携带flk1的重组减毒沙门氏菌的构建及其抗肿瘤血管生成的研究

目的:观察携带鼠血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,flk1)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌诱导的flk1特异性免疫应答及抗肿瘤血管生成作用.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-flk1,并将其转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,体外感染小鼠巨噬细胞,用Western印迹对表达产物进行鉴定,将重组菌口服免疫小鼠,分析免疫后小鼠体内的特异性CTL应答.采用藻酸盐微囊实验观察其对体内肿瘤血管生成的影响.结果:免疫印迹试验表明携带pcD-NA3.1-flk1表达载体的重组菌感染的小鼠巨噬细胞能表达flk1蛋白,免疫小鼠脾淋巴细胞产生针对flk1的特异性CTL活性.重组疫苗菌的免疫能够明显抑制小鼠体内肿瘤血管的形成.结论:携带flk1的重组减毒沙门氏菌经口服免疫,诱导小鼠产生抗flk1的特异性免疫反应,且能明显产生抗肿瘤血管生成作用.     

表达VEGFR-2的减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗诱导特异性抗胶质瘤血管免疫应答

背景与目的:血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)及其主要受体血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelialgrowth factorreceptor-2,VEGFR-2)在肿瘤新生血管和肿瘤基质形成过程中起着重要作用。本研究的目的是观察表达鼠VEGFR-2的重组减毒沙门氏疫苗菌诱导的抗血管特异性免疫应答及抗胶质瘤作用。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-VEGFR2,通过电转化法将pcDNA3.1-VEGFR2导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,经由胃管饲予C57BL/6J小鼠,对小鼠进行基因免疫。采用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗VEGFR2-IgG抗体,分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(cytotoxic T lym phocyte,CTL)应答。用携带pcDNA3.1-VEGFR2的重组沙门氏菌免疫治疗胶质瘤荷瘤小鼠,通过测量荷瘤小鼠肿瘤大小,检测肿瘤微血管密度及肿瘤细胞凋亡,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。结果:重组疫苗菌免疫后小鼠产生了高水平的抗VEGFR2-IgG抗体,诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对VEGFR2的特异性CTL活性。重组疫苗菌的免疫能够明显抑制胶质瘤的生长。NaH CO3对照组、载体对照组、重组疫苗菌组的平均微血管密度分别为26.5±5.8、27.2±4.5、8.8±1.9,平均凋亡细胞数分别为4.41.2、3.     

美洲大蠊提取物CⅡ-3对H22肝癌小鼠血管生成作用的研究

[目的]探讨美洲大蠊提取物CⅡ-3对H22肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用及其机制。[方法]将50只昆明种小鼠接种H22肝癌细胞,随机分为模型组、阳性组以及CⅡ-3低、中、高剂量组,比较各组抑瘤率、脏器指数以及VEGF含量。[结果]高剂量CⅡ-3对H22荷瘤小鼠肿瘤的生长有明显的抑制作用(61.41%),并且能降低小鼠血清中VEGF的含量(361.72±101.84ng/L)。[结论]CⅡ-3能抑制H22肝癌小鼠肿瘤的生长,并对肝癌小鼠的免疫器官有一定程度的保护作用,其机制可能与下调VEGF的表达而抑制肿瘤血管生成有关。     

人T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3基因疫苗肿瘤免疫研究

目的观察人T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3（SART3）基因的DNA疫苗能否诱导小鼠产生针对表达该基因肿瘤细胞的免疫反应。方法构建表达人SART3基因的C3H小鼠肿瘤细胞LM8-SART3。以空载体为对照,注射疫苗,分离小鼠脾细胞,体外检测CTL反应。于疫苗免疫后2周接种肿瘤细胞,比较免疫组与空载体组肿瘤长出及出瘤后肿瘤生长情况。结果体外可检测到疫苗诱导的小鼠脾细胞CTL活性;疫苗注射后小鼠成瘤率降低,肿瘤生长慢于对照组。结论表达人SART3基因的DNA疫苗可在一定程度上预防表达该基因的肿瘤细胞LM8-SART3在小鼠体内的成瘤及生长。     

