采用罗丹明123对肝癌细胞系MHCC97(Rholow)干细胞亚群的分离及鉴定

目的 建立分离肝癌细胞系MHCC97细胞中对罗丹明123染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌干细胞和异质性研究中的意义.方法 利用流式细胞分选术(FCM)并结合不同浓度的罗丹明123(Rho123)染料,分析和分选肝癌细胞系MHCC97细胞中具有不同染料排斥能力的肝癌细胞亚群,再通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法,以比较不同肝癌细胞亚群的差异.结果 根据不同染料排斥能力可以将肝癌细胞系MHCC97细胞分为Rholow和Rhohigh2个亚群,2个亚群在增殖能力、克隆形成率以及甲胎蛋白(AFP)和角蛋白-19(CK-19)表达以及裸鼠成瘤实验上差异有统计学意义,Rholow亚群具有干细胞特性.结论 罗丹明123结合FCM可以富集具有干细胞特性的Rholow亚群,同时为进一步揭示肝癌异质性机制奠定基础.     

骨髓间充质干细胞对人肝癌细胞系MHCC97-H增殖能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSC)对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 人肝癌细胞系MHCC97-H培养液中分别加入0、25%和50%MSC的条件培养基(MSC-CM),采用CyQUANT细胞增殖实验检测吸光度A值变化.在MHCC97-H细胞培养液中添加50%MSC-CM,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67抗原的变化.16只裸鼠皮下接种MHCC97-H细胞后,实验组经静脉注射MSC,1×106个/次,每周3次,对照组静脉注射PBS;比较肿瘤体积.结果 培养液中加入MSC-CM后A值依次为211.65±54.72、236.24±57.15和283.59±62.16(P<0.05).PCNA和Ki-67的表达水平分别升高1.8和7.0倍.实验组肿瘤体积(1745±455)mm3m大于对照组(972±568)mm3(P<0.05),肿瘤体积平均增加速度(56.0±26.1)mm3/d高于对照组(32.4±14.5)mm3/d(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞可促进肝癌细胞系MHCC97-H的增殖.     

人肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞初探

目的 从人肝癌细胞系MHCC97H中分选侧群细胞,探索其形态、表型和功能特征.方法 利用流式细胞仪从MHCC97H中分选得到侧群细胞,用相差显微镜和透射电镜观察其形态学特点;Western blotting观察其ABCG2表达;用流式细胞仪评估侧群细胞与干细胞基因CD133、CD117的关系;用克隆形成实验和NOD/SCID接种实验分别观察侧群细胞体外增殖和体内成瘤情况.结果 侧群细胞体积较小,呈圆形或短梭形;侧群细胞的细胞器如线粒体、内质网等明显少于非侧群细胞;流式检测显示侧群细胞中含有CD133、CD117阳性细胞;Western blotting显示侧群细胞和非侧群细胞中均有ABCG2表达,两者无明显差异;平板克隆形成实验显示SP具有较强的克隆形成能力;体内移植实验显示2000个SP细胞即能在体内形成肿瘤.结论 肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞具有肿瘤干细胞样细胞的表型和特性;ABCG2可能不是决定肝癌侧群细胞表型的主要因素.     

非接触状态下小鼠胚胎干细胞在小鼠肝癌细胞H22诱导下分化的动态观察

目的 观察小鼠源性肿瘤细胞分泌的细胞因子对小鼠胚胎干细胞(ES cells)的诱导分化.方法 将 ES细胞形成的拟胚体分为诱导组和对照组.诱导组在加入小鼠肝癌细胞H22上清液制成的条件培养基中生长,对照组在去除白血病抑制因子(LIF)的ES细胞培养液中生长.于诱导分化的第7、9、12、15天在倒置显微镜下动态观察两组分化情况,并分别测量上清液中AFP的含量.结果 诱导分化的第7天观察到诱导组拟胚体细胞群落的中心和周边有较为典型的小鼠肝癌样细胞形成,第9、12、15天肝癌样细胞数量逐渐增加.对照组拟胚体向三胚层细胞分化,未见肝癌细胞形成.第9,12,15天诱导组和对照组AFP含量经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05).结论 小鼠胚胎干细胞在小鼠肝癌细胞H22分泌的细胞因子的诱导下可以分化为肝癌细胞.     

