改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的：设计并验证一改良的降落PCR(MTD—PCR)程序。方法：自盐藻bardawi1中提取基因组DNA作为PCR模板，使用TaqDNA聚合酶及pfu DNA聚合酶，运用普通PCR和MTD—PCR程序，扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列，并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果：使用普通Taq酶进行PCR，普通PCR程序产生200bp，500bp和1272bp的3条带，而MTD—PCR程序仅克隆出1272bp的特异带；利用高保真的pfu DNA聚合酶作PCR，在MTD—PCR泳道中也仅有1272bpl条带，而普通PCR除了产生1272bp的特异带外，还出现1条500bp的非特异带。结论：无论使用普通Taq酶或高保真酶pfu，改良的MT—PCR程序均明显提高PCR的特异性，提示它可用于克隆普通PCR难以克隆的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。     

用大引物PCR法获得轮状病毒VP4基因的突变体

目的；对A组轮状病毒主要结构抗原VP4基因中PacⅠ的识别序列进行无义突变以便于用腺病毒Ad-Easy载体系统进行表达。方法：采用大引物PCR方法，通过3条引物，两轮PCR反应，获得VP4基因的突变体，并经核酸序列分析证实。结果：PacⅠ识别的8个碱基序列TTAAT－TAA，突变为CTGATCAA。结论；大引物PCR是对核酸进行突变的一种简便，快速的方法。     

PCR法扩增盐藻叶绿体atpA基因

目的：克隆杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。方法：把GenBank中近10种藻类的atpA全基因的氨基酸序列进行比较,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增atpA基因片段,然后胶回收所扩片段并与T—vector相连,转化大肠杆菌JM109,挑阳性克隆鉴定,并测序,再将序列与所选藻类有关序列比较同源性。结果：从盐藻叶绿体基因组中扩增出约400bp的片段。测序结果显示此片段长405bp,推导的氨基酸序列与莱茵衣藻的同源性为920k,,普通小球藻为88％,,原始绿藻为87％,卵形肾藻为86％,Cyanidioschyzon merolae为85％。结论：本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻的叶绿体atpA基因片段。     

杜氏盐藻鞭毛相关蛋白cDNA片段的克隆及在鞭毛重吸收过程中的表达

目的:克隆杜氏盐藻鞭毛相关蛋白(FAP)的cDNA片段并探讨其功能.方法:分析莱茵衣藻等生物的FAP同源蛋白的氨基酸序列保守区域,设计简并引物.提取盐藻总RNA进行RT-PCR.根据得到的序列设计3'RACE引物,巢式PCR扩增该cDNA的3'端序列.秋水仙碱处理对数生长期的盐藻细胞,使细胞停留在分裂中期,并诱导鞭毛缩...     

大肠癌相关基因ST13转录启动区的增强子研究

目的:探讨大肠癌相关基因ST13上游5'近端调控区(-595～ 74)中增强子碱基序列.方法:设计系列缺失PCR引物,扩增ST13基因5'近端碱基序列片段,pGEMT-EASY克隆、测序,再亚克隆到pGL2系列瞬间报告载体上,等量转染SW620细胞,检测荧光酶活性.结果:系列扩增碱基序列片段669 bp、263 bp、163 bp对pGL2-Basic中的荧光素酶基因均具有较强的启动表达作用,片段101 bp、47 bp则几乎没有启动下游基因表达的作用.而101 bp片段与系列报告载体pGL2重组的分子,在其中含有启动子的报告基因表达载体中具有明显的增强作用(P＜0.01),但作用强度小于阳性对照pGL2-Control(P＜0.05).结论:位于ST13基因上游5'近端调控区的碱基序列101 bp片段(-595～-494),是一个基因转录调控增强子.     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因5'上游的克隆与序列分析

目的：克隆盐藻2种碳酸酐酶基因(DCA1、CA1)5’上游区序列，并对其进行测序和序列分析。方法：利用Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、PvuⅡ和StuⅠ4种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组DNA，并与衔接头连接，构建成盐藻步行基因组文库GWL1、GWL2、GWL3和GWL4；巢式PCR方法从盐藻步行基因组文库中扩增DCA1和CA1基因5’上游区序列，双脱氧末端终止法测序。结果：DCA1基因，在GWL1、GWL3中分别扩增出约1．3kb和4、5kb的特异带，而CA1基因，则在GW12、GWL4中分别扩增出1．7kb和2．5kb的特异带；序列分析结果表明，所得序列的3’端与已知DCA1、CA1基因cDNA5’端序列完全一致。该2序列均有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA—box、CAAT—box)和富含GT的重复序列等许多相似之处。结论：采用基因组步行方法从已知cDNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的DCA1、CA1基因的5’上游区序列，可能是2种新的杜氏盐藻碳酸酐酶基因的启动子区序列。     

