一种能与Fas结合的融合型九肽生物学活性分析

目的鉴定从噬菌体随机肽库筛选所获得的融合型多肽3A8的生物学活性。方法制备融合型多肽3A8，经纯化，采用ELISA检测融合型多肽3A8对Fas．Fc的特异性结合；细胞ELISA检测3A8能否与Jurkat细胞表面天然Fas受体结合；^3H-TdR掺入法检测3A8对Jurkat细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡。结果ELISA结果显示融合型多肽能与Fas．Fc特异性结合，呈浓度剂量依赖关系。细胞ELISA实验证实3A8能与Jurkat细胞表面Fas受体结合。^3H—TdR掺入法检测发现3A8可抑制Jurkat细胞增殖，抑制率为50％。经3A8处理细胞经PI染色流式细胞仪分析，发现25．41％的Jurkat细胞发生凋亡，明显高于未经处理的对照组。结论从噬菌体随机肽库获得的融合型多肽3A8能与Jurkat细胞表面受体Fas结合，诱导细胞凋亡。     

利用噬菌体随机肽库筛选IL-5结合的相关多肽

目的：采用噬菌体随机肽库筛选人IL-5，以获得能高亲和力结合IL-5的相关多肽。方法：以重组人IL-5作为筛选分子，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选。经过三轮淘筛后，经夹心ELISA、竞争ELISA法进一步鉴定噬菌体克隆与IL-5的亲和力，对阳性克隆进行了扩增和DNA测序，据此推导结合随机多肽的氨基酸序列。结果：经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL-5呈高亲和力结合。通过测序和序列比较分析，发现CX1-2AS为相对保守的结合表位。结论：研究表明通过噬菌体肽库能够筛选到IL-5结合的相关多肽，为进一步研究IL-5结合表位及抑制剂奠定了基础。     

登革2型病毒E蛋白免疫优势表位的筛选鉴定

目的 用噬菌体展示肽库筛选登革2型病毒(DEN2)E蛋白的抗原表位，并确定该抗原表位性质。方法 以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子，生物淘洗噬菌体随机12肽库，将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导，通过噬菌体展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比，初步确定E蛋白的抗原表位；用模拟该表位线性序列的合成十肽进行抗体结合试验、噬菌体竞争抑制试验及与DEN感染患者的血清学试验，确定其为免疫优势线性表位。结果 肽库淘洗获得的11个ELISA阳性的噬菌体克隆有相似的结构基序WFKKGSS，其展示肽与DEN2E蛋白390～398 AA序列有3～5个氨基酸相同。对应于DEN2E蛋白390～399AA的合成十肽能与淘洗单抗特异反应，并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。该合成肽与DEN2感染患者血清有较高的免疫反应性。结论 本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定的DEN2E蛋白(E390～398AA)线性序列为免疫优势表位，其对应的合成肽E10可望用于DEN2感染的快速诊断。     

应用噬菌体展示肽库筛选生殖支原体黏附蛋白的模拟表位

目的 利用纯化的兔抗重组生殖支原体黏附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb)从噬菌体展示随机12肽库筛选MgPa的模拟表位.方法 用纯化的兔抗rMgPa的pAb对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆进行DNA测序与分析,并用MIMOX对噬菌体克隆所展示的肽序列进行生物信息学分析.用ELISA、竞争性结合试验和Western blot检测噬菌体与pAb结合的特异性.结果 4轮生物淘洗后特异性噬菌体克隆得到了明显的富集.依据氨基酸组成的不同,74个噬菌体克隆所展示的肽序列可大致分为3组.经对肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析,结果表明这3组的核心序列分别为:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P、A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA、竞争性结合试验和Western blot方法检测的结果表明噬菌体能与pAb发生特异性结合,说明其可能是MgPa的模拟表位.结论 成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为研制基于Mg抗原表位的诊断试剂与多肽疫苗奠定了一定的实验基础.     

利用体内噬菌体展示技术筛选及鉴定肺癌特异性结合肽

目的利用体内噬菌体展示技术筛选并鉴定与肺癌特异性结合的多肽。方法用肺癌细胞A549接种裸鼠复制荷瘤动物模型,将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min后取肿瘤组织中结合的噬菌体,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,ELISA初步鉴定噬菌体克隆对肺癌细胞的亲和力、特异性。将阳性噬菌体克隆扩增、测序获得外源多肽氨基酸序列,化学方法合成多肽,鉴定多肽对肺癌细胞和组织的亲和力、特异性。结果ELISA结果显示,随机挑选的20个噬菌体单克隆中,1个对A549具有很强亲和力。测序获得多肽,命名为zp2。化学合成多肽zp2。竞争抑制、细胞免疫荧光和组织免疫荧光实验结果表明多肽zp2与肺癌细胞A549及肺癌组织特异性结合。结论利用体内噬菌体展示技术筛选出与肺癌细胞A549特异性结合的多肽,为肺癌诊断及治疗药物的研制奠定基础。     