内源性大麻素诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡中Caspase-3的作用

目的 检测内源性大麻素(AEA)是否诱导人肝癌高转移细胞株MHCC97H细胞凋亡、以及Caspase-3在细胞凋亡过程中的作用.方法 分别于AEA(100 μmol/L)作用细胞前后,应用Annexin V Binding方法 、流式细胞仪检测细胞凋亡率;荧光活性检测试剂盒检测细胞Caspase-3活性;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 ,检测Caspase-3、bcl-2及bax的mRNA表达.结果 AEA作用细胞3、6、12、24 h,细胞凋亡率分别为(14.13±2.17)%、(27.04±3.21)%、(34.98±7.74)%及(81.35±9.71)%,其中24 h的细胞凋亡率与对照组(12.72±0.44)%比较,差异有统计学意义(P<0.01).AEA作用细胞24 h,细胞的Caspase-3活性由142.0±5.8增加至226.0±6.4(P<0.01);Caspase-3 mRNA的表达由0.24±0.13升高至0.54±0.32(P<0.05);如预先加入Caspase-3抑制剂(Z-VAD-FMK)后再加入AEA,则细胞的Caspase-3活性不再升高90.0±4.3.RT-PCR方法 未检测到bcl-2 mRNA及bax mRNA的表达.结论 AEA对人肝癌高转移细胞MHCC97H具有凋亡诱导作用,Caspase-3参与了凋亡的调控.     

CD133作为肝癌干细胞表面标记的初步研究

目的 研究人肝癌SMMC7721和bcl-7402细胞株中CD133的表达,探讨CD133作为肝癌干细胞表面标记的可能性.方法 采用流式细胞仪检测SMMC7721和bcl-7402细胞株中CD133的表达;免疫磁珠细胞技术分离SMMC7721和bcl-7402细胞株中CD133阳性和CD 133阴性细胞,检测其细胞周期,观察并采用单因素方差分析和u检验分析体外培养过程中CD133阳性和CD133阴性细胞的细胞形态、增殖和分化能力的差异.结果 CD133阳性细胞在SMMC7721和bcl-7402细胞株中所占比例分别为0.7%～1.0%、1.7%～8.9%;流式细胞仪检测显示两种细胞株中处于G0/G1期的CD133阳性细胞分别为85.3%、89.4%,明显高于CD133阴性细胞和未分选细胞(F=14.49,38.84,P<0.05);CD133阳性细胞体外增殖能力强于相同条件下CD133阴性细胞和未分选细胞,在1～3 d和5～7 d曲线变化更明显(F=49.32,784.04,89.91,152.83,P<0.05);体外培养过程中,CD133阳性细胞的比例逐日下降,至扩增的第15天,与未分选细胞含量相似(u=0.271,P<0.05).结论 人肝癌SMMC7721和bcl-7402细胞株中,CD133阳性细胞体外增殖和分化能力较强,CD133是肝癌干细胞的表面标记之一.     

人肝癌细胞系MHCC97中趋化因子差异表达研究

目的 检测人肝癌细胞系MHCC97-L和MHCC97-H中趋化因子的mRNA表达水平,了解不同转移潜能的癌细胞系在组成性表达趋化因子方面的异同,寻找影响癌细胞生长、侵袭和转移的关键性趋化因子。方法 收获不加任何刺激的转移性由低到高的人肝癌细胞MHCC97-L和MHCC97-H。AGPC法提取总RNA,以持家基因GAPDH为对照,逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)分析C、CC、CXC和CX3C族趋化因子代表的XCL1(Ltn)、CCL5(RANTES)、CXCL8(IL-8)、CX3CL1(Fkn)等的mRNA水平。结果 代表不同家族的4种趋化因子基因在两种细胞系中均呈组成性表达,但XCL1和CCL5在两种细胞系中的表达差异有显著性(P=0.021,P=0.042)。结论 肝癌细胞可组成性地表达目前所知的4个家族的趋化因子,其表达水平可因癌细胞的转移潜能不同而异,提示具有不同结构特征的趋化因子可能以自分泌或旁分泌方式参与癌细胞生长及转移的调节,进一步阐明这些趋化因子产生的意义及其调控机制是有必要的。     

野菊花提取物对人肝癌MHCC97H细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察中药野菊花提取物(chrysanthemum indicum extact,CIE)对人肝癌MHCC97H 细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人肝癌MHCC97H细胞,以0.4、0.8、1.2 mg/ml的CIE(实验1、2、3组)作用于MHCC97H细胞,并设立空白对照组.分别于药物作用24、48、72 h时,应用MTT法检测细胞增殖情况.于药物作用24 h时,用AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡、Rhol23检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;Western blot检测细胞色素C、Caspase-9、-3的蛋白表达.结果 三种浓度的CIE对MHCC97H细胞的增殖均有明显的抑制作用,且呈明显的时间和浓度依赖性.与对照组相比,各实验组MHCC97H细胞的凋亡率明显增高(P＜0.05),线粒体膜电位水平明显降低(P＜0.05),细胞色素C、Caspase-9和-3的蛋白表达显著增强(P＜0.05),以上各项均呈明显的量效关系.结论 野菊花提取物对肝癌MHCC97H的增殖具有抑制作用,这可能与药物诱导肝癌细胞凋亡有关.线粒体途径可能是CIE诱导MHCC97H细胞凋亡的主要机制之一.     

