经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植修复梗死心肌的临床研究

目的本研究试图系统观察经冠状动脉自体骨髓单个核细胞(mononuclear bone marrowcell,MBMC)移植修复梗死心肌、改善心脏功能的可行性、效果、安全性及不良反应.方法2002年12月至2004年3月,38例急性心肌梗死患者入选这个前瞻性研究.分为细胞移植组和常规治疗组.细胞移植或常规治疗前、后(3个月)随访观察包括临床、实验室,二维超声心动图,正电子发射体层心肌显像(PET),术后48小时持续心电监测.梯度密度法分离自体MBMC.PCI+MBMC移植或单纯PCI手术在MI后平均14.6天进行.21例超选择性经梗死相关冠状动脉,气囊充盈下高压注入移植,4×106(2ml/次),重复注入6～8次,MBMC数平均(3.28±0.44)×107.7例经冠状动脉选择性移植,气囊未充盈下高压注入移植细胞,细胞数与上相同.结果28例细胞移植患者手术均安全.3例于细胞注入后15～30分钟感发冷,半小时后好转.3例细胞注入时出现短暂自限性室性早搏.术后48小时持续心电监测未出现新的心律失常.AMI患者中15例完成移植后三个月PET随访观察,13例显示原梗死代谢缺损区出现有代谢活力心肌,占原梗死区(40.08±8.82)%,38例AMI患者3个月超声心动图随访,其MBMC移植组左室射血分数(EF)增加13.01%(P＜0.01),左室每搏输出量增加18.63%(P＜0.05),而对照组心功能无改善.结论本研究提示自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植修复梗死心肌是安全有效的.细胞移植所显示改善心功能的效果,可能与再生心肌和血管,限制和逆转了心室的重构,及移植细胞本身通过自分泌、旁分泌产生血管活性物质、生长因子的作用有关.     

双核素单光子断层显像评价骨髓单个核细胞移植后急性心肌梗死患者存活心肌变化

目的 利用双核素[^201 铊（Tl）及^18 F-脱氧葡萄糖（FDG）]单光子断层显像（SPECT）方法评价经冠状动脉自体骨髓单个核细胞（BM-MNC）移植对急性心肌梗死患者心功能和存活心肌的影响。方法 40例首次ST段抬高急性心肌梗死患者,成功完成PCI术后,随机分为细胞移植组（n=20）和对照组（n=20）,急诊冠状动脉造影术同时,经微导管于梗死相关动脉内支架远端注入自体BM-MNC悬液或等量的肝素生理盐水。研究终点为PCI术后6个月时双核素（^201 Tl及^18F-FDG）SPECT测定存活心肌的变化。结果 随访6个月时,两组患者左心室射血分数均有显著提高,但移植组患者左室射血分数改善幅度更显著[（7．6±2．8）％比（3．0±2．8）％,P〈0．001]。^201 Tl-SPECT显示移植组患者左心室心肌灌注明显改善,心肌灌注缺损面积减少（6．7±3．0）％,同时^18 F—FDG-SPECT结果显示梗死边缘区心肌灌注-代谢不匹配面积明显增加,提示存活心肌明显增加。结论 自体BM-MNC可以改善急性心肌梗死后梗死边缘区心肌灌注,增加局部存活心肌,提高左心室功能。     

甲状腺肿瘤中肝细胞生长因子及其受体蛋白的表达研究

用免疫组化检测甲状腺良恶性肿瘤组织中肝细胞生长因子（HGF）及其受体（c-Met）的表达。结果显示HGF和c-Met蛋白阳性表达率在腺癌组中显著高于腺瘤组，尤其滤泡性腺癌组显著高于滤泡性腺瘤组，二者表达强度在乳头状腺癌组呈显著正相关。提示HGF和c-Met的异常表达可能对甲状腺良恶性肿瘤的鉴别诊断、预后判断有一定参考意义。     

