鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响

目的研究不同浓度鱼腥草素对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响,旨在为未来抑制成骨细胞增殖的治疗提供参考。方法在新生SD大鼠颅骨成骨细胞培养液中分别加入0(空白对照组)、1、10、20、30、40μmol/L浓度的鱼腥草素,采用细胞计数试剂盒(CCK)-8测定不同浓度鱼腥草素对大鼠成骨细胞的增殖能力,采用茜素红染色法评价矿化结节情况,采用Western印迹法测定碱性磷酸酶蛋白(ALP)表达活性。结果经CCK-8法检测成骨细胞增殖结果显示,鱼腥草素作用2、7 d后,空白对照组、1、10、20、30、40μmol/L组吸光度值随着浓度增加均呈下降趋势,各时点各组吸光度值差异有统计学意义(P0.05);成骨诱导培养7、14 d后,茜素红染色结果显示,10、20μmol/L组矿化结节数多于其他各组,40μmol/L组培养各时点矿化结节数最少,后由少至多依次为空白对照组、30μmol/L组、1μmol/L组,组间差异有统计学意义(P0.05);各时间点,10、20μmol/L组ALP活性最高,30、40μmol/L组ALP活性抑制,随培养时间延长,这种活性促进与抑制的情况继续增强,组间差异有统计学意义(P0.05)。结论鱼腥草素对成骨细胞增殖、分化、矿化有抑制功效,可调节骨代谢,可能对骨质疏松的防治有积极意义。     

亚麻木酚素促进绝经期妇女种植体骨结合机制

目的观察亚麻木酚素(SDG)对成骨细胞的增殖分化及护骨素(OPG) mRNA表达的影响。方法将成骨细胞在不同浓度的SDG环境下进行培养,采用噻唑蓝(MTT)法和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法检测细胞增殖情况及ALP活性;利用SDG培养成骨细胞24 h后,Phalloielin染色观察细胞骨架的形态变化;利用实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测OPG mRNA的表达水平。结果高浓度SDG抑制成骨细胞增殖(P0.05),低浓度SDG促进成骨细胞增殖(P0.05)。与空白组相比,低浓度SDG组ALP活性高(P0.05),高浓度SDG浓度组ALP活性明显下降(P0.05)。在SDG浓度10~(-9)～10~(-7) mol/L范围内,随浓度的增高细胞铺展面积增大且内部框架结构更加清晰,而10~(-5) mol/L组细胞内部结构不清晰。SDG浓度为10~(-6)、10~(-7) mol/L时,OPG mRNA的表达明显增加(P0.05)。结论 SDG在成骨细胞增殖、分化的促进上具有一定效果。     

PI3K／Akt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化调控中的作用

目的：研究PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）增殖及分化的影响。方法采用贴壁法体外分离人骨髓间充质干细胞（hMSCs）,加入PI3K抑制剂LY294002（1、10μmol/L）,应用MTT法测定细胞增殖,常规成骨诱导分化培养3或7d,采用碱性磷酸酶（ALP）染色观察成骨分化水平,化学比色法测定ALP活性,茜素红染色后观察矿化钙结节数量并定量分析,Westernblot检测磷酸化Akt蛋白表达,应用Realtime-PCR检测各组细胞BMP2、Runx2、OPN及Osterix等成骨分化标记物的基因表达水平。结果从24至72h,LY294002对hMSCs增殖均产生显著抑制,随时间推延,可见抑制增殖效果增强（P＜0.05）。ALP染色和定量测定提示10μmol/L的ALP活性最强,在不同时间显著高于对照组和1μmol/L组（P＜0.05）。成骨诱导培养3和7d,1、10μmol/L组矿化量都显著高于对照组（P＜0.05）。10μmol/L组矿化量在成骨诱导7d也显著高于1μmol/L组（P＜0.05）。Westernblot检测结果证实成骨诱导可激活Akt磷酸化蛋白表达,但LY294002可抑制该蛋白磷酸化。成骨诱导分化7d,1、10μmol/L均明显促进BMP2、Runx2、OPN、Osterix4种基因mRNA表达（均P＜0.05）。结论PI3K/Akt信号通路参与hMSCs增殖和分化过程。成骨分化伴随下游Akt蛋白表达。PI3K抑制剂可抑制hMSCs增殖,但同时促进其向成骨分化和矿化。     

