采用罗丹明123对肝癌细胞系MHCC97(Rholow)干细胞亚群的分离及鉴定

目的 建立分离肝癌细胞系MHCC97细胞中对罗丹明123染料具有不同排斥能力细胞亚群的方法,并探讨其在肝癌干细胞和异质性研究中的意义.方法 利用流式细胞分选术(FCM)并结合不同浓度的罗丹明123(Rho123)染料,分析和分选肝癌细胞系MHCC97细胞中具有不同染料排斥能力的肝癌细胞亚群,再通过细胞生长的测定、软琼脂克隆形成以及免疫组织化学检测和裸鼠成瘤实验等方法,以比较不同肝癌细胞亚群的差异.结果 根据不同染料排斥能力可以将肝癌细胞系MHCC97细胞分为Rholow和Rhohigh2个亚群,2个亚群在增殖能力、克隆形成率以及甲胎蛋白(AFP)和角蛋白-19(CK-19)表达以及裸鼠成瘤实验上差异有统计学意义,Rholow亚群具有干细胞特性.结论 罗丹明123结合FCM可以富集具有干细胞特性的Rholow亚群,同时为进一步揭示肝癌异质性机制奠定基础.     

人肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞初探

目的 从人肝癌细胞系MHCC97H中分选侧群细胞,探索其形态、表型和功能特征.方法 利用流式细胞仪从MHCC97H中分选得到侧群细胞,用相差显微镜和透射电镜观察其形态学特点;Western blotting观察其ABCG2表达;用流式细胞仪评估侧群细胞与干细胞基因CD133、CD117的关系;用克隆形成实验和NOD/SCID接种实验分别观察侧群细胞体外增殖和体内成瘤情况.结果 侧群细胞体积较小,呈圆形或短梭形;侧群细胞的细胞器如线粒体、内质网等明显少于非侧群细胞;流式检测显示侧群细胞中含有CD133、CD117阳性细胞;Western blotting显示侧群细胞和非侧群细胞中均有ABCG2表达,两者无明显差异;平板克隆形成实验显示SP具有较强的克隆形成能力;体内移植实验显示2000个SP细胞即能在体内形成肿瘤.结论 肝癌细胞系MHCC97H中侧群细胞具有肿瘤干细胞样细胞的表型和特性;ABCG2可能不是决定肝癌侧群细胞表型的主要因素.     

缺氧增加肝癌细胞胚胎干细胞基因表达促进恶性转化

目的 研究缺氧对原发性肝癌恶性表型的影响及相关机制.方法 建立体内、外缺氧模型,比较缺氧对MHCC97H肝癌细胞成瘤和侵袭转移能力的影响,并通过检测细胞增殖周期,CD90、CD133标记的肝癌干细胞数量以及胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)样基因Oct4,Nanog,Sox2等的表达分析缺氧对肝癌细胞生物学特性的影响.结果 缺氧促进MHCC97H肝癌细胞运动(t=2.792,P=0.023)、侵袭(t=7.624,P＜0.0001)、转移(x~2=5.507,P=0.031)潜能,并增加软琼脂集落形成(t=3.292,P=0.011)和裸鼠皮下成瘤率(x~2=8.571,P=0.015).在缺氧环境中,MHCC97H肝癌细胞增殖能力受到抑制,G1期细胞比例显著增加,Oct4,Nanog,Sox2等基因表达明显上调.结论 缺氧促进MHCC97H肝癌细胞成瘤和转移等恶件表型与获得胚胎干细胞样特征有关.     

肠癌SW-620肿瘤细胞SP亚群研究

目的 观察肠癌细胞株SW-620中肿瘤干细胞相关的SP(side population)亚群比例,分选出相关的SP和NSP细胞,并鉴别相关的SP是否具有干细胞某些生物学特性.方法 制备SW-620细胞悬液,经Hoechst33342和PI染色(其中对照组同时加入拮抗剂维拉帕米),流式细胞仪分析SP亚群.通过流式细胞仪分选出肠癌细胞株SW-620中SP细胞.克隆形成实验和噻唑蓝(MTT)实验检测SP和NSP细胞增殖能力的差异.裸鼠体内成瘤对比实验验证SP细胞和NSP细胞致瘤性.结果 SP亚群占SW-620细胞的1.0%左右,维拉帕米阻断后减少为0.01%左右.流式细胞仪分选出SP细胞7.5×105个,大部分为NSP细胞.克隆形成实验和MTT证实SP细胞和NSP细胞增殖能力有差异.裸鼠体内成瘤实验发现:1×105个SP细胞可以致裸鼠成瘤,1×105个NSP细胞及以下数量级别细胞不能致裸鼠成瘤.结论 人肠癌细胞株SW-620中存在SP亚群细胞,维拉帕米可抑制染料外排而明显减少SP细胞的比例.可以通过流式细胞仪分选出SP细胞,通过克隆形成实验和MTT实验检测SP和NSP细胞增殖能力有差异.裸鼠成瘤对比实验证实SP比NSP细胞更具致瘤性.     

