退行性变椎间盘的细胞培养

背景：目前尚未见成熟的成年人退行性变椎间盘的细胞培养模型报道。 目的：采用组织块细胞培养法及酶消化细胞培养法进行成人退行性变椎间盘细胞培养的可行性。 设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验,于1998-12/1999-04在青岛大学医学院山东省创伤骨科研究所完成。 材料：5份标本来源于青岛大学附属医院骨科确诊为退行性椎间盘病变患者。 方法：①组织块法培养椎间盘细胞：将组织块剪碎至小于1 mm×1 mm×1 mm,牢固敷贴于培养瓶底壁上;第1份标本加入含青霉素100 u/mL,链霉素100 mg/L,体积分数为0.1的胎牛血清的HAMF12培养基,第18天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养。第2份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同。第50天用2.5 g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代。②酶消化法培养椎间盘细胞：将组织块剪碎加入2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化髓核30 min,离心去除上清液;消化的组织加入2 g/L的胶原酶,静止消化4 h;离心直至胶原酶完全清洗干净;取离心沉淀物置于培养瓶中：第1份标本加入足量的含青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L,含体积分数为0.1胎牛血清的HAMF12培养基,第10天培养基中胎牛血清的体积分数更换为0.2继续培养;第2,3份标本初始胎牛血清体积分数为0.2,其余条件与第1份相同。第50天用2.5 g/L的胰蛋白酶溶液对细胞进行消化传代。 主要观察指标：细胞的传代情况,细胞的形态学、超微结构观察。 结果：①在生长及增殖过程中,体积分数为0.2胎牛血清培养细胞增殖速度明显高于体积分数为0.1胎牛血清时的速度。②髓核软骨细胞多呈星形或多角形,细胞核偏于细胞的一侧而贴近细胞膜,来源于纤维环的成纤维细胞呈梭形,细胞核位于梭形细胞的正中央,细胞的纤丝较长。③来源于髓核组织的细胞透射电镜下可见两类形态、结构截然不同的细胞：脊索细胞和软骨样细胞。 结论：两种方法均能获得大量的退行性变椎间盘细胞,并成功地进行细胞传代。     

退变椎间盘的细胞培养

背景：目前尚未见成熟的成年人退行性变椎间盘的细胞培养模型报道,而此模型为建立椎间盘组织工程的细胞学基础。 目的：建立成人椎间盘细胞培养模型,奠定椎间盘组织工程研究的细胞学基础。 设计及地点：对比观察的细胞学实验,在山东省创伤骨科研究所完成。 材料：标本来源于青岛大学附属医院骨科5例确诊为退行性椎间盘病变患者。L2~3椎间盘1例,L4~5椎间盘3例,L5~S1椎间盘1例。 方法：对5例取自腰椎间盘突出症退变椎间盘的手术标本,采用系列酶消化法细胞培养和组织块细胞培养两种方法,应用HAMF12培养基加体积分数为10%和20%的胎牛血清分别进行了细胞培养,均获得了传代,并对培养细胞进行了光镜和电镜的形态学观察。 主要观察指标：①细胞生长状况。②光镜下细胞形态观察。③透射电镜超微结构观察。 结果：酶消化法和组织块法均能获得大量的退变椎间盘细胞,并成功地进行细胞传代。培养细胞的分泌物质可能对细胞的生长起一定的限制作用,去除该物质后细胞可迅速增生。但在细胞生长及增殖过程中,体积分数为20%胎牛血清下细胞增殖速度明显高于体积分数为10%胎牛血清时的速度。全部退变椎间盘标本中均发现了脊索细胞。 结论：成人退变椎间盘可以用来获得椎间盘组织工程所需的细胞。     

一种原代小胶质细胞培养与纯化方法的改良

目的建立一种简易高效的新生大鼠小胶质细胞的原代培养和纯化方法,提高小胶质细胞的产量以及纯度。方法在传统Miriam Mecha的混合胶质细胞培养方法的基础上通过改良操作,混合培养小胶质细胞,并分别采用手拍法、摇床法以及温和胰酶消化法,纯化小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化细胞。荧光显微镜下标记小胶质细胞的特异性标记物Iba1、CD11b/c进行鉴定。结果 (1)分离培养第1天小胶质细胞呈不规则圆形,折光不均匀,继续培养3~5 d,小胶质细胞逐渐出现单极或多极突起,7 d时部分细胞转为静止状态,呈分枝状;(2)纯化后小胶质细胞多呈静息状态,细胞免疫荧光CD11b/c、Iba1双阳性;(3)不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示:手拍法纯化小胶质细胞,细胞阳性率(96%)明显高于胰酶消化法(90%,P0.05),前者细胞产量明显高于摇床法(P0.05)。结论通过改良传统Miriam Mecha的混合小胶质细胞的培养和纯化方法,可以提高小胶质细胞产量以及纯度。     