地拉罗司对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1生物学活性的影响

目的探讨铁鳌合剂地拉罗司(deferasirox,DFS)体外对成骨细胞增生、分化、矿化和细胞内铁离子的影响。方法小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10 mmol/Lβ-甘油磷酸和50 mg/L抗坏血酸的诱导作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(10、20、40μmol/L)DFS干预,用CCK-8法检测细胞的增生,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性试剂盒检测细胞ALP活性,Von kossa染色法行细胞钙结节染色,实时定量PCR检测细胞膜转铁蛋白受体(transferrin receptor,TfR)mRNA的表达。结果 MC3T3-E1细胞增生结果显示,DMSO溶剂组、对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组A值分别为1.41±0.09、1.41±0.09、1.01±0.01、0.79±0.04、0.67±0.04;ALP活性检测结果显示,对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组ALP活性值分别为0.73±0.03、0.65±0.02、0.54±0.03、0.35±0.04;钙结节检测结果显示,对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组TfR mRNA钙化面积比值分别为4.22±0.12、3.29±0.14、1.40±0.20、0.86±0.21;TfR mRNA表达检测结果显示,对照组(0μmol/L)、10、20、40μmol/L组TfR mRNA表达比分别为1、1.52±0.23、1.91±0.17、2.98±0.14。MC3T3-E1细胞的增生、ALP活性、钙结节和钙化面积随DFS干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P0.05),TfR mRNA的表达随DFS干预浓度的增加呈剂量依赖性升高(P0.05)。结论 DFS可能通过螯合成骨细胞内的铁离子抑制其增生、分化和矿化。     

雷洛昔芬对大鼠成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响

目的初步探讨雷洛昔芬对成骨细胞骨形成作用机制。方法采用新生大鼠颅盖骨酶消化法体外培养成骨细胞,在培养液中加入不同浓度雷洛昔芬（0、10^-8、10^-7、10^-6mol/L）,在共同条件下培养。测定各项骨形成指标（增殖测定、碱性磷酸酶活性定量和矿化结节形态计量）。结果雷洛昔芬（10^-8mol/L组和10^-7mol/L组）的MTT、ALP测试结果及矿化结节形态计量高于对照组,且有统计学意义,P〈0.05。结论雷洛昔芬能够促进大鼠颅盖骨成骨细胞的增殖、分化及矿化,与雌激素作用类似。     

脱氢表雄酮对离体大鼠成骨细胞的影响

目的探讨脱氢表雄酮(DHEA)对离体大鼠成骨细胞的影响。方法体外分离培养大鼠成骨细胞,取传一代细胞,分别给予10-5、10-7、10-9mmol/L DHEA培养72h,以10-8mmol/L雌二醇(E2)为阳性对照,另设空白对照组。碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞,MTT法检测成骨细胞的增殖能力,PNPP法测定ALP活性。行矿化结节染色,低倍镜下测量矿化结节面积并计算面积比,观察DHEA对矿化能力的影响。结果和空白对照组相比,不同浓度DHEA组成骨细胞增殖能力均有上升,其中以10-7mmol/L DHEA组最显著(P<0.01),其作用和E2相似(P>0.05);不同浓度DHEA组ALP的活性均升高,亦以10-7mmol/L DHEA组最显著(P<0.01),10-7、10-9mmol/L DHEA的作用和E2相似(P>0.05);10-9mmol/L DHEA组单位细胞数的ALP活性高于空白对照组(P>0.05)。不同浓度DHEA组矿化面积及矿化面积比均有显著增加(P<0.01),其作用和E2相似。结论DHEA在体外促进大鼠成骨细胞生长和增殖,提高ALP活性,并促进骨矿化物质在骨内沉积。     