高/低转移人肝癌细胞株MHCC97-H/L中侧群细胞分析

目的观察高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L是否存在侧群（SP）细胞并鉴定其致瘤性。方法MHCC97-H／L予Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）荧光染色；流式细胞分选MHCC97．H／L中SP细胞，分选后细胞皮下接种非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠，观察成瘤情况。结果Hoechst33342和CFSE染色结果显示，MHCC97-H／L中未染色细胞分别为（4．02±0．02）％／（1．02±0．01）％，流式细胞分选结果示MHCC97-H／L中sP细胞为（4．88±0．66）％／（0．88±0．36）％，比例差异有统计学意义（P〈0．05）。体内成瘤实验显示，SP细胞只需1×10。个即可在NOD／SCID小鼠皮下成瘤（5／6），而1×10^6个非SP细胞均未成瘤（0／6）。结论高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L中均存在SP细胞亚群，但前者比例显著高于后者。肝癌SP细胞具有极高的致瘤性，并可能和肝癌转移潜能相关。     

绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨绿脓杆菌制剂(pseudomonas aeruginosa vaccine,PA)对有转移潜能的人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 采用不同浓度的PA分别作用于MHCC97L细胞,观察细胞增殖、生长曲线、克隆形成率、流式细胞术分析(FCM)、侵袭、运动、迁移、VEGF和MMP2蛋白表达(ELISA法).结果 PA明显抑制MHCC97L细胞增殖和克隆形成,呈良好的剂量-效应关系.PA 48 h和72 h的IC50分别为3.1×108/ml和1. 9×108/ml.PA浓度为0.5×108/ml、1×108/ml和2×108/ml时,其细胞倍增时间依次增加,克隆形成率依次降低(P均＜0.01);FCM显示,G1期细胞比例随PA浓度增加而增加,S+G2期细胞比例随PA浓度增加而降低(P均＜0.01).PA浓度为1×108/ml时,穿过人工基底膜(侵袭实验)和上室底膜(运动实验)的细胞数(分别为4.8±1.3和8.8±2.2)明显低于对照组(8.6±2.1和15.6±1.2)(P均＜0.01);细胞经72 h培养后,对照组划痕逐渐愈合,1×108/ml的PA组细胞划痕依然明显.ELISA法检测发现,1×108/ml的PA组其VEGF蛋白和MMP2蛋白含量和对照组相比均无明显差异(P均＞0.05).结论 在一定条件下,绿脓杆菌制剂可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成,其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现的;绿脓杆菌制剂可以明显抑制MHCC97L细胞的侵袭、运动和迁移能力,其作用和VEGF、MMP2蛋白分泌关系不明显.     

细胞株源人前列腺肿瘤干细胞的分选与鉴定

目的:论证人前列腺癌(prostate cancer,PCa)细胞株中是否存在干细胞亚群。方法:分别用免疫表型法和侧群(side population,SP)细胞法从5种人PCa细胞株(Du145、IA8、LNCaP、TSU-PrL和PC-3)中富集类干细胞,再应用软琼脂克隆形成试验初步验证类干细胞亚群的体外生长方式及成瘤能力。选择LNCaP源SP细胞(LNCaP/SP),依次采用免疫细胞化学技术、Transwell、MTT以及裸鼠致瘤试验,分别检测其干细胞标记物的表达情况、鉴定其体外增殖和侵袭能力以及动物体内的致瘤和转移潜能。结果:5种细胞株中均难以分选出免疫表型为CD133+CD44+的细胞亚群。除PC-3外,其余4株细胞可分选出呈现典型克隆性生长特点的SP细胞。体外克隆形成率在IA8、LNCaP和TSU-PrL源SP细胞与非侧群(non-side population,NSP)细胞间有显著性差异(P<0.05)。与LNCaP/NSP相比,LNCaP/SP的体外增殖和侵袭能力显著增强,同时阳性表达整合素α2、Nanog、CD44、OCT4以及ABCG2等5种干细胞标记物。而且,LNCaP/SP的皮下成瘤率、骨转移率及瘤体体积亦显著高于LNCaP/NSP(P<0.01)。结论:SP分选法更适合富集人PCa细胞株中类干细胞,LNCaP/SP细胞是PCa细胞株LNCaP中的肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)。     