酶联免疫斑点(ELISPOT)技术的应用(讲座)

此文重点介绍近年来建立起来的另一酶免疫分析技术——酶联免疫斑点 (ELISPOT)技术的基本原理及操作步骤 ,并结合作者实验室多年来的应用经验总结了其优缺点及实验操作中应注意的问题     

大鼠海马胶质细胞培养牵张损伤模型的建立

目的 建立大鼠海马胶质细胞培养牵张损伤模型.方法 提取出生时间24h到48h的SD大鼠海马组织行星形胶质细胞培养,采用CIC Ⅱ型细胞损伤装置、根据Ellis方法建立改良的大鼠海马胶质细胞体外牵张损伤模型,损伤程度分轻、中、重三级.对照组不予损伤.分别在2h和24h检测细胞乳酸脱氧酶释放量,并通过碘化丙啶荧光染色观察细胞损伤情况.结果 细胞培养液中乳酸脱氧酶释放量随着损伤程度加重而增高.PrI红染细胞数随着牵张损伤的程度增高而增加.结论 本实验建立的牵张损伤模型使用方便,可重复性好,适于进行神经细胞机械件体外损伤的研究.     

马氏珠母贝外套膜组织细胞体外培养技术改进及角质细胞生长因子在细胞培养中的应用

背景: 关于消化外套膜组织获得的细胞悬液是否能在体外有效地扩增形成珍珠囊以及最终形成珍珠仍存在争议，且这方面研究不多。 目的：建立一套有效的马氏珠母贝外套膜组织细胞体外分离及培养的技术和方法，同时探讨体外形成具有完整结构和分泌功能的珍珠囊并最终生成优质珍珠的最佳方法。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2008-08/12在广西中医学院基础医学院完成。 材料：贝龄1.0~2.0岁马氏珠母贝由广西北海市营盘珍珠实业有限公司提供，自配改进的海水贝类平衡盐溶液(MWBSS)；自制珍珠贝血清和珍珠贝体液；角质细胞生长因子为美国Sigma公司产品。 方法：使用2.5 g/L胰蛋白酶消化马氏珠母贝外套膜组织，收获的细胞使用M199(含体积分数10%胎牛血清)培养基进行培养，并在其中加入10 μg/L的角质细胞生长因子、10%自制的珍珠贝体液和贝血清，持续培养30 d。 主要观察指标：细胞生长特性和生长状态。 结果：体外培养的珍珠外套膜上皮细胞增殖迅速，分泌功能旺盛，肌肉细胞增殖能力强，并最终能包裹外套膜上皮细胞，形成结构较完整、分泌能力较强的珍珠囊。 结论：使用改进的培养技术和培养体系中添加角质细胞生长因子在体外培养珍珠外套膜组织细胞，可获得生长状态和分泌功能均较好的珍珠囊。     

小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立

目的获得纯度较高的脊髓源性星形胶质细胞。方法采用小鼠脊髓神经胶质细胞的原代培养和传代培养。无菌条件下取生后1～3dICR(Institute of Cancer Research)小鼠的脊髓,剪碎后胰酶分次消化,结合机械吹打使细胞分散,制成单细胞悬液,接种于无底物黏附的玻璃培养瓶中,置37℃,5%CO2培养箱中培养。培养液为DMEM/F12混合培养液。培养9～12d待细胞达到80%～90%融合后进行摇床纯化,舍弃含脱落细胞的细胞悬液,以去除少突胶质和小胶质细胞,继续培养,待细胞铺满瓶底后传代,并对传代细胞进行形态观察和星形胶质细胞的免疫荧光鉴定,GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可高达98%。结果通过恒温振荡和传代后得到了形态典型,含量较高的脊髓源性星形胶质细胞。结论用无底物贴附,恒温振荡和传代方法可获得高纯度脊髓源性星形胶质细胞。     

神经元拥有具生物学活性的细胞集落刺激因子受体

巨噬细胞集落刺激因子(CSF-1)对神经元的保护和／或营养作用已有报道，但CSF-1如何对神经元实施作用尚不十分清楚。此文拟通过检测与CSF-1共孵育后神经元表面CSF-1的存在，证明神经元表面CSF-1受体(CSF-1R或clms)具有生物学活性，以说明CSF-1通过与神经元表面相应受体结合可能是其实施神经元保护作用的机制之一。     

