基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型

目的:建立和评价基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型技术。方法:采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增omp1基因的VS1-VS2序列,以限制性酶切片段多态性分析(RFLP)进行检测分型,与VS1-VS2测序分型结果比较。结果:扩增12株沙眼衣原体标准株omp1基因VS1-VS2序列,长度为453-463 bp,用AluⅠ及DdeⅠ酶切此得出标准血清型的特征性图谱。37例沙眼衣原体ELISA检测阳性标本的VS1-VS2-PCR扩增均阳性,RFLP检到B-K型和2例混合型感染,分型率为94.59%。与DNA直接基因测序分型进行对比,符合率为94.59%。结论:基于omp1基因VS1-VS2序列的沙眼衣原体RFLP基因分型技术,较以前的方法更为敏感和特异,可作为对沙眼衣原体分型研究的工具。     

反向斑点杂交技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体及基因分型

目的 建立反向斑点杂交技术,对泌尿生殖道沙眼衣原体感染进行检测和基因分型。方法 用Oligo软件设计寡核苷酸探针,采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增omp1基因的VS1-VS2序列,反向斑点杂交技术对沙眼衣原体进行检测和基因分型。结果 巢式PCR扩增omp1基因的VS1-VS2序列的敏感性与质粒PCR符合率为98.2%(56/57)。优选出11条型特异性(A、B+Ba、C、D、E、F、G、H、I、J和K)和3条群特异性寡核苷酸探针:B群(B、Ba、D和E型),C群(A、C、H、I、J和K型)和中间群(F和G型)。特异性经过基因库中的BLAST程序比较和试验优化,结果显示各探针均与标准株呈特异性杂交。56例VS1-VS2 PER阳性的临床标本杂交法检测均阳性,共检出59株沙眼衣原体,包括8个基因型,其中以E、F、D和H型为主,占77.9%,分别为25.4%,22.0%,16.9%和13.6%。发现3例混合感染占5.4%,分别为D/E、D/F和F/K。结论 反向斑点杂交技术简便且快速,可直接对临床标本沙眼衣原体进行检测和基因分型。     

37例性病门诊患者泌尿生殖道沙眼衣原体基因分型研究

目的:了解性病门诊高危人群中沙眼衣原体分型特征.方法:采用巢式PCR扩增omp 1基因的VS1-VS2序列,自动测序仪测序,对沙眼衣原体临床菌株分型.结果:以12株标准株omp 1基因VS1-VS2序列为标准,37例沙眼衣原体感染样本基因分型共检出9个血清型,B型1株(2.7%)、D型5株(13.5%)、E型11株(29.7%)、F型5株(13.5%)、G型1株(2.7%)、H型3株(8.1%)、J型9株(24.3%)、K型1株(2.7%)、混合感染型1例(2.7%).结论:本组泌尿生殖道沙眼衣原体感染的基因型以E型、J型、F型、D型为主,分型对于监测特定型别的流行动态有重要意义.     

HIV-1 env基因序列分析及其与长期感染不进展现象相关性研究

目的研究HIV-1长期感染不进展现象与HIV-1 env基因变异的关系。方法用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)对21例感染HIV-1毒株7年以上者外周血单一核细胞(PBMCs)的核酸样本进行扩增,获得HIV-1膜蛋白(env)基因的核酸片段,对其C2-V3及邻区350-450个核苷酸序列进行测定和分析,所得结果与HIV-1该亚型国际标准株进行比较,分析共享序列及突变序列,制作系统树,计算离散率。结果离散率和系统树分析21个毒株均为HIV-1 B亚型,毒株间基因离散率在2%左右,高于前期研究结果;未见V3环顶端四肽特征性GPGR和GRGQ,也未见前期研究曾经发现的脯氨酸向异亮氨酸的变异现象。结论HIV-1长期感染者体内毒株env基因无规律性突变。     

