弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的 :体外扩增弓形体主要表面抗原 SAG1基因 ,构建 pc DNA3- SAG1真核表达质粒 ,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法 :采用 PCR技术 ,自行设计一对寡核酸引物 (P1,P2 ) ,从弓形体 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用 Eco R1和 Hind 双酶切后 ,克隆到真核表达质粒 pc DNA3中 ,转化入大肠杆菌 TG1,用氨苄青霉素和 PCR初筛 ,将 PCR扩增阳性的重组子分别用 Sac1单酶切、Eco R1和 Hind 双酶切鉴定。结果成功地构建真核型表达质粒 pc DNA 3- SAG1,从而为进一步 SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果 :从 RH株基因组 DNA中特异扩增出编码 SAG1的全基因序列 ,扩增目的基因片段大小与预期长度(10 2 5 bp) ,相符 ;将分离、纯化的目的基因片段 SAG1插入 pc DNA3质粒 Hind 和 Eco R1位点 ,构建重组质粒pc DNA3- SAG1。结论 :成功构建重组质粒 pc DNA3- SAG1     

Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体的构建和鉴定

目的构建和鉴定Tet-on系统调控的人端粒酶催化亚单位基因腺病毒表达载体。方法用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连于pTRE-shuttle2质粒的EcoRⅠ酶切位点,经EcoRⅠ酶切鉴定。亚克隆重组质粒片段于腺病毒载体Adeno-XTM,构建重组Adeno-X-hTERT,以PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切、聚合酶链反应(PCR)以及进一步测序鉴定其方向。结果重组质粒经EcoRⅠ酶切后得到预期的3.5、0.88、3.55kb大小的3条片段,重组腺病毒载体经PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切,出现预期32.6、5.09kb片段,与理论计算值完全一致,PCR及测序结果进一步确认了结构与方向的正确性。结论成功构建了Tet-on系统调控人端粒酶催化亚单位基因hTERT的重组腺病毒表达载体。     

弓形虫p30抗原基因体外扩增及其重组质粒构建

为构建弓形虫主要表面抗原ｐ３０基因重组质粒，根据已发表的弓形虫主要表面抗原ｐ３０基因序列，设计合成引物Ｐ１、Ｐ２。在两引物的５末端分别加上了ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ酶切位点，利用ＰＣＲ技术获取ｐ３０抗原基因整个开放阅读框架的碱基序列。ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切后，与经同样两种内切酶切割的质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ连接构成重组质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ－ｐ３０，转化大肠肝菌ＤＨ５α。通过遗传标记筛选、ＰＣＲ扩增及酶切分析对重组子进行了鉴定证实构建了ｐ３０基因重组质粒。     

CD74-ROS1-L1951R点突变质粒的构建与鉴定

目的通过重叠延伸PCR技术构建CD74-ROS1-L1951R点突变质粒。方法根据CD74-ROS1融合基因序列和真核表达质粒p CM V-C-Flag上的多克隆位点设计引物,利用重叠延伸PCR技术对CD74-ROS1融合基因进行基因定点突变得到CD74-ROS1-L1951R点突变融合基因,随后将其酶切定向连入真核表达质粒p CMV-C-Flag启动子下游,构建p CMV-C-Flag-CD74-ROS1-L1951R重组质粒。重组质粒经菌落PCR、双酶切鉴定和测序,鉴定目的基因是否插入p CM V-CFlag质粒及定点突变是否成功。结果通过双酶切鉴定和测序结果显示,质粒的方向及序列正确,阅读框正确无误,表明CD74-ROS1-L1951R基因成功插入p CMV-C-Flag质粒,且CD74-ROS1-L1951R基因定点突变正确。结论成功构建了p CM V-C-Flag-CD74-ROS1-L1951R真核表达重组质粒,为研究CD74-ROS1点突变导致的耐药机制奠定了基础,可用于后续研究。     

核酸疫苗pVAX1-F的构建及瞬时表达

目的:构建仙台病毒核酸疫苗pVAXl-F,并在COS 7细胞中表达.方法:利用PCR法以仙台病毒cDNA为模板扩增出F基因,与pMD18-T连接,测序正确后用HindⅢ/EcoR Ⅰ双酶切,将F基因引入经同样酶切的pVAX1载体,构建pVAX1-F表达载体,用PCR法和双酶切法鉴定,并将此重组质粒通过脂质体介导转染COS 7细胞,流式细胞术检测抗原蛋白表达、RT-PCR法检测外源基因的表达.结果:经PCR法和酶切鉴定,目的片段大小与预期相符,经测序目的基因序列与GenBank(EF679198)公布结果一致.重组质粒pVAX1-F转染COS 7细胞72 h后,能够表达抗原蛋白,流式细胞术检测达到58.3%,与对照组3.6%比较差异具有显著性(P<0.01),且F基因mRNA明显表达.结论:成功构建pVAX1-F,并能够在COS 7细胞中瞬时表达,为仙台病毒F基因核酸疫苗进行免疫学评价奠定基础.     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

