,分别为(1698.3±340.4)、(965.8±231.7)、(697.8±213.6)ng/L.TNF-α在上述3个时间点的分泌量为:CSHB组＞CHB组＞健康对照组(F值分别为58.66、122.36、44.73,均P＜0.05),24 h表达量分别为(19 672.7±4214.7)、(9946.1±2586.5)、(6659.2±955.8)ng/L.结论 CSHB患者MoDC成熟障碍,表现为IL-12分泌低下,而IL-6及TNF-α分泌亢进,可能是加剧肝脏炎性反应致重型肝炎的重要因素.     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞Toll样受体3的表达及意义

目的探讨Toll样受体3（TLR3）的表达与HBV感染后宿主免疫清除障碍的关系。方法选取轻度CHB患者50例,健康对照者48名,其外周血用免疫磁珠细胞分选法获得纯化的CD14^＋单核细胞,用RPMI 1640培养基培养,并且用人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的髓样树突状细胞（mDC）,加入聚肌胞刺激后获得成熟的mDC。分别在剌激后0、12、24、48h用流式细胞仪检测TLR3、CD86、HLA-DR和CD1a的表达,实时PCR检测TLR3的表达变化。结果健康对照组中mDC在刺激后24h,TLR3表达较0 h时上调显著（P〈0.05）,48h时TLR3的表达与0h相比差异无统计学意义（P〉0.05）;患者组在刺激后12、24h TLR3的表达与0h时相比,上调不明显,48h时TLR3的表达显著上调（P〈0.05）。实时PCR检测mDC上TLR3 mRNA结果发现,对照组TLR3 mRNA在刺激后12h的表达水平较0h显著上升（P〈0.05）,也显著高于患者组刺激后0、12、24h的表达水平;患者组刺激后48h的TLR3 mRNA表达水平较0h显著上升（P〈0.05）。与0h比较,健康对照组在刺激后12、24h和48h,CD86的表达水平显著高于患者组（P〈0.05）。患者组与对照组间CD1a和HLA-DR的表达差异无统计学意义。结论慢性HBV感染者mDC受聚肌胞刺激后TLR3表达异常,协同刺激因子CD86表达低下,可能造成宿主对HBV感染的免疫清除障碍,导致疾病慢性化。     

不同病毒载量的慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的表型和功能

目的观察研究不同HBV DNA载量的CHB患者外周血DC表型及功能变化,探讨HBV在DC成熟障碍中的作用机制。方法筛选血清HBV DNA>10~5拷贝/ml且无其他肝脏疾病及自身免疫性疾病的CHB患者28例。所有病例予核苷类似物抗病毒治疗24周。治疗前后测定外周血HBV DNA并经肝穿刺明确肝组织病理状态。将治疗前患者设为高载量组(HBV DNA>10~5拷贝/ml),共28例;治疗后患者设为低载量组(HBV DNA<10~3拷贝/ml),共25例。从患者外周血分离单核细胞,体外诱导培养DC。用流式细胞仪测定DC表型,MTT法测定DC对同种异体淋巴细胞的刺激增殖作用,ELISA法测定DC分泌IL-12和IL-10的量。同时以10名健康人作对照。结果DC在体外经细胞因子的刺激可明显增殖,但CHB患者DC的扩增数量、速度低于正常人。DC表面标记:正常人的HLA-DR、CD86、CD80和CD83表达阳性率均大于80%,显著高于两组CHB患者;不同HBV DNA载量的两组CHB患者间差异无统计学意义。两组CHB患者的DE在混合淋巴细胞反应中的刺激能力差异无统计学意义,但明显低于正常对照组。CHB患者和正常人DC上清液中IL-10的量,各组间差异无统计学意义;高载量组与低载量组纯DC培养和混合淋巴细胞反应上清液中IL-12量的差异无统计学意义,而分别明显低于正常人DC。结论在HBV持续感染期间,CHB患者DC的表型变化及功能下调与外周血HBV DNA载量间差异无统计学意义。     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能与单个核细胞乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的关系

目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)及树突状细胞(DC)内HBV共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的存在状况,DC成熟度及功能状态与DC或PBMC中HBV cccDNA载量的关系.方法 分离29例CHB患者和10例健康对照者的PBMC,用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CS...     

慢性乙型肝炎患者树突状细胞的培养鉴定和功能特点

目的：研究慢性乙型肝炎患者树突状细胞（DC）的功能特点,探讨其与肝炎发病机制的关系。方法：分离获得18例慢性乙型肝炎患者和10例正常人外周血单个核细胞（PBMC）,在体外培养条件下,加入细胞因子重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）,IL－4,胎肝酪氨酸激酶受体的配体（FLt3-L)和肿瘤坏死因子α（TNFα）,使DC细胞增殖,成熟,用流式细胞仪检测DC的表面标志,同时检测DC在混合淋巴细胞反应（MLR）中的刺激能力和细胞因子的分泌。结果：DC在体外经细胞因子的刺激可明显增殖,但慢性乙型肝炎患者DC的增殖速度低于正常人;DC表面标志人组织相容性复合物Ⅱ类分子（HLA－DR）,CD－80（B7－1）,CD－86（B7－2）和CD－1α的表达较正常对照组均明显降低（P＜0．001）,尤以CD－1α的降低更为显著,DC在MLR中的刺激能力亦明显低于正常对照。并且与正常对照相比,其产生的IL－12水平降低,而NO水平却增高（P＜0．05）。结论：慢性乙型肝炎患者DC的表型不成熟和功能的缺失,由此导致IL－12的产生和刺激T细胞增殖能力的降低,可能是HBV感染持续发展的原因之一。     