简并引物在克隆盐藻热休克蛋白70基因家族中的应用

目的：利用简并引物扩增盐藻热休克蛋白70(hsp70)家族。方法：根据衣藻、矮牵牛花等真核生物hsp70氨基酸高度保守序列didlgtt，dqgnrttp，payfnds和ATKDAG设计2对简并引物，以盐藻hsp70 cDNA为模板进行巢式PCR扩增，产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中，经筛选后测序，将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果：得到2个分别为372bp和354bp编码126及118个氨基酸残基的部分cDNA片段。推导的氨基酸序列与衣藻、矮牵牛花、番茄、果蝇和酵母hsp70和hsp70b比较有高度同源性。结论：所克隆的序列为盐藻hsp70和hsp70b部分cDNA片段。利用简并引物筛选cDNA文库是克隆基因家族重要的方法。     

限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究

目的 建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法,研究原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态.方法 针对P16基因启动子区富含CpG的序列,设计3条引物,进行半巢式降落PCR扩增,检测原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态;并将P16基因启动子区340 bp片段克隆到pMD18-T载体,E.coli JM109扩增此质粒后经CpG甲基化酶M.Sss Ⅰ处理,再用Hpa Ⅱ酶切验证获得P16基因启动子区甲基化阳性的质粒P16Pm 并进行特异性和灵敏度实验.以此甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法检测40例人原发性肝癌和3例正常人肝组织DNA样品的P16基因启动子区甲基化状态.结果 所采用的Hpa Ⅱ酶切后半巢式PCR方法的特异性强,灵敏度达100 fg;对40例人原发性肝癌组织DNA样品P16基因的启动子区甲基化状态检测显示甲基化阳性率为30%(12/40),3例正常人肝组织均为阴性(0/3).结论 P16抑癌基因启动子区甲基化可能与肝癌发生发展有关.本实验方法简便、成本低廉,并有高度的特异性与灵敏度,在大规模检查中有实际应用价值.     

间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片段的扩增、测序及诊断应用

目的：体外扩增间日疟原虫（深圳株）红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因（SSUrDNA）片段，克隆测序分析，并探讨其诊断应用。方法：设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应（PCR）从间日疟患血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段；用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列；以SSUrDNA为靶基因，PCR诊断间日疟，双盲法检测40份血样（28份镜检阳性的血样，12份健康血）。结果：间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与SalI株顺序相比，仅在第151位处缺失1个碱基C；以SSUrDNA为靶基因，双盲法检测镜检阳性及健康人血样，结果完全正确。结论：所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守，以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断。     

异种移植转基因用含粘附分子-2启动子的人CD59 重组基因的构建

目的：构建含人粘附分子－2（ICAM－2）启动子的人补体调节蛋白CD59重组基因,并钭其用于异种器官移植转基因。方法：利用PCR方法从人血基因组扩增得到ICAM－2启动子、CD59基因的第一内含子片段,经电泳分离、切胶回收纯化得到上述片段,分别双酶、单酶切这两条片段,纯化回收备用;双酶切pcDNA3-CD59真核表达载体,经电泳分离,切胶回收纯化得到不含病毒启动子、含筛选基因Neo的一段pcDNA3-CD59cDNA作为载体序列;ICAM－2启动子片段先与载体进行定向克隆连接反应后转化细菌,阳性转化蓖质粒抽提及酶切鉴定,得到pcDNA3-ICAM2-CD59质粒;再单酶切此质粒,纯化该载体与CD59第一内含子片段连接,转化细菌、抽提质粒,用脂质体将该质粒转染猪血管内皮细菌,流式细胞仪检测CD59蛋白表达。结果：得到pcDNA3-Enhancer-ICAM2-CD59质粒,以EcoR I消化此重组质粒,产生5．5及0．5kb两片段,以Hind Ⅲ消化重组质粒,得到5．45及0．55kb两片段,以Kpn I/Hind Ⅲ双酶切质粒时,出现5．0、0．55、0．4kb 3条片段,对插入子分别进行测序,上述结果完全符合设计要求及正确序列。流式细胞仪检测重组基因表达阳性。结论：含人ICAM－2启动子的CD59重组基因表达载体获得成功,该重组基因构建成功为转基因应用奠定了基础。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As₂O₃对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。     