沙眼衣原体omp1基因VS1-VS2序列分析与基因分型

目的 探讨沙眼衣原体omp1基因VS1-VS2序列基因分型和VS1-VS2基因突变率。方法 巢式PCR扩增omp1基因的VS1-VS2序列,自动测序仪测序,运用DNAstar软件进行临床菌株与标准菌株序列的比对。结果 99株临床标本分离株扩增出约453 bp大小的VS1-VS2片段。与标准株比对,除3株测序出现双峰无法确定基因型外,96株菌株分为9个型,以F型29株(30.2%)、E型22株(22.9%)、J型19株(19.8%)、D型12侏(12.5%)和H型8株(8.3%)为主。序列分析发现7株存在VS1区碱基的突变或插入,多为有义突变,突变率为7.3%,多见于D、E、F和H型。结论 沙眼衣原体omp1基因序列分析在分子流行病学上具有一定意义。     

性病门诊男性尿道炎患者沙眼衣原体基因分型

目的 了解性病门诊就诊的尿道炎男性患者中,沙眼衣原体血清型分布情况。 方法 采集2013年1 - 12月中国医学科学院皮肤病医院性病门诊有尿道炎症状的男性患者的尿液,荧光定量PCR检测沙眼衣原体,对沙眼衣原体阳性患者的尿液提取DNA,用巢式 PCR法扩增沙眼衣原体主要外膜蛋白基因ompA的VS1-VS2片段,然后对此片段测序,测序结果用DNAStar5.0软件与每种血清型的参考菌株做比对,分析其血清型。 结果 对2013年432例男性尿道炎患者进行了沙眼衣原体筛查,阳性标本143例,阳性率33.1%。143例沙眼衣原体阳性标本,127例扩增出ompA的VS1-VS2片段,16例未扩增出。127例阳性标本经测序分析获得9种血清型。血清型分布情况如下：E型29（22.83%）、F型28株（22.05%）、D型19（14.96%）、G型16株（12.60%）、J型16株（12.60%）、K型8株（6.30%）、H株5株（3.94%）、I型3株（2.36%）、B型3株（2.36%）,E、F、D、J、G型占85.02%。与标准菌种比对,发现127例菌株中有14株存在碱基突变,为同义突变。 结论 性病门诊男性尿道炎沙眼衣原体血清型主要是E型、F型、D型和G型,与20年前相比,E型菌株比例有所下降,J型菌株比例增高。     

EB病毒潜伏基因表达与系统性红斑狼疮的关系

目的检测EB病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)潜伏基因在EBV阳性系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者外周血单一核细胞中的表达,探讨其临床意义。方法应用聚合酶链反应(PCR)Southern杂交技术检测44例SLE患者和43例正常对照者外周血单一核细胞中EBV特异性DNA片段BamHⅠW,筛选出EBV阳性标本,对EBV阳性标本进行RTPCR和Southern杂交,检测病毒潜伏基因(EBV核抗原基因EBNA2,潜伏膜蛋白基因LMP1和2A)的表达。结果44例SLE患者标本中有32例EBV阳性,正常对照组有3例EBV阳性,两组EBV阳性率比较差异有显著性(χ2=39.1779,P=0),SLE活动期和稳定期患者EBV阳性率比较差异无显著性(q=0.4025,P=0.7764)。32例EBV阳性SLE标本中有20例EBNA2mRNA阳性,1例LMP1mRNA阳性,但均未检测到LMP2AmRNA的表达。结论EBV感染参与部分SLE的发生发展,EBV潜伏基因EBNA2的表达可能诱发SLE患者的自身免疫反应。     

陕西省HIV-1分子流行病学研究

目的研究陕西HIV-1流行亚型及相互关系,分析流行时间及传播途径,为陕西省HIV的预防、控制及感染者治疗提供有力的依据。方法用PCR对15份陕西HIV-1感染者外周血单核细胞(PBMCs)样本进行扩增,获得HIV-1 env基因的核酸片段,对其C2-V3及邻区350-450个核苷酸序列进行分析,所得结果与HIV国际标准株及周边省份流行株进行比较,分析共享序列及突变序列,制作系统树,计算离散率。结果 陕西流行的B、E、C亚型内基因离散率分别为3.0％,1.7％和2.3％。10个B亚型毒株与泰国、我国云南、新疆、河南和四川流行的B亚型代表株基因序列接近;2个C亚型毒株我国新疆流行的C亚型代表株接近;3个E亚型毒株与河南流行的E亚型代表株接近。结论 陕西HIV-1流行株主要为B、E、C亚型,三亚型毒株在陕西的流行时间分别在2.5～3年、2～2.5和1.5～2年之间,传播来源可能为国外或周边省份传入。     