Immune therapy including dendritic cell based therapy in chronic hepatitis B virus infection

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global public health problem. Of the approximately 2 billion people who have been infected worldwide, more than 400 million are chronic carriers of HBV. Considerable numbers of chronic HBV carriers suffer from progressive liver diseases. In addition, all HBV carriers are permanent source of this virus. There is no curative therapy for chronic HBV carriers. Antiviral drugs are recommended for about 10% patients, however, these drugs are costly, have limited efficacy, and possess considerable side effects. Recent studies have shown that immune responses of the host to the HBV are critically involved at every stage of chronic HBV infection: (1) These influence acquisition of chronic HBV carrier state, (2) They are important in the context of liver damages, (3) Recovery from chronic HBV-related liver diseases is dependent on nature and extent of HBV-specific immune responses. However, induction of adequate levels of HBV-specific immune responses in chronic HBV carriers is difficult. During the last one decade, hepatitis B vaccine has been administered to chronic HBV carriers as a therapeutic approach (vaccine therapy). The present regimen of vaccine therapy is safe and cheap, but not so effective. A dendritic cell-based therapeutic vaccine has recently been developed for treating chronic HBV infection. In this review, we will discuss about the concept, scientific logics, strategies and techniques of development of HBVspecific immune therapies including vaccine therapy and dendritic cell-based vaccine therapy for treating chronic HBV infection.     

聚肌胞刺激后慢性乙型肝炎患者树突状细胞内Toll样受体3的表达变化

目的 研究慢性乙型肝炎(CHB)患者树突状细胞(DC)内Toll样受体3(TLR3)的表达变化,探讨HBV持续感染与TLR3表达之间的关系.方法 选取CHB患者60例(CHB组)及健康对照者20名(对照组)为研究对象,应用免疫磁珠细胞分选法获得CD14~+单核细胞,体外诱导培养成未成熟的髓样树突状细胞(imDC),并以聚肌胞(poly I;C)刺激以获取成熟的树突状细胞(mDC).刺激48 h后测定细胞内TLR3蛋白及mRNA的表达,表面标志CD80和人白细胞抗原(HLA)-DR的蛋白表达.计量资料采用t检验,计数贤料采用卡方检验.结果 poly I:C刺激前,对照组和CHB组imDC内TLR3的流式平均荧光密度(MFI)分别为1192.95±301.40和1212.05±250.80,组间差异无统计学意义(t=0.280,P>0.05);刺激后MFI均明显升高,对照组与CHB组分别为1593.00±349.65和1352.98±313.67,前者比后者升高更显著(t=2.880,P<0.05).polyI:C刺激后,对照组与CHB组mDC胞内TLR3 mRNA的表达水平均明显升高,分别为0.1780±0.0664和0.1204±0.0267,前者升高更显著(t=3.909,P<0.05).CHB组内再分为HBeAg(+)和HBeAg(-)组,刺激后两组mDC内TLR3的MFI和mRNA水平均较imDC有明显升高,但组间比较差异均无统计学意义(t=0.366,P>0.05).结论 poly I:C刺激后,对照组和CHB组中mDC胞内TLR3的表达均明显升高,但CHB患者升高的程度显著低于健康者,提示CHB患者的TLR3合成不足可能与HBV持续感染相关.     

肝素对慢性乙型肝炎患者树突状细胞免疫功能的作用

慢性乙型肝炎(CHB)发生的重要原因之一是患者的机体不能对乙型肝炎病毒川BV)形成充分有效的免疫应答以清除病毒。树突状细胞(DC)是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞,在激活T细胞介导的免疫中具有重要的作用。近期文献报道及我们的研究结果提示CHB患者DC不仅数量较少而且发育障碍、功能低下。所以促进CHB患者DC发育并改善其功能,对提高CHB患者的免疫功能以清除体内的HBV有重要意义。本文通过研究肝素在体外对CHB患者DC功能的调节作用,为寻找能促进DC成熟的经济有效的诱导因子提供实验依据。一、材料与方法 1．材料：巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(北京医科大学免疫室提供)；白细胞介素(IL)4、肿瘤坏死因子(TNF) α、干扰素(IFN)γ(美国Promega公司产品)；荧光标记的抗人CDla、CD40、CD80、CD83、CD86、人类白细胞抗原-DR 单克隆抗体(美国lmmunotech公司产品)；RPMI 1640培养基、MTT、异硫氰酸荧光素(FITC)-Dextran(美国Sigma