自体骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变疗效及其与血清肝细胞生长因子的关系

目的探讨自体骨髓单个核细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的疗效及其与血清肝细胞生长因子(HGF)水平的关系。方法选择2006年6月至2009年6月沈阳市第七人民医院79例糖尿病下肢血管病变患者,分为常规治疗组(A组,40例,80条患肢)和自体骨髓单个核细胞移植治疗组(B组,39例,78条患肢),治疗6个月后对疗效及其与血清HGF关系进行评估。结果(1)B组治疗后1周肢体疼痛、患肢冷感、皮肤温度、血清HGF与B组治疗前及A组治疗后1周比较差异有统计学意义(P0.05),并与血清HGF存在相关性(P0.05)。(2)B组治疗后3个月、6个月各项临床观察指标与B组治疗前及A组治疗后相同时间点比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论自体骨髓单个核细胞移植技术治疗糖尿病下肢血管病变可以提高疗效,不会导致由于血清HGF长期增高引起的副反应。     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）-4成纤维生长因子4-（FGF-4）诱导人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）分化为肝细胞的可行性，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法 （1）取志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心＋贴壁培养获取骨髓间充质干细胞（MSCs），将MSCs通过CD45、GlyA免疫微磁珠负分选得到hMAPCS。（2）将hMAPCs用HGF＋FGF-4进行诱导分化。实验分组：A组：HGF（20ng／m1）＋（FGF-4）10ng／m1诱导hMAPCS；B组（阳性对照组）：L-02人肝细胞株；C组（阴性对照组）：未加任何诱导因素的hMAPCs。（3）免疫细胞化学鉴定不同诱导分化阶段细胞的白蛋白（A1b）、甲胎蛋白（AFP），细胞角蛋白-18（CK-18）等肝细胞特征的表型变化评计数阳性细胞比率。（4）逆转录-聚合酶链反应检测不同诱导分化阶段细胞的A1b、AFP，CK-18的mRNA转录。（5）Western blot检测诱导分化第21，35天后细胞的A1b表达。结果（1）免疫细胞化学结果：A1b、CK18在诱导组中不同时间段基本为阳性着色；AFP在诱导分化第7天为阳性着色，在诱导第14，21天为阴性着色。（2）逆转录聚合酶链反应结果：作为不成熟肝细胞表型的AFP，在诱导分化的第7天有mRNA阳性表达；作为成熟肝细胞表型的A1b及CK-18，在不同时间段mRNA均为阳性表达。（3）Western blot检测诱导分化第21、35天后细胞的A1b表达。结论hMAPCS在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能。     

同种异体骨髓单个核细胞肝内移植治疗急性肝损伤的疗效

重型肝炎仍以常规治疗为主,但疗效较差;原位肝移植、肝细胞移植、胎肝细胞移植虽有效,但因各自的局限性而不能广泛应用[1].骨髓单个核细胞(MBMCs)是具有极强多向分化潜能及低免疫原性等特点的成体干细胞[1];已证实其在受损器官内可向组织损伤区迁移、定植,向靶器官实质细胞、血管内皮细胞分化,不用免疫抑制剂直接用其进行同种异体移植可治疗各种器官损伤且无明显的免疫排斥反应.     

左归丸粗提取物对骨髓干细胞转化肝细胞的影响

目的 观察左归丸及其拆方的粗提取物对骨髓干细胞转化肝细胞的影响,为进一步探索左归丸的有效成分奠定实验基础.方法 利用透过性支持物(聚酯TranswellR透明嵌套)建立骨髓干细胞-肝组织细胞共培养体系,采用水煮醇沉方法提取制备左归丸及其拆方粗提取物加入共培养体系.骨髓干细胞与肝细胞共培养7、14、21、28、35d时分别取透过性支持物中的骨髓干细胞爬片用PAS法检测糖原,免疫细胞化学方法(ICC法)检测肝细胞标志物(AFP、CK18、Alb).结果 左归丸及其拆方粗提取物浓度高于1.56 mg/ml时,影响骨髓干细胞的存活,而浓度等于1.56 mg/ml时,共培养条件下骨髓干细胞的糖原、AFP、Alb、CK18的表达量,平行对照各组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 骨髓干细胞对培养条件比较苛刻,一般的中药租提制剂不适于骨髓干细胞-肝细胞共培养体系的实验.     