HIV-1长期感染不进展者体内毒株env基因序列测定

目的研究HIV-1长期感染不进展现象与HIV-1env基因变异之间关系。方法用PCR对11例感染HIV-1毒株10年以上者外周血单一核细胞样本进行扩增,获得env基因的核酸片段,对其C2~V3及邻区350~450个核苷酸序列及所属亚型进行分析,所得结果与HIV-1该亚型国际标准株进行比较,分析共享序列及突变序列,制作系统树,计算离散率。结果离散率和系统树分析11株毒株均为HIV-1B亚型,基因离散率与国际标准株相比低于以往发现的陕西省流行株和文献报道的其他省份流行毒株。11株毒株V3环顶端四肽序列特征为GPGR的2例,占18.2%;为GRGQ的9例,占81.8%。在11株样本中均出现脯氨酸向异亮氨酸的变异。结论env基因V3环顶端四肽GRGQ序列特征及脯氨酸向异亮氨酸的变异可能与HIV-1感染者长期感染而不发病的现象有关。     

尖锐湿疣组织中HPV型别检测及HPV11型L1基因的克隆与测序

目的分析黑龙江地区尖锐湿疣组织感染的HPV型别分布情况,并对HPV11型流行株L1基因进行克隆和测序,检测序列变异情况。方法提取30例尖锐湿疣组织标本中的DNA,用HPVL1区通用引物及特异性HPV6b,11,16,18型引物进行PCR扩增,分析尖锐湿疣组织中感染的HPV型别分布。对其中4株HPV11型阳性标本L1基因,经酶切、连接,分别构建pSP73-HPV11L1重组质粒,并对其L1片段进行测序。结果30例标本中,HPV6b和11型感染数分别为11例,各占36.7%;有2例合并HPV6b/11/16型的混合感染,占总病例数的6.7%;1例HPV16型单独感染,未鉴定出HPV18型感染,其他型别5例。pSP73HPV11L1重组质粒测序后,4株HPV11L1基因序列完全一致,可认为是黑龙江省流行株。其序列与原始株序列相比,仅发现了两处同义点突变。结论黑龙江地区尖锐湿疣组织中HPVDNA检出率为100%,以6b和11型为主,偶见高危型别16型感染。克隆测序表明黑龙江省流行株HPV11型L1基因高度保守。     

广东省梅州地区142例泌尿生殖道沙眼衣原体的基因分型及药敏分析

目的:检测本地区泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)临床分离株阿奇霉素、克拉霉素、多西环素、左氧氟沙星4种常用抗生素体外药物敏感性,并对Ct基因分型进行初步研究。方法:将采集到符合要求的临床标本142例,采用McCoy细胞培养法进行培养,传代至感染率达到90%以上,收集标本采用微量稀释法测定4种常用抗生素的药物敏感性。对Ct临床株omp1基因片段应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法进行基因分型。结果:共培养出Ct阳性株82株,其中McCoy细胞感染率达到90%以上的菌株48株,阳性率为33.80%;共检出4个基因型,E型16株(33.33%),J型12株(25.00%),F型10株(20.83%),D型10株(20.83%)。药敏结果显示,最低抑菌浓度(MIC)分别是:阿奇霉素0.063~1.000 mg/L,克拉霉素0.008~0.032 mg/L,多西环素0.016~0.125 mg/L,左氧氟沙星0.250~2.000 mg/L。结论:142例标本中Ct感染以E型为主要基因型,实验中未发现对这4种抗菌药产生耐药的菌株,克拉霉素、多西环素抗衣原体活性相对较强,阿奇霉素、左氧氟沙星的抑菌浓度在较高的水平。     

HSV-2病毒gD基因的扩增和测序

目的:确定单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)糖蛋白D的基因序列。方法:从3位生殖器疱疹患者中分离出3株HSV-2,提取标本中病毒DNA,通过PCR扩增gD基因并进行测序,用CLUSTALW排序软件和GENEDOC32软件进行分析。结果:样品1:有4个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.66%,并引起了4个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.24%。样品6:有1个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.92%,并引起了1个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.75%。样品8:有1个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.92%,并引起了1个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.75%。结论:三株野生株的gD基因序列与已公布的序列基本一致,说明HSV-2型的gD基因具有较强的保守性,可成为HSV-2型基因疫苗的侯选抗原。     