口服DNA疫苗pcDNA3.1+/flk-1(n1-7)抗小鼠结肠癌肝转移

背景与目的：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其主要受体血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）在肿瘤血管生成过程中起着重要作用。VEG—FR-2在鼠中为flk-1，本研究以减毒沙门氏菌SL3261为载体制备了抗肿瘤血管生成口服DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（n1-7），研究该疫苗抗小鼠结肠癌肝转移的作用，并探讨其可能的作用机制。方法：RT—PCR法扩增鼠VEGFR-2胞外cDNA全长序列flk-1（n1-7），构建重组质粒pcDNA3．1＋／flk-1（n1-7）。将重组质粒转化减毒沙门氏菌SL3261，制备成以SL3261为载体的口服DNA疫苗。将18只小鼠随机分组，口服接种疫苗两周后，用CT-26细胞建立结肠癌肝转移动物模型，15d后处死小鼠，体视学方法计数肝脏的肿瘤结节数目。流式细胞仪检测小鼠外周血CD4^＋细胞和CD8^＋细胞变化。结果：构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）／flk-1（n1-7），制备成以SL3261为载体的口服DNA疫苗pcD—NA3．1（＋）／flk-1（n1-7）。疫苗组小鼠肝脏内的肿瘤转移病灶明显低于对照组，P〈0．05。结论：成功构建了重组质粒pcDNA3．1（＋）／flk-1（n1-7），制备成以SL3261为载体的口服DNA疫苗pcDNA3．1（＋）／flk-1（n1-7）。这种疫苗能抑制小鼠结肠癌的肝脏转移。     

白细胞介素-17过表达胃癌细胞 在小鼠体内的成瘤效应研究

目的：建立小鼠荷瘤模型,研究白细胞介素-17（IL-17）过表达的胃癌细胞在小鼠体内的成瘤效应。方法：分别以MFC、MFC/pcDNA3.1和MFC/IL-17细胞接种615小鼠,细胞浓度为5×10⁶个/mL,按每只200 μL注射于小鼠背部皮下。每组10只,观察小鼠皮下肿瘤生长情况。3周后处死小鼠,分别采用RT-PCR和Western blot法检测肿瘤组织内IL-17、VEGF、Podoplanin mRNA和蛋白表达;免疫组化法检测微血管密度。结果：MFC/IL-17组小鼠于接种后5~7 d开始形成肿瘤结节,且生长迅速,肿瘤质量为（5.384±0.391）g,大于MFC组[（1.726±0.445）g]和MFC/pcDNA3.1组[（2.064±0.397）g]（P < 0.05）。RT-PCR和Western blot结果显示,与MFC和MFC/pcDNA3.1组相比,MFC/IL-17组小鼠肿瘤组织内IL-17、VEGF、Podoplanin mRNA和蛋白表达均明显增加（P < 0.05）。免疫组化结果显示,与MFC和MFC/pcDNA3.1组相比,MFC/IL-17组小鼠肿瘤组织内微血管密度明显增加（P < 0.05）。结论：IL-17可能通过上调VEGF、Podoplanin和CD31的表达促进血管和淋巴管形成,加速肿瘤生长。     

自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究

目的 研究自噬基因Beclin1在宫颈癌细胞株HeLa中过表达对HeLa细胞体内外生长的影响.方法 构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Beclin1,转染HeLa细胞[pcDNA3.1(+)-Beclin1组],同时设空载体转染组[pcDNA3.1(+)组]和空白对照组.采用荧光定量PCR和Western blot法检测3组HeLa细胞中Beclin1 mRNA和蛋白的表达变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3组HeLa细胞生长的变化,采用流式细胞术检测3组HeLa细胞的凋亡情况,采用单丹磺酰尸胺染色检测3组HeLa细胞的自噬情况.将3组HeLa细胞分别接种于裸鼠皮下,观察体内成瘤性和生长情况.结果 pcDNA3.1(+)-Beclin1组、pcDNA3.1(+)组和空白对照组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平分别为994.718 ±468.764、0.570±0.121和0.736±0.251.pcDNA3.1 (+ )-Beclin1组HeLa细胞中Beclin1 mRNA的表达水平较pcDNA3.1(+)组和空白对照组明显增高(P＜0.05),而pcDNA3.1(+)组与空白对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05);3组HeLa细胞中Beclin1蛋白的表达情况与mRNA相似.pcDNA3.1(+)-Beclin1组的自噬细胞率为10.9％,明显高于空白对照组和pcDNA3.1(+)组(分别为2.5％和3.1％,P＜0.05).pcDNA3.1(+)-Beclin1组HeLa细胞的凋亡率为(28.2±2.3)％,明显高于pcDNA3.1(+)组和空白对照组[分别为(14.6±4.6)％和(11.2±3.0)％,P＜0.05].Beclin1在HeLa细胞中过表达可抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.7％;并可使HeLa细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积和重量明显小于pcDNA3.1 (+)组和HeLa组(P＜0.05),抑瘤率为52.2％.结论 自噬基因Beclin1过表达可抑制HeLa细胞在体内外的增殖,促进细胞的自噬与凋亡,为宫颈癌基因治疗提供了新的选择途径.     