移植时机对骨髓单个核细胞治疗心肌梗死效果的初步研究

目的：研究经冠状动脉移植骨髓单个核细胞治疗心肌梗死的最佳时间窗。方法：结扎小型猪冠状动脉前降支90 min 再灌注制备心肌梗死模型,分为2小时移植组、2小时对照组、1周移植组和1周对照组,每组7只。移植组在结扎后2小时和1周经冠状动脉移植(8～10)×10~7个 PKH26标记的骨髓单个核细胞,对照组注射等体积培养基结扎后6周检测心功能变化并行了病理检查。结果：两个移植组在心肌梗死区均可找到移植细胞,其Ⅷ因子和 desmin 免疫组化染色均为阳性。血流动力学指标显示：结扎后6周较结扎后90分钟相比.2小时移植组的左心室压力最大下降速度和心排量显著升高(P＜0.05)；1周移植组的左心室舒张未压和心排量显著改善(P＜0.05)。超声心动图指标显示结扎后6周时2小时移植组的每搏排血量和心排量显著高于2小时对照组(P＜0.05)；1周移植绀结扎后6周-结扎前射血分数的差值明显高于1周对照组 (P＜0.05)。两移植组结扎后6周的各项指标均无显著差异(P 均＞0.05)。1周移植组梗死区的小血管数量明显高于2 小时移植组(P＜0.01)。结论：在结扎后2小时和1周时经冠状动脉移植的骨髓细胞均能定植于心肌梗死区,并可向心肌细胞和血管内皮细胞方向分化,有改善心功能的潜能。在结扎后1周移植能更有效地促进小血管新生。     

经静脉和经梗死心肌周边移植自体骨髓间质干细胞对心肌梗死后心功能影响的比较研究

目的比较经静脉移植和心肌移植骨髓间质干细胞(MSCs)对心肌梗死后心功能的影响。方法结扎30只日本大耳兔的冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死模型后分成3组:损伤对照组、静脉移植组和心肌移植组。5周后检测各移植组抗DAPI染色及心脏的结构和功能。结果静脉移植组、心肌移植组在移植区均可检测到大量DAPI阳性标记的细胞,与损伤对照组相比,二者的左室结构与功能均明显改善(P<0.05);而心肌移植组对心功能的改善优于静脉移植组,二者的差异有统计学意义(P<0.05)。结论经静脉移植的MSCs能够在心肌局部分化成为类心肌细胞,并有效改善心脏功能;经心肌移植MSCs对心功能的改善更为有效。     

人骨髓单个核细胞向肝细胞诱导分化的体外研究

目的 探讨在HGF、FGF_4诱导下骨髓单个核细胞能否向肝细胞分化。方法 找健康忐愿者,年龄4～50岁,胸骨抽取骨髓,用淋巴分离液分离出骨髓单个核细胞,用含2％胎牛血清和1×ITS的DMEM培养,分别用单独HGF、单独FGF_4、HGF和FGF_4联合刺激、无生长因子4种处理因素进行诱导培养,分别于诱导培养0、7、14、21、28天时,留取细胞,用免疫细胞化学法检测CK18、AFP、白蛋白,用PAS法进行糖元染色试验以验证诱导分化的结果。结果 0天时,AFP、白蛋白少数细胞阴性,CK18阴性,糖元未见阳性;加生长因子的三组AFP在7、14天时表达逐渐增高,21、28天减弱;糖元、CK18、白蛋白表达逐渐增高。无生长因子组,在7、14、21、28天时,这此指标均未见表达。结论 在HGF、FGR_4诱导下,骨髓单个核细胞可分化为具肝细胞表型和功能的细胞。     

小鼠骨髓干细胞诱导分化为肝细胞的实验研究

目的探讨成年小鼠骨髓干细胞在肝细胞生长因子(HGF)作用下分化为肝细胞的可能性及其分化特性，为肝细胞移植提供实验基础。方法HGF100ng／ml体外诱导小鼠骨髓干细胞向肝细胞分化，于诱导的第0、7、l4、21、28天，观察细胞形态特征；半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)mRNA水平的表达；免疫细胞化学法检测ALB、AFP和细胞角蛋白l9(CK19)蛋白水平的表达。结果新鲜分离的骨髓干细胞ALB及AFP mRNA呈弱阳性。在非诱导组，培养7d时ALB mRNA已检测不到，AFP mRNA明显减弱，14d时消失。在诱导组，7d时ALB mRNA检测不到，14d时再次出现阳性条带，21d时表达量最大，而AFP mRNA在诱导组始终呈阳性，14d时表达量最大，以后逐渐减少。免疫细胞化学结果与RT-PCR结果基本一致，但CK19蛋白始终阴性。结论小鼠骨髓干细胞在HGF单独作用下能诱导分化为肝细胞样细胞，诱导分化的最佳时期是2～3周。     

骨髓干细胞心肌内移植促进心肌组织表达c-met蛋白

目的探讨c-met在骨髓干细胞心肌内移植后血管新生过程中的作用。方法对急性心肌梗死大鼠进行骨髓单个核细胞心肌内移植,免疫荧光检测c-met蛋白的表达。结果骨髓单个核细胞心肌内移植之后,不仅在移植细胞周围有c-met蛋白的表达,在远离细胞移植区域的心肌组织也可以有c-met蛋白的表达。结论骨髓干细胞心肌内移植可以促进心肌组织表达c-met蛋白。     