精氨酸血管加压素在成骨细胞增殖分化中的作用及机制

研究精氨酸血管加压素(AVP)对小鼠成骨细胞增殖和分化的影响及作用机制。(1)原代分离的小鼠成骨细胞中,加入100 nmol/ L 的 AVP 培养72 h 后检测其对成骨细胞增殖作用的影响。(2)培养2、4、6、8、10 d 收集细胞培养液,并收集培养第10天的细胞裂解液,检测 AVP 对碱性磷酸酶(ALP)分泌的动态影响及细胞内 ALP 含量变化。(3)利用茜素红染色法检测 AVP 对培养8 d 和20 d 的成骨细胞形成钙结节的影响。(4)AVP 作用20 min,裂解细胞,利用放免法检测 AVP 对成骨细胞内 cAMP 的影响。结果显示,与对照组相比较,100 nmol/ L 能够促进小鼠原代成骨细胞增殖(P<0.01)。 AVP 能够使 ALP 的分泌量随着时间推移有显著增加(P<0.01);并增加成骨细胞形成钙结节数量和面积(P<0.01)。同时 AVP 能够促进胞内 cAMP 水平的增加(P<0.01)。结果提示 AVP 可能通过 cAMP 信号通路促进小鼠成骨细胞的增殖与分化。     

补骨脂素对成骨细胞核因子-κB受体激活配体和骨保护素表达的影响

目的研究补骨脂素(psoralen,PSO)对体外培养的小鼠成骨细胞(OB)分化及核因子-κB受体激活配体(receptor activator of nuclearfactor-κB ligand,RANKL)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的影响。方法取第1代BALB/c小鼠颅盖骨成骨细胞,将PSO以0.1、1、10μmol/L3种浓度分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中,MTT法观察各组药物对成骨细胞的增殖作用并绘制细胞生长曲线;用PNPP法测定成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;RT-PCR法检测成骨细胞OPG和RANKL的转录水平。结果细胞生长曲线显示各组成骨细胞数量均随时间延长而增加,中、高浓度PSO能显著提高成骨细胞的ALP活性,促进OPG、RANKL的表达(P<0.05),OPG/RANKL升高(P<0.05)。结论低浓度PSO(0.1μmol/L)对骨更新作用不明显,而中、高浓度PSO(1、10μmol/L)能通过上调OPG、RANKL mRNA表达及OPG/RANKL比例,促进成骨细胞的生成功能,增强骨更新。     