人野生型抑癌基因PTEN/MMAC1的巢式PCR法克隆、测序及表达载体的构建

目的 :克隆人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1 c DNA序列并构建其表达载体。方法 :利用RT- nested PCR法从正常人胎盘组织中扩增出约 1 2 0 0 bp的 DNA片段 ,与 p UCm- T载体连接 ,作全自动测序确证 ,并将其重组入 pc DNA 3.1载体中 ,构建为表达质粒 pc DNA- w P。结果 :对 PCR产物进行测序 ,序列基本正确。结论 :利用 RT- nested PCR法成功克隆了人野生型抑癌基因 PTEN/MMAC1c DNA序列并构建了表达质粒 pc DNA- w P。     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的 构建人乙酰肝素酶(HPSE)基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体,并分析其活性.方法 PCR扩增人类基因组DNA HPSE启动子核心片段,并测序鉴定和分析转录因子结合位点(TFBS).双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点,构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp.将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP-Hp及质粒pEGFP-1(阴性对照)和pEGFP-N1(阳性对照)分别转染正常人脐静脉内皮细胞(ECV)和不同的肿瘤细胞(肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性自血病K562细胞).荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性.结果 扩增的HPSE启动子核心片段长度为561 bp,序列分析与GenBank收录一致,含有3个SP1、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N-myc和NGFI-p300等TFBS各1个.重组质粒pEGFP-HP经酶切和测序鉴定与预期结果 一致.荧光显微镜观察显示,转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达;转染pEGFP-N1细胞均有强荧光表达;转染pEGFP-Hp质粒的ECV几乎无荧光表达,HepG2和Hep2细胞有较强荧光,K562细胞仅有较弱荧光.流式细胞术检测表明,pEGFP-Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3.9%、21.3%、10.8%和6.5%,pEGFP-N1转染率分别为17.1%、24.0%、14.0%和11.0%,二者比值均小于1.结论 成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体.该载体可在肿瘤细胞特异性表达,但其活性需进一步加强.     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA克隆及其乳腺特异性表达载体的构建

目的：克隆组织型纤溶酶原激活剂(tissue—type plasminogen activator,tPA)基因及构建其乳腺特异性表达载体。方法：以PCR技术克隆2．1kb tPA cDNA片段;应用体外连接技术,连接乳腺特异性表达载体pWA和2.1 kb tPA cDNA片段;转化连接产物,以内切酶酶切、琼脂糖电泳及插入片段序列分析鉴定阳性克隆。结果：琼脂糖电泳显示,2．1 kb tPA cDNA片段克隆成功;内切酶酶切片段与预期片段长度一致;插入片段序列与文献报道一致。结论：tPA基因克隆及其乳腺特异性表达载体构建成功。     

细胞周期素D2启动子曲古菌素A效应区域的研究

目的 研究在曲古菌素A(trichostatin A,TSA)处理条件下细胞周期素D2的调控机制.方法 细胞周期素D2的mRNA水平通过RT-PCR方法 检测.细胞周期素D2的启动子片段以A549细胞基因组DNA为模板,通过高保真PCR扩增获得,并克隆到pGL3-BASIC载体中;并以此为基础通过高保真PCR扩增出不同...     

人生长激素基因组DNA在家蚕BmN细胞中的瞬时表达

目的 :探讨内含子对外源基因在真核细胞中表达的作用。 方法 :直接将含有 4个内含子和自身信号肽的 1.5 kb全长人生长激素基因直接克隆至真核表达载体 pc DNA3.0 ,然后利用脂质体转染家蚕 Bm N细胞 ,收取细胞上清 ,PAGE电泳和Western印迹分析鉴定表达产物 ;将全长基因序列、缺失第 1内含子基因序列和 c DNA序列的表达载体 ,分别转染细胞后检测各片段表达产物之间的差异。结果 :测序结果表明人生长激素基因组 DNA在细胞内正确转录、剪接。蛋白质电泳分析和免疫学检测证明转染细胞能够有效合成并分泌蛋白质。 EL ISA检测发现 3种基因片段中 ,全长的基因序列在表达效果上要高于后两者 (P<0 .0 5 ) ,其中缺失第 1内含子的序列表达效率较 c DNA序列明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :在家蚕细胞中能够正确表达带有自身内含子和信号肽的人源蛋白基因 ;推测基因的内含子在成体的外源基因表达过程中起着更为重要的作用     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。