慢性髓性白血病bcr/abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

大鼠血栓调节蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的研究大鼠血栓调节蛋白基因的扩增、克隆及在原核细胞中的表达。方法以大鼠基因组DNA为模板,进行PCR扩增,用pMD18-Tsimple vector进行T克隆并测序。经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,将目的基因克隆到pET-28a(+)表达载体质粒中,转化E.coliBL21(DE3)表达重组蛋白,通过SDS-PAGE分析表达产物。结果含有大鼠血栓调节蛋白基因的PCR产物约为1850bp。重组pMD18-Tsimple vector质粒和重组pET-28a(+)质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,有相应大小的目的片段,测序结果正确。经IPTG诱导,重组pET-28a(+)质粒在E.coliBL21(DE3)中有相对分子质量约为72000的融合蛋白表达。结论成功克隆了大鼠血栓调节蛋白基因,并成功表达了该基因编码的蛋白。     

PML-RARα245与hGM-CSF双基因DNA疫苗的构建与表达

目的 采用长度为245 bp的急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因片段构建新的PML-RARα与hGM-CSF真核双表达载体.方法 用RT-PCR技术从NB4细胞的RNA中扩增长度为245 bp的PML-RARα基因片段,PCR技术从pORF-hGM-CSF质粒中扩增出hGM-CSF基因,分别将两基因片段连接到pIRES质粒的多克隆位点A和B中,构建真核双表达载体.用酶切和序列分析方法验证所构建载体的正确性.将重组质粒转染K562细胞,利用RT-PCR和点杂交技术检测重组质粒在真核细胞中的转录和翻译情况.结果 双酶切结果证明重组质粒中含有相应大小的PML-RARα基因片段及hGM-CSF基因,序列分析证明重组质粒中插入片段的碱基序列完全正确.该重组质粒能够在真核细胞中正常转录和翻译.结论 成功构建了含有PML-RARα245及hGM-CSF的双表达载体,为筛选合适的抗原片段用于构建治疗急性早幼粒细胞白血病的PML-RARαDNA疫苗提供重要资料.     

截短的丙型肝炎病毒核心区基因的克隆和表达

目的  克隆和表达截短的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）核心区基因,为制备HCV核心区抗体准备抗原。方法  根据软件分析选取带有优势抗原表位的HCV核心区多肽,找出对应DNA序列,逆转录PCR扩增目的基因,并将其克隆到原核表达载体中进行诱导表达。表达的目的蛋白纯化后用间接ELISA法检测免疫活性。结果  获得了序列正确的HCV目的基因片段。表达的目的蛋白为可溶性蛋白,能被很好地纯化。使用该纯化蛋白检测各种样本,结果HCV阴性样本的平均吸光度（A）值为0.081,HCV阳性样本与阴性对照的A值之比均>2.1,乙型肝炎和梅毒阳性样本的A值都在0.101以下。结论 成功地克隆和表达了HCV核心区小片段基因,获得了具有良好抗原性的截短HCV核心区多肽。     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的克隆大鼠肝再生增强因子 (ALR)编码序列 ,并在原核细胞表达。方法按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物 ,从2周龄大鼠肝组织提取RNA ,利用RT_PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区 ;将PCR扩增片断亚克隆到pBV221质粒 ,构建原核表达重组载体 ,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的ALRcDNA编码区基因 ,序列分析表明与文献报道一致 ;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质 ,与预期值一致。结论从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因 ,并获得了原核细胞高效表达     

移动单孢菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

目的克隆与表达移动单孢菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从移动单孢的基因组DNA中扩增出PDCzm基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。结果扩增出DNA碱基对数目约1.7 kb的PDCzm基因,成功构建其表达质粒pZM 22 b,对转化菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的37.9%。结论成功构建高效表达PDCzm基因的工程菌株,为实现利用PDCzm进行的生物转化奠定了基础。     

酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

目的酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)丙酮酸脱羧酶 (PDC)基因的克隆和表达。方法利用PCR技术从酿酒酵母的总cDNA中钓取出PDCsc基因 ,构建其高效表达质粒 ,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株EscherichiacoliBL2 1 (DE3)进行表达。结果扩增出长约 1 7kb的PDCsc基因 ,成功构建其表达质粒pSC -2 2b ,对转化菌株的SDS -PAGE分析结果显示 :该基因获得高效表达 ,表达蛋白占细胞总蛋白的 1 8 6 %。结论成功构建高效表达PDCsc基因的工程菌株 ,为实现利用PDCsc进行的生物转化奠定基础     

Cloning of polyketide synthase genes from amphidinolide-producing dinoflagellate Amphidinium sp

Cloning of polyketide synthase (PKS) gene for amphidinolide biosynthesis was attempted from a dinoflagellate Amphidinium sp. (strain Y-42). Fourteen beta-ketoacyl synthase gene fragments were obtained by Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification from degenerated primer sets designed on the basis of the conserved amino acid sequences of beta-ketoacyl synthase domains in known type I PKSs. The PCR analysis using primer sets designed from these fourteen beta-ketoacyl synthase gene fragments revealed that these DNA sequences exist only in the dinoflagellates producing amphidinolides. The DNA sequence of the positive clone, which was isolated from genomic DNA library of Amphidinium sp. (strain Y-42) by PCR detection using the specific primer set, was analyzed by shotgun sequencing. The deduced gene products in the positive clone showed similarity with beta-ketoacyl synthase (KS), acyl transferase (AT), dehydratase (DH), ketoreductase (KR), and acyl carrier protein (ACP) in known type I PKSs and thioesterase (TE).     