铁离子对人成骨细胞(hFOB1.19)生物活性影响

目的探讨铁离子对成骨细胞株(hFOB1.19)生物活性,包括碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity,APA)、细胞凋亡、钙结节、Ⅰ型胶原(type 1 collagen,COL 1)和骨钙素(osteocalcin,OC)的影响。方法成骨细胞(hFOB1.19)于5%CO234℃培养箱内培养,将不同浓度枸橼酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)50、100、200μmol/L和去铁胺(deferoxamine,DFO)5、10、20μmol/L分别加入细胞培养基中,MTT法检测成骨细胞增生活性;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;Von kossa染色法行钙结节染色;RT-PCR和Western blotting法分别检测COL1和骨钙素(bone gla protein,BGP)的基因及蛋白表达。结果 (1)48 h后增生活性:FAC组细胞增生活性随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P0.05),DFO组在5μmol/L浓度组时促进成骨细胞增生,在10、20μmol/L浓度组时抑制成骨细胞增生。(2)10 d时碱性磷酸酶活性:FAC组碱性磷酸酶活性随FAC干预浓度的增加而降低,DFO组碱性磷酸酶活性随DFO干预浓度的增加而升高(P0.05);(3)48 h时凋亡:FAC组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P0.05),DFO组在5、10μmol/L浓度时抑制细胞凋亡(P0.05),在20μmol/L则促进成骨细胞凋亡(P0.05);(4)21 d时钙结节染色:FAC组随铁离子干预浓度增加,成骨细胞矿化面积、钙结节形成数量均减少,DFO组在5、10μmol/L浓度时促进成骨细胞矿化功能,而20μmol/L浓度时对成骨细胞矿化有抑制效应;(5)3 d时基因及蛋白表达:FAC组COL1、BGP基因和蛋白的表达呈剂量依赖性下调(P0.05);DFO组COLⅠ、BGP基因的表达呈剂量依赖性上调(P0.05),DFO在5、10μmol/L浓度时促进COL1、BGP蛋白表达,在20μmol/L浓度时抑制COL1、BGP蛋白表达。结论不同浓度枸橼酸铁铵均抑制成骨细胞功能活性,提示高铁环境不利于成骨细胞的成骨功能。低铁环境对成骨细胞有双重效应,低剂量去铁胺对成骨细胞活性有促进作用,而高剂量去铁胺则对成骨细胞活性有抑制效应。     

氟化物对成骨细胞增殖和分化的影响

目的研究不同浓度氟化物对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响.方法经酶消化法从24h新生Wister乳鼠颅盖骨分离得到的成骨细胞经不同浓度的氟化钠(NaF)作用后,采用MTT法检测细胞增殖;PNPP法测定碱性磷酸酶(ALP)活性;放射免疫法测定培养液中骨钙素(BGP)含量.结果低浓度NaF(10-7mol/L～10-5mol/L)可刺激细胞增殖;高浓度NaF(10-4mol/L～10-3mol/L)则抑制细胞增殖.NaF对成骨细胞分化的影响则呈多样性.ALP的活性改变基本与细胞增殖率的变化相同,即各浓度NaF均促进细胞骨钙素分泌,与对照组相比有统计学意义.结论氟化物对成骨细胞的增殖及早期分化呈双向调节,即小剂量促进,大剂量抑制.但对其晚期分化呈一致性,即促进作用.     

脱氢表雄酮通过丝裂活化蛋白激酶途径促进成骨细胞增殖的研究

目的研究脱氢表雄酮(DHEA)促进成骨细胞增殖的作用和机制。方法取新生2～4d的BALB/c小鼠颅骨,用酶消化法进行成骨细胞原代培养,以细胞形态学和碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定。取传1代成骨细胞给予不同浓度DHEA,在不同培养时间后,应用光镜、电镜、四唑盐(MTT)法及流式细胞术(FCM)检测细胞的生长和增殖;同时用免疫印迹法检测磷酸化细胞外信号调控激酶(p44/42)的表达。结果10-8～10-6mol/L的DHEA可明显促进小鼠成骨细胞的生长和增殖,经10-7mol/LDHEA处理3d后的细胞,增殖指数明显增加(P<001);在10-9～10-6mol/L浓度范围内,DHEA能明显提高p44/42的表达,以10-8mol/L浓度的作用最佳(P<001),该作用可被U0126阻断。结论DHEA能够促进小鼠成骨细胞生长和增殖,其作用与激活丝裂活化蛋白激酶信号途径有关。     

依普拉芬对大鼠成骨细胞增殖分化及一氧化氮合成的影响

目的研究依普拉芬对新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖分化以及一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的影响。方法体外分离培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞,将不同浓度的依普拉芬加入培养液,测定细胞增殖情况、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化结节以及培养基中NO浓度。结果与阴性对照组相比,依普拉芬可增加成骨细胞数量(P<0.01),提高细胞的ALP活性和促进钙化结节形成,增加培养液中NO浓度(P<0.01)。其中,依普拉芬浓度在10~8~10~5mol/L之间作用最为显著。结论一定浓度的依普拉芬可以促进体外培养成骨细胞的增殖、分化的作用,这种作用可能是通过增加细胞内NO合成进行调控的。     