骨髓间充质干细胞对人肝癌细胞系MHCC97-H增殖能力的影响

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSC)对肝癌细胞增殖能力的影响.方法 人肝癌细胞系MHCC97-H培养液中分别加入0、25%和50%MSC的条件培养基(MSC-CM),采用CyQUANT细胞增殖实验检测吸光度A值变化.在MHCC97-H细胞培养液中添加50%MSC-CM,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67抗原的变化.16只裸鼠皮下接种MHCC97-H细胞后,实验组经静脉注射MSC,1×106个/次,每周3次,对照组静脉注射PBS;比较肿瘤体积.结果 培养液中加入MSC-CM后A值依次为211.65±54.72、236.24±57.15和283.59±62.16(P<0.05).PCNA和Ki-67的表达水平分别升高1.8和7.0倍.实验组肿瘤体积(1745±455)mm3m大于对照组(972±568)mm3(P<0.05),肿瘤体积平均增加速度(56.0±26.1)mm3/d高于对照组(32.4±14.5)mm3/d(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞可促进肝癌细胞系MHCC97-H的增殖.     

基因芯片筛选人肝癌细胞株MHCC97中血管生成拟态相关基因

目的 通过观察三维培养条件下高、低转移人肝癌细胞株MHCC97-H、MHCC97-L形成血管生成拟态(VM)的差异,探讨VM形成与细胞外基质和粘连分子相关机制.方法 建立MHCC97-H、MHCC97-L三维培养体系,倒置显微镜下观察血管样结构形成差异.以人脐静脉内皮细胞、无转移人肝癌细胞株Hep3B及正常人肝细胞株HL-7702作对照.应用细胞外基质和粘连分子基因芯片筛选MHCC97-H和MHCC97-L中差异表达的基因,并采用RT-PCR和Western blot验证芯片的结果.组间比较采用两样本t检验.结果 三维培养24h,MHC097-H形成的血管样结构长度为(474±16)mm/cm2,MHCC97-L为(320±41)mm/cm2,两者比较,差异有统计学意义(t=6.119,P＜0.05).Hep3B及HL-7702均不形成血管样结构.在113个细胞外基质和粘连分子相关基因中,MHCC97-H表达较MHCC97-L上调的有7个,下调的有3个.选取差异性表达的腱糖蛋白-C和细胞外基质蛋白1经RT-PCR及Western blot验证,结果与基因芯片结果基本一致.结论 高转移人肝癌细胞株MHCC97-H体外形成VM能力明显较低转移人肝癌细胞株MHCC97-L强,其原因可能与MHCC97-H差异表达某些细胞外基质和粘连分子相关基因有关.     

人胆囊癌细胞系GBC-SD侧群细胞致瘤特性的实验研究

目的 研究人胆囊癌细胞系GBC-SD侧群细胞(side population cells,SP)的致瘤特性。方法 利用流式细胞术从GBC-SD中分选SP、非SP细胞(non-SP),分别进行软琼脂克隆形成实验和非肥胖性糖尿病联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的移植瘤形成实验。通过流式细胞术检测5例人胆囊癌组织中SP细胞的比例。结果人胆囊癌细胞系GBC-SD中存在SP细胞,其比例约为0.87％;SP细胞的克隆形成率高于non-SP细胞（14.74％±3.53％比5.17％±1.05％,t=2.75,P＜0.05）。NOD/SCID小鼠移植瘤实验表明,5×103个SP细胞可成瘤(4/7),而non-SP细胞成瘤则需要1×105个细胞(1/7),且来源于SP细胞亚群的NOD/SCID小鼠移植瘤中存在SP、non-SP细胞。SP细胞存在于人胆囊癌组织中,其范围为0.27％～2.3％。结论来源于GBC-SD的SP细胞亚群具有类似肿瘤十细胞的高致瘤性。