基于Omp1基因的泌尿生殖道感染沙眼衣原体多样性及分布特征分析

目的基于主要外膜蛋白基因(Omp1)研究泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体多态性及分布特征,为该疾病的诊治及疫苗研究奠定基础。方法对泌尿生殖道感染临床标本常规处理后,使用沙眼衣原体核酸检测试剂盒筛选阳性标本,然后以巢式PCR扩增Omp1基因,选择4个限制性内切酶进行RFLP分析确定其基因型,选择代表菌株测定Omp1的DNA序列并与参比菌株比较确定其血清型,最后将基因型及血清型与患者的性别、科室及年龄进行对比分析,研究其分布特征。结果 2013-2014年2年间共筛选得到178份阳性标本,61份标本扩增获得Omp1基因,Omp1-PFLP分析将61份标本分为6个基因型,占比分别为24.59%,24.59%,4.92%,9.84%,3.28%和32.79%,血清型分析表明61份标本属于F,H,J,G,Da,D和E 7种血清型,E型及F型占比最多。结论本地区引起泌尿生殖道感染的沙眼衣原体主要属于F,H,J,G,Da,D和E 7种血清型,E型及F型占比最多,基因型及血清型与患者性别具有相关性,与科室、年龄无相关性。     

自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体检测尖锐湿疣皮损的研究

目的 采用自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体检测外生殖器尖锐湿疣皮损组织中HPV6b和11型E7蛋白的表达,探讨该抗体在临床检验中的应用价值。 方法 55例经临床和病理确诊的尖锐湿疣皮损石蜡标本,用自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体进行免疫组化检测,其中18例皮损冰冻标本用RT-PCR法测定HPV6b和11型E7蛋白mRNA表达,分析与免疫组化结果的符合率。 结果 55例尖锐湿疣皮损的免疫组化染色显示,HPV6b和11型E7蛋白为胞核染色,且皮损全层表皮细胞均有阳性表达,但基底层阳性细胞较多。HPV6b和11型E7蛋白阳性表达率分别为76.36%（42/55）和58.18%（32/55）,总阳性表达率为94.55%（52/55）,两蛋白双阳性率为40.00%（22/55）,两蛋白均阴性表达为3例（5.45%）。18例尖锐湿疣冰冻标本经RT-PCR法检测,HPV6b和11型E7 mRNA阳性表达分别为15例和10例,双阳性表达7例,其阳性表达型别与免疫组化结果完全一致,符合率均为100%。 结论 该自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体免疫组化法检测尖锐湿疣皮损,检测结果直观,可以观察到HPV6b和11型感染细胞在病损中的分布位置。     

北京地区育龄妇女泌尿生殖道沙眼衣原体感染状况及基因分型初步研究

目的对北京地区育龄妇女沙眼衣原体的感染状况及基因分型进行初步研究。方法利用胶体金免疫法对 177例计划生育门诊及妇科体检的育龄妇女进行筛查,对 9例沙眼衣原体感染阳性者的拭子标本直接进行套式 PCR扩增主要外膜蛋白（ MOMP）基因。将扩增的 DNA进行限制性内切酶长度多态性分析,并对 MOMP基因易变区 VS1、 VS2、 VS3、 VS4进行基因序列分析。结果 177名育龄妇女有 9例沙眼衣原体感染阳性, 9份标本均扩增出 1.1 kb目的 DNA,经限制性内切酶长度多态性分析, 4例确定为 F型, 3例为 E型, 2例为 D型。利用 373A自动序列分析仪,对 MOMP基因易变区 VS1、 VS2、 VS3、 VS4进行基因序列分析,与标准序列比较发现, 2例为 D型, 3例为 E型, 4例为 F型,与限制性内切酶长度多态性分析结果相同,但其中 4例有 MOMP基因变异存在。结论北京地区健康育龄妇女存在一定比例的沙眼衣原体感染,利用对 MOMP基因的多态性分析可以对沙眼衣原体的流行情况作出分析。     