NO供体亚硝基化合物-18对大鼠成骨细胞的影响

目的 探讨NO供体亚硝基化合物-18(NOC-18)对大鼠成骨细胞增殖和分化、碱性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法 采用酶消化法和骨组织块法联合分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞，然后将不同浓度的NOC-18作用于大鼠成骨细胞，采用噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞增殖能力，测定细胞ALP活性。免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原蛋白的表达，观察NOC-18对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。结果 NOC-18可显著促进大鼠成骨细胞增殖，提高成骨细胞ALP活性和Ⅰ型胶原蛋白的表达。结论 适量浓度的NOC-18可通过刺激成骨细胞的增殖和分化，促进骨形成，为预防和治疗骨质疏松提供了理论和实验依据。     

VC拮抗氟对大鼠成骨细胞增殖分化影响的实验研究

目的研究不同剂量的氟对体外培养大鼠乳鼠颅骨成骨细胞增殖分化的影响及维生素C的拮抗作用.方法酶消化法分离成骨细胞;通过细胞对染料AlamarBlue摄取检测细胞增殖;比色方法测定碱性磷酸酶活性.结果氟化钠浓度100μmol/L～1 mmol/L刺激细胞增殖,2 mmol/L以上抑制细胞增殖;10～50μmol/L增强细胞ALP活力,100 μmol/L以上降低细胞ALP活力.加入VC,2mmol/L氟化钠仍能使细胞增殖分化.结论氟对成骨细胞的增殖与分化具有双向作用;VC能拮抗较高浓度氟化钠对成骨细胞增殖分化的抑制.     

含骨碎补总黄酮血清对新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化和矿化的影响

目的 探讨骨碎补总黄酮含药血清对新生SD大鼠成骨细胞增殖、分化、矿化的影响及其作用机制.方法 (1)骨碎补总黄酮含药血清的制备:选用12月龄雌性SD大鼠,药物灌胃,每日1次,连续12 d,末次灌药1.5 h后腹主动脉取血,分离血清备用.(2)实验模型的建立:采用二次酶消化法从新生SD大鼠颅骨获取成骨细胞,传代培养,取第3代成骨细胞为实验模型.(3)指标测定:①细胞增殖:用MTr法;②细胞分化:碱性磷酸酶(ALP)活性(PNPP法);骨钙素含量(放射免疫分析法);③细胞矿化:采用茜素红染色法,在40倍光镜下计矿化结节.结果 骨碎补总黄酮含药血清可刺激体外培养新生SD大鼠成骨细胞增殖,促进成骨细胞合成分泌ALP,且能增加成骨细胞骨钙素的分泌,促进矿化结节的形成.结论 骨碎补总黄酮可促进成骨细胞的增殖、分化和矿化,从而促进骨形成.     

氟在体外对兔成骨细胞增殖行为的影响

目的通过体外培养幼兔成骨细胞,观察不同浓度的氟对成骨细胞增殖行为的影响.方法用幼兔肋骨培养成骨细胞,纯化、鉴定.用不同浓度的氟化钠处理(20、160、240、400μmol/L),MTT法测定氟对成骨细胞增殖的影响;嗜银蛋白(AgNoRs)分析计数细胞核内AgNORs颗粒数.结果低浓度的氟(20μmol/L)在体外可促进成骨细胞增殖,而高浓度的氟(160、240、400 μmol/L)则抑制成骨细胞的增殖.低浓度氟处理组(20μmol/L)细胞核内AgNORs颗粒数显著多于对照组(P＜0.01);而高浓度氟处理组(240、400μmol/L)胞核内AgNORs颗粒数显著减少(P＜0.05).结论低浓度的氟可以促进成骨细胞的增殖,高浓度的氟抑制成骨细胞的增殖,氟对成骨细胞的作用具有双向性.     