骨化三醇加碘油抑制人肝癌MHCC97细胞的研究

目的探讨骨化三醇加碘油对MHCC97肝癌细胞增殖能力的影响及其对肝细胞生长因子（HGF）及受体c-met表达的调控作用。方法分别用10^-6～10^-9mol/L的骨化三醇、0.5%的碘油＋10^-6mol/L浓度的骨化三醇及单用0.5%的碘油处理人肝癌MHC97-H、MHC97-L细胞系,分别作用48、72、96h后,MTT法检测细胞的增殖能力。用骨化三醇、碘油＋骨化三醇处理细胞72h后,酶联免疫法（ELISA）定量测定细胞上清HGF浓度;逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测肝癌细胞内维生素D受体（VDR）及c-met mRNA表达。结果MHCC97-H、L两株细胞系均有维生素D受体（VDR）表达。骨化三醇对MHCC97-H、L两株细胞均有不同程度的增生抑制作用,以10^-6mol/L骨化三醇的浓度抑制效果最好,72h效果最佳。第4天碘油加骨化三醇对细胞增生的抑制作用强于单用骨化三醇。MHCC97-H、L细胞均有HGF的分泌,单用骨化三醇处理细胞后,HGF水平下降不明显,而加碘油作用于MHCC97-H细胞后,HGF水平下降明显（P=0.043）。两株细胞均表达c-met mRNA,而用骨化三醇处理细胞后,c-met mRNA表达明显减弱。结论骨化三醇抑制人肝癌细胞MHCC97的增生,骨化三醇对HGF/c-met表达的抑制作用可能是其抗肝癌机制之一;溶于碘油中的骨化三醇能发挥更为持久、有效的作用。     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞

肿瘤起源于干细胞的假说正在各种人类肿瘤中得到证实,肿瘤不单是一种基因病,而且是一种干细胞病,基因突变作用于干细胞,干细胞突变成为肿瘤干细胞,这是肿瘤发生、再生、转移和复发的关键。肝细胞癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中是否存在“肝癌干细胞”的问题一直倍受人们关注。该文介绍肿瘤干细胞与肝癌干细胞的研究情况。     

绿色荧光高/低转移人肝癌细胞株MHCC97-HG/LG的建立及鉴定

目的建立稳定自发绿色荧光的高、低转移人肝癌细胞株并明确鉴定。方法脂质体转染法将绿色荧光蛋白(GFP)基因分别转染至高、低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L内,经 G418反复筛选并单克隆化,得到两株新细胞株MHCC97-HG／LG,对新细胞株GFP表达稳定性、生物学特性、体内外侵袭转移能力及肿瘤血管生成等进行鉴定。结果 MHCC97-HG／LG在体外培养或裸鼠体内接种36 d后均能稳定表达绿色荧光。MHCC97-HG肝、肺转移率均为100％,较 MHCC97-LG及其父系体内外侵袭转移能力显著增强(P<0．01),其原位肿瘤微血管密度较 MHCC97-LG显著增加[(121．0±15．9)／HP vs(87．0±14．2)／HP,P<0．01]。体视荧光显微镜可实时观察裸鼠体内MHCC97-HG／LG种植瘤生长、转移及血管形成情况。结论 MHCC97-HG／LG及其动物模型在肝癌转移机制、肿瘤血管生成等诸多研究领域可能有较广阔的应用前景。     

内源性大麻素对人肝癌细胞生长及黏附和侵袭性的影响

目的 观察内源性大麻素(AEA)对人肝癌高转移细胞MHCC97H细胞生长、黏附、侵袭性等的抑制作用.方法 不同浓度AEA(100、50、0μmol/L)作用细胞后,应用体外细胞-基质黏附实验方法,检测细胞对Fibronectin黏附能力的改变;应用体外细胞趋化实验和侵袭实验,检测细胞的运动功能及对人工基底膜的侵袭能力;应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长抑制率.结果 (1)不同浓度的AEA(100、50、0 μmol/L)作用细胞3、6、12 h后,细胞黏附抑制率分别为:3 h(24.4%、20.6%和20.8%)、6 h(23.6%、21.3%和19.6%)及12 h(25.2%、24.1%和22.8%),组间及组内比较差异无统计学意义(P＞0.05).(2)100μmol/L的AEA作用细胞48 h后,平均每个视野的透膜细胞数为(13.00±4.30)个,与对照组(15.70±3.30)个比较,差异无统计学意义(P＞0.05);平均每个视野的侵袭细胞数为(4.10±1.65)个,与对照组(3.40±1.24)个比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(3)不同浓度的AEA(100、50、0μmol/L)作用细胞24 h后,细胞生长抑制率分别为(39.30 ±9.17)%、(35.60±8.25)%和(28.70±0.04)%,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AEA对体外生长的人肝癌细胞MHCC97H的生长、黏附和侵袭性等方面无明显抑制作用.