糖皮质激素受体检测的临床免疫学应用(讲座)

糖皮质激素受体 (GR)是糖皮质激素生理和药理作用的介导者。此文对 GR作用、检测方法和意义做一介绍     

人正常椎间盘髓核细胞体外不同培养代次的生物学性状分析：适应于组织工程椎间盘种子细胞的选择**

背景：目前用作组织工程椎间盘研究的种子细胞主要来源于体外培养的髓核细胞,而体外培养的髓核细胞传至一定代次后即出现老化现象,老化的细胞失去生长能力不适于组织工程研究。 目的：比较不同代次正常髓核细胞的形态学、增殖特性以及细胞的主要细胞外基质成分基因表达情况。 方法：以酶消化法分离、培养人正常椎间盘髓核细胞,对不同代次髓核细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用XTT实验检测不同代次细胞间的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原及糖胺多糖mRNA表达。 结果与结论：传3代之前细胞形态饱满,胞浆丰富,细胞呈多角形、短梭形,细胞内细胞器丰富,形态正常,线粒体含量少,核糖体含量多,说明细胞代谢旺盛,增殖能力强,生长曲线和XTT实验也提示传3代之前髓核细胞活性高,增殖能力强,细胞活力高,细胞外基质分泌旺盛。从传4代起,部分细胞形态逐渐向长梭形演化,逐渐表现为成纤维细胞的形态,说明细胞开始出现“返祖”现象,也称为老化现象,细胞的生长趋缓,传六七代后细胞均表现为长梭形,粗面内质网扩张,线粒体增多,细胞活力降低,细胞外基质明显减少,生长处于停滞状态。实验结果提示,体外培养条件下,人髓核细胞前3代细胞形态良好,增殖能力强,适合作为组织工程椎间盘的种子细胞,而细胞传4代后增殖能力逐渐减弱,不宜作为组织工程椎间盘的种子细胞。     

人早孕绒毛滋养层细胞原代培养：差异贴壁法与消化排除法联合应用的可行性

背景：国内外有关人绒毛膜滋养层细胞的体外培养方法,大多步骤繁琐,细胞纯度低而且成本很高,不适于普通实验室推广应用。 目的：拟求建立一种人妊娠5~10周绒毛滋养层细胞简便有效的分离培养及鉴定方法。 方法：采用改进的胰酶消化法分离培养妊娠5~10周人绒毛滋养层细胞,加0.062 5%胰酶,37 ℃消化25~40 min;以差速贴壁法和消化排除法纯化细胞,倒置显微镜观察细胞形态,细胞免疫化学方法鉴定细胞来源和纯度。 结果与结论：倒置显微镜下原代培养滋养层细胞接种后见大量圆形细胞悬浮存在,1 h后可见部分细胞贴壁,24 h后70%~80%细胞贴壁,五六天细胞数量明显增多,细胞呈三角形、多边形平铺片状生长,核大卵圆形居中,部分细胞连接成片,部分细胞呈长梭形。七八天长满瓶壁的80%~90%可传代。9~10 d铺满培养瓶底部。细胞碎屑不贴壁。传代接种后1.5h贴壁,迅速增长,三四天爬满瓶底,各代细胞形态基本一致。可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达70%~80%。采用低浓度胰酶进行长时间消化分离培养人早孕绒毛滋养层细胞,利用差异贴壁法和消化排除法以及反复换液法进行纯化,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养层细胞。     

体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞的生物学性状比较：可以为干预退变髓核细胞提供最佳时机吗？

背景：人体椎间盘是一个承受载荷却又缺乏血管的结构,因而容易发生退行性变,但椎间盘退变的机制尚不明确。 目的：通过体外培养人正常椎间盘髓核细胞与退变髓核细胞生物学性状比较,认识退变髓核细胞的细胞学退变时机。 方法：分离、培养人正常及退变椎间盘髓核细胞,对两种细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,采用生长曲线和XTT实验研究两种细胞的生长动力学差异,测定髓核细胞的活力和细胞Ⅱ型胶原及糖胺多糖的mRNA表达。 结果与结论：退变椎间盘细胞至少要比正常椎间盘细胞提前2代出现形态学老化表现。退变髓核细胞表现为G1期阻滞,使细胞不能进入S期,细胞有丝分裂受到抑制。退变髓核细胞总体来说,生长要比正常髓核细胞快,但老化也较快。退变髓核细胞自第1代开始,Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达比同期正常髓核细胞低得多。说明在体外培养条件下,退变髓核细胞持续增殖能力低,更容易衰老、凋亡。提示退变髓核细胞体外培养衰老较快,进行干预试验逆转椎间盘退变的最佳时机为传2代之前的细胞。     