核心蛋白聚糖基因对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响及抗肿瘤作用

目的 探讨核心蛋白聚糖(DCN)基因对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响及其抗肿瘤作用.方法 昆明小鼠24只,每组8只,建立S180实体移植瘤模型,随机分为生理盐水组(阴性对照组)、pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)-DCN转基因治疗组,于接种瘤细胞第2天瘤内注射用药,第5天起隔天测量小鼠肿瘤体积,并采用MTF法检测T淋巴细胞转化能力、RT-PCR检测TGF-β mRNA转录水平、ELISA测定血清VEGF的变化.结果 与前两组相比,重组载体组肿瘤体积缩小为(2.219±0.105)cm3(P＜0.001);淋巴细胞增生率提高为(67.21±6.32)%(P＜0.01,P＜0.05);同时使TGF-β表达降低,条带变淡;VEGF表达也明显下调,其A值降为2.6175±0.099(P＜0.01,P＜0.05).结论 肿瘤组织内DCN能够显著抑制肿瘤细胞生长,提高荷瘤小鼠免疫系统的活性.     

异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

背景与目的:肿瘤的生长、转移和新生血管生成有密切关系,血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是已知作用最强、最专一的促血管生成因子。本实验采用噬菌体展示技术,构建人血管内皮生长因子重组T7噬菌体疫苗,并检验疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑制作用。方法:用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人肺癌组织克隆出人VEGF165基因,将人VEGF165基因与T7Select10-3b噬菌体基因重组,构建T7Select10-3b_VEGF噬菌体疫苗,制备噬菌体效价达到1×1013pfu/ml。将C57BL/6J小鼠随机分为3组,T7-VEGF疫苗组10只、空白噬菌体组(T7)10只、生理盐水组(NS)10只。将各组样品与等体积弗氏佐剂混合,各组小鼠每只每周分别免疫1×1012pfu/200!l重组噬菌体疫苗、空白噬菌体、生理盐水,共免疫4周。接种Lewis肺癌细胞,观察肿瘤的生长情况和小鼠状态.接种肿瘤14天后,处死小鼠,剥离肿瘤称重,检测小鼠血清中特异性抗VEGF抗体滴度、肿瘤微血管密度(microvesseldensity,MVD)。结果:T7-VEGF疫苗组,T7组、生理盐水组肿瘤均重分别为:(0.543±0.259)g、(0.982±0.359)g、(1.169±0.460)g。疫苗组肿瘤重量明显小于生理盐水组(P<0.01)。疫苗组血清产生抗VEGF抗体滴度为1∶1000。疫苗组、空白噬菌体组、生理盐水组MVD分别为:8.5±0.8,16.4±1.3,18.5±1.6。疫苗组MVD明显小于生理盐水组。结论:异种血管内皮生长因子基因重组T7噬菌体疫苗可干扰机体对自身VEGF的免疫耐受,可产生较高水平的特异性抗VEGF抗体,并具有抑制小鼠Lewis肿瘤生长的效应。     

异种EGFR胞外区重组DNA疫苗与蛋白质疫苗抗小鼠Lewis肺癌的作用研究

目的:构建异种表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)胞外区重组DNA和蛋白质疫苗,观察其对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用.方法:克隆鸡源性EGFR胞外Ⅱ-Ⅲ区与IgG-Fc融合基因,构建重组DNA疫苗质粒pVAX1-cEGFR-Fc和原核表达质粒pET28a(+)-S-cEGFR-Fc,后者转化大肠杆菌,将诱导表达的重组蛋白作为蛋白质疫苗.免疫小鼠4次后接种Lewis肺癌细胞,19 d后处死小鼠,剥离肿瘤称重并计算抑瘤率,检测小鼠血清中抗EGFR抗体效价,并检测特异性细胞毒性T淋巴细胞( cytotoxicity T lymphocyte,CTL)活性.结果:成功构建异种EGFR胞外区重组DNA和蛋白质疫苗.DNA疫苗组、蛋白质疫苗组和联合免疫组的抑瘤率分别为37%、49%和63%.3组小鼠均检测出抗EGFR抗体和CTL反应.结论:重组疫苗能打破机体对自身EGFR分子的免疫耐受,诱导特异性免疫反应,对小鼠Lewis肺癌有明显的抑制作用.2种疫苗的联合应用可进一步加强抑瘤作用.     