骨髓基质细胞结合血管内皮生长因子基因治疗猪慢性心肌缺血的疗效

目的：探讨骨髓基质细胞（BMSCs）结合血管内皮生长因子（VEGF）基因心内膜注射治疗猪慢性心肌缺血模型的疗效。方法：建立猪心肌梗塞模型．胸骨穿刺抽取骨髓,分离培养BMSCs,将VEGF165基因转染到BMSCs中．4周后进行左室心内膜电机械标测并行心内膜注射等操作,按照注射成分不同分为3组．联合组（n=8）注射转染VEGF。基因的BMSCs,细胞组（n=8）注射BMSCs,对照组（n=6）注射生理盐水。于细胞移植后4周分别进行左室心内膜电机械标测、选择性冠脉造影及超声心动图检查。结果：术后4周时联合组较细胞组及对照组的心梗面积明显缩小．侧支循环、心脏泵血功能以及心肌收缩力改善更加明显（P〈0．05～〈0．01）。结论：自体BMSCs结合VEGF165基因治疗心肌梗塞效果显著。     

经冠状动脉注射骨髓单个核细胞治疗缺血性心肌损伤的实验研究

目的　证实骨髓干细胞心肌内移植治疗对心脏功能的改善和促血管新生作用。方法　小型猪冠状动脉结扎制备心肌梗死模型 ,然后经冠状动脉内注射骨髓单个核细胞 ,术后 3周用超声心动图以及左心室造影检测心功能的变化 ,核素心肌显像观察心肌灌注的情况 ,冠状动脉造影观察侧支循环的形成 ,免疫组化计数血管密度。结果　心肌梗死小型猪冠状动脉注射骨髓单个核细胞后 ,左心室造影显示左室 dP dtmax与对照组比较增高。核素心肌显像显示冠状动脉注射骨髓单个核细胞后心肌灌注显著改善。移植治疗后冠状动脉造影显示有侧支循环形成 ,血管密度计数比对照组增加了5 2 2 % (5 6 6± 11 7 mm2 vs 37 2± 8 4 mm2 ,P <0 0 5 )。结论　骨髓单个核细胞心肌内移植可能通过促进血管新生改善心脏收缩功能。     

骨髓干细胞介导的人肝细胞生长因子基因转染在兔心肌梗死组织中的表达

目的:观察以骨髓干细胞(BMSCs)介导的人肝细胞生长因子(hHGF)基因转染在兔心肌梗死组织中能否稳定表达.方法:家兔16只,复制急性心肌梗死(AMI)模型.随机分为2组:移植组:BMSCs加hHGF移植,对照组.另外随机选取8只兔作为假手术组.AMI术后3 d,抽取股骨骨髓1.5 ml,分离BMSCs培养.于对数生长期加入5-溴脱氧尿苷孵育24 h,以标记移植细胞.构建pcDNA3.1-hHGF重组表达载体,移植前用脂质体包裹表达载体转染BMSCs,孵育24 h.AMI术后14 d,行自体细胞移植,对照组接受等量的无血清培养基注射,假手术组只开胸,不注射.细胞移植后28 d,检测左心室血流动力学指标;取心肌组织,RT-PCR检测hHGFmRNA的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)测定心肌组织中HGF的含量.结果:与假手术组比较,心肌梗死后28d,对照组左心室功能降低,但BMSCs加hHGF组左心心室功能有改善;RT-PCR结果显示移植组有hHGFmRNA表达,ELISA测定HGF含量移植组高于对照组.结论:AMI组织中HGF含量降低,转染HGF的BMSCs能在AMI组织中生存并能表达分泌HGF,其左心室功能有改善.     