成人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的研究

目的：通过成人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)体外定向诱导为成骨细胞，探讨理想而有临床实用价值的成人骨髓MSC体外诱导培养体系。方法：体外分离、扩增成人骨髓MSC，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。采用基础诱导培养液[地塞米松、β-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸加不同浓度的重组人转化生长因子-β1(recombinant human transforming growth factor—betal，rhTGF-β1)]诱导成人骨髓MSC体外分化为成骨细胞。利用倒置光学显微镜、透射电镜、四甲基偶氮唑盐(MTT)比色、碱性磷酸酶(ALP)染色、ALP活性测定等方法研究成人骨髓MSC增殖和分化情况。结果：成人骨髓MSC的增殖和分化作用和rhTGF-β1有剂量依赖关系，低浓度时促进增殖，高浓度抑制增殖，5μg／L浓度达到高峰，其浓度升高促进MSC分化。结论：含有rhTGF-β1 5μg／L的基础诱导培养液是理想且有临床实用价值的成人骨髓间充质干细胞体外诱导为成骨细胞的培养体系。     

PPARγ2内源性配体15d-PGJ_2对成骨细胞骨代谢相关基因表达的影响

目的研究不同浓度15d-PGJ_2对大鼠成骨细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)及骨代谢相关基因核因子-κB活化受体配体(RANKL)、碱性磷酸酶(ALP)及骨保护素(OPG)mRNA表达水平的变化,探讨PPARγ2内源性配体15d-PGJ_2对成骨细胞骨代谢相关基因表达的影响。方法体外培养大鼠成骨细胞,加入不同浓度15d-PGJ_2(0、10、20、30μmol/L)干预24小时后,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测成骨细胞PPARγ2、RANKL、ALP及OPG mRNA表达水平,比较不同浓度15d-PGJ_2对成骨细胞骨代谢相关基因mRNA表达的影响。结果不同浓度15d-PGJ_2呈剂量依赖性下调RANKL、ALP及OPG mRNA的表达水平,而呈剂量依赖性上调PPARγ2 mRNA的表达水平,组间比较差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论 15d-PGJ_2可能通过激活PPARγ2转录活性抑制成骨基因mRNA的表达,参与增龄相关的骨质疏松的发病过程。     

罗格列酮联合甘精胰岛素对前成骨细胞的影响

将小鼠MC3T3-E1成骨样细胞传代培养后分为8组:正常对照组(NC);成骨诱导对照组(OI);罗格列酮5μmol/L组(R5);罗格列酮10μmol/L组(R10);甘精胰岛素10-7mol/L组(G10-7);甘精胰岛素10-8mol/L组(G10-8);罗格列酮5μmol/L+甘精胰岛素10-8mol/L组(R5+G10-8)及罗格列酮10μmol/L+甘精胰岛素10-7mol/L组(R10+G10-7)。分别测定MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性及增殖能力。结果与正常对照组比较,R10组能抑制前成骨细胞的增殖。而R10+Q108组与R10组相比,能对抗罗格列酮的抑制细胞增殖的作用,使细胞数目增加,P0.05。与正常对照组比较,OI组能刺激前成骨细胞分泌碱性磷酸酶,与正常对照组相比,2个浓度的罗格列酮与甘精胰岛素均减少了ALP的活性。而且罗格列酮组ALP活性的下降比甘精胰岛素组明显。高浓度联合用药组ALP活性也明显低于对照组,但是联合用药组ALP活性值比罗格列酮单药组高,R5+G10-8组ALP活性值和R5组相比,(P0.05)。结论:罗格列酮能抑制前成骨细胞增殖,甘精胰岛素能对抗罗格列酮抑制细胞增殖的作用;罗格列酮与甘精胰岛素均可抑制前成骨细胞分化,甘精胰岛素与罗格列酮联用,能对抗罗格列酮抑制前成骨细胞分化的作用。