Abstract：

Objective To evaluate the inhibitory effects of anandamide (AEA) on proliferation and adhesion and invasion in human hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H. Methods Mmethyl thiazol tetrazolium (MTT) method, cell-matrix adhesion assay, and Transwell invasion chamber and matriger were used to analyze the effect of AEA on proliferation ability, adherence ability, and migration,chemotaxis and invasion of MHCC97H cells, respectively. Results After MHCC97H cells were treated with AEA at the different concentrations (100, 50, 0 μmol/L) for 3, 6 and 12 h, the inhibition ratio of cell adhesion was 24.4%, 20.6% and 20.8% for 3 h, 23.6%, 21.3% and 19.6% for 6 h, and 25.2%, 24.1% and 22. 8% for 12 h, respectively (P＞0.05). After MHCC97H cells were treated with AEA (100 μmol/L) for 24 h, the migration, adhesion and invasion was not markedly inhibited (P＞0. 05 ). Conclusion AEA did not show inhibition effects on adhesion, invasiveness and proliferation of MHCC97H cells.     

FAK的阻断对MHCC97肝癌细胞侵袭性的影响

目的 通过对MHCC97肝癌细胞株的FAK基因的表达进行干预，观察MHCC97肝癌细胞侵袭转移能力的变化。方法 用Oligofec TAMINE介导的方法，将反义FAK ODN引入MHCC97肝癌细胞株，或用Genistein抑制MHCC97肝癌细胞FAK磷酸化方法，观察经过不同干预后的MHCC97肝癌细胞穿透Matrigel胶处理后的Transwell小室的活力变化，比较MHCC97肝癌细胞转染反义FAK ODN前后和用Genistein抑制磷酸化前后，细胞侵袭转移能力的变化。结果 反义FAK ODN转染的肝癌细胞和用Genistein干预的肝癌细胞穿过Matrigel胶的能力减弱。结论抑制FAK的表达能影响肝癌细胞的侵袭转移能力。     

STAT1过表达慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的：构建STAT1基因过表达慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。方法：根据人STAT1基因mRNA序列,全基因合成STAT1基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞DH5OC,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用荧光定量PCR和Westernblot检测原始细胞株（MHCC97L）,稳转细胞株（MHCC97－statl）中STAT1的表达情况,确定STAT1过表达的有效性。结果：测序证实STAT1基因过表达载体构建成功。过表达慢病毒包装成功。慢病毒转染人肝癌细胞MHCC97L48h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达显著增加。结论：STAT1基因过表达慢病毒载体构建成功,并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

Objective To investigate the effects of Pseudomonas aeruginosa vaccine (PA) on proliferation and invasiveness of the hepatocellular carcinoma cell line MHCC97L with metastatic potential. Methods Proliferation, growth curve, plate efficiency, flow cytometry, transwell invasion assay, cell motility assay, scarification test, vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) protein activity were evaluated after cells were treated with PA at various concentrations. Results PA can inhibit the proliferation and plate efficiency of MHCC97L cell markedly in a dose-dependent manner. The IC50 of cells treated with PA for 48 h and 72 h was 3.1 ×108/ml and 1.9 × 108/ml, respectively. The doubling time increased and plate efficiency decreased gradually when cells treated with 0.5 × 108/ml, 1 × 108/ml and 2 × 108/ml PA (P＜0.01). PA could induce cell cycle arrest at the G1 phase in a dose-dependent manner by flow cytometric analysis. The average amount of invading cell per field in cell invasion assay and motility assay were 4. 8 ± 1.3 and 8. 8±2.2 when cells treated with 1× 108/ml PA, which was significantly lower than that of control group (8. 6±2. 1 and 15. 6±1.2 ) (P＜0.01) Scarification test showed that the metastatic ability of cells treated with 1 × 108/ml PA significantly lower than that in the control group. Comparison between cells treated with 1 × 108/ml PA and control group, no remarkable difference was found regarding expression of VEGF and MMP2 in supernatant of cell culture. Conclusion PA can inhibit proliferation and plate efficiency of HCC cell line MHCC97L, which is in part mediated by the cell cycle arrest at the G1 phase. PA could inhibit invasiveness of HCC cell line MHCC97L, which is unrelated to the VEGF and MMP2 protein activity.