人乳头瘤病毒11型早期蛋白E6和E7基因的克隆及序列分析

目的：从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒11型(HPV11)早期蛋白E6、E7基因，并进行序列测定及编码氨基酸序列分析，为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法：用PCR法，从CA标本中扩增出HPV11E6、E7基因，与载体pGEX-6P-1连接成重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7，酶切鉴定及双脱氧法测序观察其变异状况。结果：克隆出HPV 11早期蛋白E6、E7基因，成功构建重组质粒pGEX-6P-1／E6、pGEX-6P-1／E7。本研究克隆出的HPV11 E7基因与GenBank标准株序列完全相同，E6基因有两个位点的变化。结论：本研究克隆出的HPV11 E6、E7基因与标准株基本相同，这将为进一步研究E6、E7基因的表达、免疫活性及流行病学奠定基础。     

外阴鳞状上皮内瘤变皮损中人乳头瘤病毒16、18癌基因整合性研究

目的探讨人乳头瘤病毒(HPV)16、18在外阴鳞状上皮内瘤变(VIN)皮损中的感染和其癌基因在人基因组中的整合情况。方法采用捕获杂交法及PCR技术筛选高危型HPV和HPV16、18DNA阳性VIN标本：经RT-PCR、巢式PCR及DNA杂交研究HPV16、18 DNA阳性VIN标本中的HPV基因转录。结果 32例VIN患者皮损中24例(75%)为高危型HPV阳性,23例为HPV 16阳性,1例为HPV 18阳性。23例HPV 16阳性标本中除1例VIN Ⅱ皮损无HPV转录外,15份标本为游离体型HPV 16基因转录,其余7例VIN Ⅲ标本呈现整合型HPV 16癌基因转录；1例HPV 18阳性VIN Ⅲ标本发现为整合型HPV 18癌基因转录。结论大部分VIN Ⅱ、Ⅲ标本存在HPV 16感染,HPV癌基因的整合多发生于VIN Ⅲ的皮损；推测高危型HPV癌基因在人基因组中的整合与VIN的发生及其向外阴鳞状细胞癌的发展有关。     

中国致病格特隐球菌的基因亚型分析

目的 探讨中国致病格特隐球菌的基因亚型与世界范围内格特隐球菌的分子流行病学关系。方法 扩增受试格特隐球菌IGS1、PLB1和GEF1位点的部分可变区,检索GenBank上相应位点的序列信息,进行多位点的序列比对和系统发育分析。结果 ①我国VGⅠ基因型和α交配型菌株在3个位点的序列与以菌株WM276为代表的一种基因亚型相同,国内首株VGⅡ基因型和α交配型菌株的序列与温哥华岛致病株R272一致。②针对GEF1基因部分片段的聚类分析准确鉴定受试格特隐球菌的基因型和交配型。结论 中国致病格特隐球菌VGⅠ基因型与世界上分布较广的一种基因亚型相似,首株VGⅡ基因型菌株与温哥华岛致病性弱的VGⅡb基因亚型相似。     

宫颈癌标本中HPV16的E6、E7和LCR的变异研究

目的:探究分析E6、E7和LCR(long control region,LCR)在宫颈癌标本中HPV16中的变异情况。方法:随机选取我院病理实验室于2015年1月至2016年1月期间留存的HPV16阳性宫颈癌标本100例为研究对象,分别采用PCR技术进行E6、E7和LCR片段的扩增处理,并采用DNA序列进行PCR扩增产物的序列测定,分析E6、E7和LCR的变异表现。结果:E6基因中最常见变异为T350G(67.27%),E7基因中最常见变异为T789C(72.67%),LCR最常见变异为G7521A(90.90%),LCR区中出现G7799A、A7636C、C13T、C7678T新变异,E7区高度保守,YY1转录因子结合点是LCR变异的主要集中点。结论:宫颈癌标本中HPV16存在E6、E7和LCR变异情况,分析高危型HPV变异有助于宫颈癌HPV的早期诊断,可将其应用于宫颈癌防治的疫苗设计中,具有广泛的临床应用前景。     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。