Combined therapy with flk1-based DNA vaccine and interleukin-12 results in enhanced antiangiogenic and antitumor effects

In this study, we investigated the anti-vasculature effects and the antitumor effects of combining attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain encoding murine vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-2 (flk1) with plasmid DNA vector encoding the murine interleukin-12 (mIL-12) gene. In combination, flk1 based DNA vaccine and mIL-12 slowed down tumor growth more effectively than either one alone. Splenocytes from the combined group were showed a strong CTL response against both the flk1 and tumor cells. Automated image analysis revealed that the mean microvessel density was significantly reduced after administering either flk1 based DNA vaccine or mIL-12. In addition, the combination of flk1 based DNA vaccine and mIL-12 appeared more effective at reducing the microvessel density of tumor (P<0.01, both comparisons). In summary, the antivasculature effect and the anti-tumor effect were better when the combination of flk1 based DNA vaccine and IL-12 was administered in comparison to the individual treatment groups, suggesting the synergistic action of flk1 based DNA vaccine and mIL-12.     

A combination of flk1-based DNA vaccine and an immunomodulatory gene (IL-12) in the treatment of murine cancer

AIM: The aim of this study was to investigate the antivasculature effects and the antitumor effects of combining attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain encoding murine vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-2 (flk1) with plasmid DNA vector encoding the murine IL-12 (mIL-12) gene. METHODS: Mouse models of Gl261 glioblastoma were treated with combining orally given attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain encoding flk1 with direct intratumoral injection of a nonviral plasmid DNA vector encoding the murine IL-12 (mIL-12) gene. The volumes of tumors were observed. Cytolytic T lymphocyte (CTL) response was measured by a 4-hour 51Cr release assay, vessle density and tumor cell proliferation were observed by immunostaining, and tumor apoptosis was determined by TUNEL staining. RESULTS: Compared to mice receiving single agent therapy, received either oral immunization flk1-based vaccine only or the therapeutic gene-IL-12 plasmid DNA only or those in the control group, the combination therapy groups developed a strong CTL response and showed more significantly inhibited tumor growth, apoptosis of tumor cells, and reduced neovascularization and cell proliferation in these mice. CONCLUSIONS: The therapy of attenuated Salmonella typhimurium vaccine strain encoding flk1 combined with the interleukin-12 gene has significant synergistic effect against tumors.     

磷酸钙纳米颗粒修饰的甲胎蛋白和树突状细胞疫苗对小鼠皮下移植瘤的抑制作用

目的 探讨转染小鼠带有信号肽的AFP_1 cDNA和去掉信号肽的AFP_2 cDNA树突状细胞(DC)在体外的免疫活性,以及其对Balb/c小鼠皮下移植瘤的抑制作用.方法 应用磷酸钙纳米颗粒将带有信号肽的AFP_1 cDNA和去掉信号肽的AFP_2 cDNA 真核表达载体pcDNA3.1转染DC,将DC疫苗与同源小鼠脾淋巴细胞混合培养,采用酶联免疫吸附(ELISA)法,检测上清液中干扰素γ(IFN-γ)的表达情况.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,检测AFP_1/DC和AFP_2/DC刺激同基因小鼠脾淋巴细胞增殖能力及诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤能力.观察AFP_1/DC和AFP_2/DC对Balb/c小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用.结果 AFP_2/DC能明显促进脾淋巴细胞增殖并提高CTL的特异性杀伤作用.AFP_1/DC和AFP_2/DC瘤内注射均可显著抑制肝癌移植瘤的生长,但AFP_2/DC的抑制作用更明显,治疗2周后,AFP_2/DC组小鼠肿瘤体积为(726.7±298.2)mm3,明显小于AFP_1/DC组[(1486.2±457.2)mm~3]和空质粒对照组[(2137.2±547.2)mm~3,P<0.05].AFP_2/DC组和AFP_1/DC组的抑瘤率分别达79.2%和39.7%,而空质粒对照组和空白对照组的抑瘤率为0.AFP_2/DC组和AFP_1/DC 组小鼠的生存时间分别为(58.5±4.2)d和(45.2±4.8)d,较空质粒对照组[(30.6±6.2)d]显著延长(P<0.05).结论 AFP_2/DC 疫苗在体外能够诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫效应,在体内具有抑制Balb/c小鼠皮下移植瘤生长的作用.     