胶质母细胞瘤肿瘤干细胞的分离培养与生物学特性研究

目的从人脑胶质母细胞瘤中分离培养脑肿瘤干细胞（brain tumorstem cells,BTSC）,并研究其生物学特性。方法利用无血清培养基和悬浮培养方法,从6例人胶质母细胞瘤标本中分离培养BTSC,并通过单克隆形成实验观察脑肿瘤干细胞球（brain tumor sphere,BTS）的形成过程。将BTSC接种于含血清培养基,观察其在体外的分化特点。将BTSC子代分化细胞更换培养条件,观察其在无血清培养基中的逆向分化现象。应用细胞免疫荧光染色对BTSC及其分化细胞进行鉴定。结果在人胶质母细胞瘤中成功分离出BTSC,其在无血清培养基中呈悬浮球状生长,具有很强的自我更新和增殖能力;免疫荧光显示其表达CD133。BTSC在含血清培养基中发生贴壁分化。分化后的子代细胞可表达CD133、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。BTSC子代分化细胞在无血清条件下培养,能够再次增殖形成BTS,呈逆向分化现象。结论人胶质母细胞瘤中存在BTSC,其具有自我更新、无限增殖、多向分化以及逆向分化等生物学特性。     

神经内窥镜的临床应用(48例报告)

目的总结应用神经内窥镜治疗病人的结果.方法对48例病人进行回顾性研究,分析手术指征、方法和并发症等.结果本组除一例侧裂蛛网膜囊肿外,治疗均有效.本组无死亡、颅内出血或感染病例.并发症最常见的为术后发热,其次为颅内积气.其中有一例动眼神经一过性麻痹.结论神经内窥镜是一种治疗颅内某些囊性病变和颅内血肿的有效而安全的微侵袭技术,要求适当选择适应证和掌握神经内窥镜手术的基本原则和操作方法.     

胚胎发育不良性神经上皮瘤的临床病理特征(附1例报告)

目的 探讨胚胎发育不良性神经上皮瘤(DNT)的临床病理特征.方法 回顾性分析1例DNT患者的临床资料.结果 本例为青年男性,首发症状为发作性肢体抽搐伴意识障碍.MRI显示颞叶T1WI低信号,T2WI高信号,无水肿及占位效应.病变由多结节特异性胶质神经元和微囊细纤维黏液性基质等成分组成,肿瘤细胞主要有神经元、少突胶质样细胞(OLC)和星形细胞3种成分,伴有皮质发育不良.免疫组织化学结果为神经元及部分OLC呈神经核抗原、神经突触素、神经元特异性烯醇化酶阳性表达;OLC呈S-100蛋白阳性表达;星形细胞呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达;瘤细胞Ki-67阳性率为1％.结论 DNT好发于儿童和年轻人,部分患者有慢性癫痫病史.DNT的组织学特征是神经胶质及神经元成分.     

视诱发电位(VEP)临床应用价值——(附230例报告)

<正> 近几年来,随着电计算机技术的发展,视觉系统电生理的研究和应用也有很大的发展。我院借助于日产Neuropack-2MEB-5100型诱发电位仪,对230例视诱发电位(Visual evoked potential VEP)进行病例分析,从而得出其临床应用价值。     

再谈临床危急值的应用

1 危急值的定义 检验危急值,就是当这种异常检验结果出现时,说明患者可能正处于有生命危险的边缘状态,此时如能给予及时、有效的治疗,患者生命可以得到挽救或有效的改善.否则,有可能出现病情加重和严重后果,因为这是一个危及生命的检验结果,所以把这种检验数值称为危急值.     

神经生长因子(恩经复)临床应用专家共识

神经元损伤后难以再生,神经自身再生修复能力有限.临床上,神经系统不可逆性损伤一直缺乏有效治疗手段.传统的神经保护剂在一定程度上只能保护未损伤的组织,通过未损伤组织的代偿而恢复部分功能,却不能使受损的神经组织再生,重建神经元功能.因此,作为能直接促进神经损伤修复和再生的治疗药物,神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)的临床应用近年来日益受到国内外神经科学界的密切关注.随着循证医学证据的不断增加,国内神经内科、神经外科、骨科、儿科等相关领域的专家达成了专家共识,以期为NGF的临床应用提供依据.