肝细胞生长因子及其受体在血管外膜成纤维细胞中的表达

目的 检测肝细胞生长因子（HGF）及其受体c-met在血管外膜2种表型成纤维细胞中的表达，探索其在血管外膜重塑中的作用。方法 用转化生长因子-β1建立大鼠主动脉外膜成纤维细胞和肌成纤维细胞2种细胞表型。以实时定量逆转录聚合酶链反应技术和蛋白免疫印迹方法分析HGF及c-met在2种不同表型细胞中的表达。酶联免疫吸附试验检测2种细胞无血清培养上清液中HGF的含量。结果 HGFmRNA及HGF蛋白，c-metmRNA及c-met蛋白在主动脉外膜成纤维细胞。肌成纤维细胞中均有表达。在主动脉外膜成纤维细胞转变为肌成纤维细胞后表达明显上调，随转化生长因子-β1刺激浓度和时间的增加，在主动脉外膜成纤维细胞逐渐表达-α-平滑肌肌动蛋白转变为肌成纤维细胞的过程中HGF表达逐渐上调。结论 血管外膜成纤维细胞存在局部HGF系统。HGF可能在血管外膜细胞瑶型转化中有一定作用。     

腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与骨髓间充质干细胞联合治疗大鼠肢体缺血的研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)介导的人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)移植对血管新生的影响.比较单纯干细胞移植与联合基因治疗的疗效.方法 全骨髓培养法提取培养MSC;rAAV-VEGF165转染MSC中,酶联免疫吸附试验(ELISA)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF的表达;以近交系大鼠建立骨骼肌缺血模型,40只大鼠随机分为4组,每组10只.对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS);干细胞组移植等量MSC,转染术后7 d组和转染术后10 d组分别于结扎7 d和10 d后的缺血区移植转染VEGF基因的MSC,移植6周后做Ⅷ因子染色检测血管新生情况.结果成功培养出MSC,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.在转染rAAV-VEGF165后转染组1、3、5、7、9 d上清液中VEGF165分泌水平分别为(131.98±6.00)、(263.96±4.58)、(540.85±5.97)、(208.98±5.06)、(174.45±5.00)ng/L,明显高于未转染组的(68.72±1.99)、(76.47±4.98)、(89.86±1.99)、(84.93±8.97)、(68.71±5.98)ng/L[t值分别为14.14、51.16、79.28、27.56、26.07,(均P＜0.05)],且5 d时达到高峰,此后表达开始下降.琼脂糖凝胶电泳可见在579 bp处见到高亮度条带,证明rAAV-VEGF165成功转染进MSC细胞中.转染后的生长曲线及细胞形态较未转染组无明显变化.Ⅷ因子染色示转染术后10 d组动物缺血区毛细血管密度[(9.35±2.72)条/视野]明显高于对照组[(1.05±0.50)条/视野]和干细胞组[(3.10±1.43)条/视野](均P＜0.01),较转染术后7 d组[(6.95±1.69)条/视野]亦有一定程度的升高(P＜0.05).结论 MSC有利于VEGF基因的稳定表达,可作为VEGF基因的良好细胞载体,且联合应用效果高于单独移植MSC,移植最佳时间为术后10 d.     

高糖刺激人肾脏成纤维细胞肝细胞生长因子和c-met的表达及其意义

目的 在体外高糖刺激人肾脏间质成纤维细胞时观察其肝细胞生长因子（HGF）和c-met的表达。方法 将人肾脏间质成纤维细胞分别培养于不同浓度的葡萄糖中，于24h后用RT－PCR方法检测HGF、c-met和1型纤溶酶原激活物抑制物（PAI－1）mRNA的转录水平，用不同浓度的HGF刺激细胞来观察PAI－1mRNA的表达。结果 高浓度葡萄糖培养的细胞早期就有HGF、c-met表达，之后表达逐渐下降，而PAI－1在此之后出现表达上升。同时外源性HGF可以抑制PAI－1mRNA的表达。结论 HGF在肾脏中是潜在的一种抗纤维化的细胞因子，可以通过降低PAI－1的表达，从而促进细胞外基质的降解。     

骨髓干细胞治疗肝硬化的进展

肝硬化是由多种病因引起的慢性、进行性、弥漫性肝脏病变,目前认为是一种持续进展的不可逆的肝脏疾病.日益加重的门静脉高压症会导致腹水、消化道出血和肝性脑病等一系列严重的并发症,最终导致肝功能衰竭[1].目前的内科治疗仅能改善患者的临床症状,逐渐加重的肝硬化将导致不可逆的肝功能减退.目前原位肝移植被认为是治疗肝硬化的惟一有效手段,但由于供肝严重缺乏、术后免疫抑制剂长期使用、围手术期风险以及术后移植肝肝炎,并发肿瘤、高额费用等问题,限制了原位肝移植的广泛应用.近年来,随着干细胞领域研究的巨大进展,骨髓干细胞治疗可望成为治疗肝硬化的有效手段.