人类疱疹病毒8型K1基因的克隆及其在内皮细胞和前列腺癌细胞中的表达

目的构建含人类疱疹病毒8型(HHV-8)致瘤基因K1的真核表达质粒,并将其导入内皮细胞(EC)和前列腺癌细胞(PC-3)中进行表达。方法根据GenBank中登记的K1基因核酸序列设计PCR引物,在其5′端及3′端分别引入Xho I和Xba I酶切位点,并在其下游引入Flag标签蛋白序列用于后期K1蛋白表达的检测。以含有K1基因的HHV-8 DNA为模板扩增K1基因,经双酶切纯化后将其克隆入真核表达载体pCI-neo中。重组质粒经核酸测序鉴定后分别瞬时转染EC和PC-3细胞系,于转染后48 h提取细胞RNA及蛋白,分别以RT-PCR和Western blot检测K1基因的转录和表达情况。结果成功构建了含K1基因的重组质粒pCI-K1。核酸序列分析显示,克隆的K1基因全长928 bp,与GenBank中登记的K1基因100%同源,引入的Flag序列完全正确。经pCI-K1转染后的EC及PC-3细胞中均可检测到K1 mRNA转录和蛋白表达。结论重组质粒pCI-K1构建成功,并在EC和PC-3细胞中正确表达。     

膀胱癌根治术后复发监测中尿肿瘤标志物联合检测组合方式的研究

目的探讨膀胱癌根治术后复发监测中尿肿瘤标志物联合检测的最佳组合方式。方法对40例膀胱癌根治术患者于术后复发监测中进行尿纤维连接蛋白（FN）、核基质蛋白22（NMP-22）、膀胱肿瘤抗原（BTA）、纤维蛋白降解产物（FDP）、透明质酸酶（HA）等5项肿瘤标志物检测,然后按二联、三联组合方式计算其不同组合方式检测的灵敏度、特异度和准确度,并进行比较。结果 （1）联合检测时其灵敏度均较单项检测时提高,差异均有统计学意义,均P〈0.05;联合检测时其特异度降低,但差异均无统计学意义,均P〉0.05;联合检测时其准确率均有所提高,但差异均无统计学意义,均P〉0.05。（2）二联组合方式中以FN＋NMP-22组合灵敏度最高,其次为FN＋BTA、NMP-22＋BTA组合,与其他组合比较差异有统计学意义,均P〈0.05。各种二联组合之间的特异度、准确率的差异均无统计学意义,均P〉0.05。（3）三联组合方式中以FN＋NMP-22＋BTA组合灵敏度最高,与其他组合比较差异有统计学意义,均P〈0.05;各种三联组合之间的特异度、准确率的差异均无统计学意义,均P〉0.05。结论尿肿瘤标志物联合检测可望部分替代膀胱镜检查用于膀胱癌根治术后复发监测,而且在决定尿肿瘤标志物联合检测的组合方式时应尽量选择FN及NMP-22。     

HIV-1核衣壳蛋白NCp7抑制剂体外筛选方法的建立

目的表达HIV-1核衣壳蛋白(nucleocapside proteinp7,NCp7),并建立抑制剂筛选方法。方法从pBRU2/ADP202质粒经PCR得到HIV-1NCp7编码序列,克隆到pet28a质粒中构建HIV-1NCp7表达载体。阳性克隆转染E.coliBL21DE3,以IPTG诱导,细胞裂解液经Q SepharoseH.P和SP Sepharose H.P纯化后纯度达到90%以上。将具有锌离子逐出活性的H2O2和2,2′-联硫基二吡啶(2,2′-di-thiodipyridine,AT-2)与NCp7作用,用锌离子特异的荧光染料检测。用该方法检测KIZ-CM系列化合物。结果可以检测H2O2和AT-2的锌离子逐出活性,经该方法筛选,KIZ-CM10,18,19等化合物具有一定的锌离子逐出活性。结论在国内首次建立了HIV-1NCp7锌离子逐出方法,该方法可以用于NCp7抑制剂的筛选。     

一条脑胶质瘤相关的全长基因的生物信息学分析

目的报道一条脑胶质瘤相关的全长新基因的生物信息学分析及其研究的结果。方法对507E08克隆子进行了测序,生物信息学分析和Northern blot分析。结果507E08基因为全长基因,长度为2002bp,共编码203个氨基酸,命名为人核糖体蛋白L14．22。经Northern blot证实507E08基因在人正常脑组织中低表达,而在人脑胶质瘤中高表达。结论生物信息学是一种有效分析未知基因的工具。507E08基因可能是与人脑胶质瘤形成有关的一条全长新基因。