共表达基因疫苗MAGE-1/IL-18的抗肿瘤免疫治疗作用

目的观察已构建的共表达基因疫苗pcIL-18-MAGE诱导特异性免疫应答的能力和抗肿瘤免疫治疗作用。方法共表达疫苗肌注小鼠,间隔十天加强免疫一次,共免疫三次,以pcMAGE-1、 pcIL-18、pcDNA3和PBS为对照,检测小鼠脾细胞上清液IL-12和IFN-γ的浓度、脾细胞CTL杀伤活性及小鼠T细胞亚群情况;观察基因疫苗免疫MAGE (+)小鼠的成瘤时间和生存时间。结果pcIL-18-MAGE质粒免疫的小鼠,其脾细胞对SMMC-7721的杀伤率最高,与各对照组相比,差异有统计学意义;脾细胞CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞和上清液中细胞因子IL-12和IFN-γ均明显升高。共表达疫苗免疫MAGE (+)小鼠后,小鼠成瘤时间明显延迟,生存时间明显延长。结论共表达基因疫苗pcIL-18-MAGE在实验动物体内有显著的诱导特异性抗肿瘤免疫作用,且对肿瘤的生成有一定的抑制作用。     

重组白介素-12治疗小鼠Lewis肺癌的实验研究

背景与目的:白介素-12(interleukin-12,IL-12)是具有抗瘤活性的细胞因子,本研究建立稳定表达小鼠IL-12(murineinterleukin-12,mIL-12)的小鼠Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma,LLC)细胞系LLC/mIL-12,评估mIL-12重组质粒及LLC/mIL-12瘤苗治疗小鼠Lewis肺癌移植瘤的疗效。方法:脂质体转染LLC获得LLC/mIL-12瘤苗。于C57BL/6小鼠皮下接种LLC细胞2×106个,成瘤后将小鼠随机分成4组(n=10),第1、4、7天瘤内注射质粒或瘤苗,第14天处死小鼠,观察肿瘤生长曲线、脾细胞中CTL细胞和NK细胞活性以及肿瘤浸润淋巴细胞。结果:LLC/mIL-12瘤苗组和pcDNA3.1( )-mIL-12质粒组肿瘤体积显著缩小,mIL-12能增强NK细胞和CTL细胞活性,两者均以LLC/mIL-12治疗组更显著,LLC/mIL-12和pcDNA3.1( )-mIL-12治疗组有大量CD4 、CD8 淋巴细胞浸润。结论:mIL-12基因能增强NK细胞和CTL活性,LLC/mIL-12及pcDNA3.1( )-mIL-12均能产生抗瘤免疫反应,且前者作用更强。     

血管内皮生长因子受体-2胞外区基因修饰树突状细胞的抗实验性肺转移作用

目的研究血管内皮生长因子受体-2胞外区基因修饰树突状细胞(DC)的抗肿瘤转移作用及其机制。方法电穿孔法基因转染DC,ELISA检测基因转染DC表达sVEGFR-2水平;经尾静脉给C57BL／6小鼠分别注射PBS、DC、pcDNA3．1修饰的DC(DC-vector)、pcDNA3．1／sVEGFR-2修饰的DC(DC-sVEGFR-2),连续3次,每次间隔1周,最后一次免疫注射后10 d,以51Cr释放法检测小鼠脾细胞VEGFR-2特异性CTL活性,藻酸钠小珠法检测肿瘤细胞诱导的新生血管形成,以B16黑色素瘤肺转移模型观察DC-sVEGFR-2免疫的抗肿瘤转移作用。以抗-CD4单抗或抗-CD8单抗分别剔除体内CD4+T细胞及CD8+T细胞,研究DC-sVEGFR-2免疫抗肿瘤转移作用的免疫学机制。结果DC- sVEGFR-2能有效表达sVEGFR-2,而DC-vector和DC不表达sVEGFR-2。DC-sVEGFR-2免疫小鼠脾细胞能有效杀伤VEGFR-2+的靶细胞H5V和3LL-sVEGFR,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0．01),但对VEGFR-2-的同系EL4和3LL细胞无杀伤作用。DC-sVEGFR-2免疫能显著抑制肿瘤诱导的新生血管形成,DC-sVEGFR-2免疫小鼠藻酸钠小珠中FITC-dextran的摄取量仅为对照组的50％,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0．01)。DC-sVEGFR-2免疫组小鼠B16黑色素瘤肺转移灶数目显著减少,瘤灶体积显著小于对照组,与DC-vector免疫组相比,肺表面转移灶数目下降81．9％(49．7±12．7:9．0±3．2,P<0．01)。体内T细胞亚群剔除试验显示,DC-sVEGFR-2免疫的抗肿瘤转移作用由CD8+T细胞介导。结论DC-sVEGFR-2免疫能打破自身免疫耐受,诱导针对VEGFR-2的CTL应答,抑制肿瘤诱导的新生血管形成,显著抑制肿瘤的转移,其抗肿瘤转移作用由CD8+T细胞介导。     

HA 纳米载体转 hGM - CSF 基因的 HepG2 疫苗联合多柔比星抗肝癌作用

目的：评价HA纳米载体转hGM—CSF基因的HepG2疫苗联合多柔比星治疗肝癌的效果。方法：建立Hu—PBL—SCIDHepG2荷瘤小鼠模型,待皮下种植瘤长至100—150mm3时,随机分为5组,每组5只：对照组（PBS）;化疗组（多柔比星DOX）;疫苗组（60Co照射的转染GM—CSF基因的HepG2细胞）;先疫苗后化疗组;先化疗后疫苗组。末次治疗后第5天处死各组小鼠,用MTT法测定脾脏CTL活性及肿瘤组织浸润淋巴细胞（TIL）杀伤活性;取肿瘤组织行HE染色及CD8＋T细胞免疫组化检查。结果：化疗组的CTL活性与对照组相比无显著变化（P〉0．05）。疫苗组和先疫苗后化疗组及先化疗后疫苗组的CTL活性显著强于上述两组（P〈0．05）,该3组两两之间也存在显著差异（P〈0．05）,而先化疗后疫苗组的CTL活性增强最为明显,明显高于其他两组（P〈0．05）。该组的TIL活性同样强于其他各组。同其它组相比,先化疗后疫苗组的瘤体内可见大量肿瘤细胞坏死,CD8＋T细胞浸润显著增加。结论：HA纳米载体转染hGM—CSF基因的HepG2疫苗的主动免疫联合多柔比星化疗具有协同抗肝癌作用,为肿瘤免疫联合化疗治疗肿瘤提供了实验依据。     

人黑色素瘤抗原MAGE-3 肿瘤疫苗的构建及其诱导HLA-A *0201 转基因小鼠CTL活性的观察

 目的 通过基因工程的方法获得人黑色素瘤抗原MAGE-3的DNA和蛋白疫苗，并观察其对HLA-A＊0201转基因小鼠的CTL活性的影响。方法 用RT-PCR的方法，从人黑色素瘤细胞株A375中扩增MAGE-3的cDNA片段，分别将其插入到pcDNA3．1／v5-His真核扣pET32a原核表达载体。将pcDNA-MAGE-3转染B16肿瘤细胞观察其是否能在真核细胞中表达；将pET32a-MAGE-3转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，SDS-PAGE观察融合蛋白表达情况。并用镍柱亲和层析的方法纯化融合蛋白。然后，采用DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强的策略免疫HL-A＊0201转基因小鼠，LDH方法检测CTL活性。结果 酶切结果证实，成功地构建了pcDNA-MAGE-3真核表达载体和pET32a-MAGE-3原核表达载体，并在真核细胞B16和原核细胞大肠杆菌中获稳定表达，原核表达产物为融合蛋白且分布于包涵体。用DNA疫苗进行初次免疫，镍柱纯化的融合蛋白加强免疫后，可成功地诱导HL-A＊0201转基因小鼠CTL活性。结论 成功地获得了MAGE-3肿瘤抗原，为进一步完善MAGE-3肿瘤疫苗打下了基础。