麻痹性贝类毒素GTX2,3模拟表位的初步研究

目的:利用噬菌体展示随机肽库筛选可模拟麻痹性贝类毒素GTX2,3抗原表位的噬菌体,初步鉴定人工合成的GTX2,3抗原表位肽的特异性。方法:以抗麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体(mAb)为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行3轮免疫亲和筛选,以夹心ELISA方法鉴定噬菌体克隆,竞争ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的特异性。对阳性克隆进行DNA测序并推导噬菌体所展示的氨基酸序列。竞争ELISA鉴定模拟GTX2,3表位的合成肽的特异性。结果:经过3轮筛选获得20株能与靶分子高亲和力结合的阳性噬菌体克隆。序列分析表明DXLXPP为保守序列(X为任意氨基酸)。竞争ELISA检测表明,麻痹性贝类毒素GTX2,3可抑制阳性噬菌体克隆phage2与抗GTX2,3mAb结合。根据阳性序列合成的短肽可以抑制phage2与抗GTX2,3mAb的结合(IC50=13μg/mL)。结论:通过噬菌体肽库筛选技术,成功地获得麻痹性贝类毒素GTX2,3的模拟表位,并初步证实以此为基础合成的短肽能够准确和特异的模拟GTX2,3的表位。     

从噬菌体随机肽库中筛选拮抗IL-5的抑制多肽

目的　通过噬菌体随机肽库筛选与白细胞介素 5 (IL 5 )高亲和力结合的相关多肽 ,观察这些多肽是否能够抑制IL 5的生物功能。方法　以重组人IL 5作为筛选分子 ,应用M13噬菌体PⅢ呈现随机 7肽库进行筛选 ,经ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与IL 5的亲和力。阳性噬菌体克隆呈现多肽和人工合成多肽对IL 5介导的嗜酸细胞 (Eos)存活的影响。结果　经过 3轮淘筛后 ,经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL 5呈高亲和力结合 ,其中 3个具有抑制IL 5介导的Eos存活延长作用。选择抑制作用最强的呈现多肽进行人工合成 ,发现其中一个合成多肽能够诱导Eos凋亡 ,抑制IL 5介导的存活延长作用 ,但作用强度不如噬菌体呈现多肽。结论　通过噬菌体肽库能够筛选到抑制IL 5功能的相关多肽 ,为进一步研究抗IL 5的分子药物奠定了基础。     

胃癌相关抗原表位模拟短肽的筛选

目的：筛选能模拟胃癌相关抗原表位的功能短肽。方法：利用离子交换层析，对抗胃癌相关抗原单克隆抗体(mAb)进行纯化，并以此mAb为靶标，将其包被于ELISA板上，以噬菌体随机12肽库对其进行3轮亲和筛选。结果：从噬菌体随机12肽库中，筛选到12个噬菌体阳性克隆：结论：获得了具有模拟胃癌相关抗原表位的阳性噬菌体克隆，且有共同的基序。     

从噬菌体随机肽库筛选CD137结合肽

目的应用噬菌体随机七肽库筛选与人CD137特异结合的肽序列。方法以重组人CD137作为筛选分子，对噬菌体展示随机七肽库进行亲和淘选。经过5轮淘选后，共随机挑选23个噬菌斑并对其进行了扩增和测序，据此推导随机多肽的氨基酸序列。经夹心ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与CD137的结合力。^3H-TdR法检测了噬菌体展示多肽对抗CD137Ab刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应影响。结果5轮淘选所得的噬菌体回收率逐步提高，显示淘选过程对随机肽库有一定的富集效果。通过对阳性克隆的测序和序列比较分析，得到RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF的相似序列和与CD137L具有同源SRS序列的SRSRVRY、HRRPSRS肽序列，ELISA结果显示这5个克隆都有良好的与CD137的结合力。RPTQGAF、RPTQVAL、RPTQVAF和SRSRVRY4个噬菌体展示肽均能在体外抑制抗CD137Ab刺激的淋巴细胞增殖反应。结论通过对噬菌体随机肽库的淘选，得到与CD137结合的相关多肽，为进一步研究CD137与配体结合的特异性位点及其拮抗性多肽药物设计提供了实验依据和结构基础。     

从噬菌体构象型7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽

目的 :从噬菌体构象型 7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽。方法 :用重组人BLyS筛选噬菌体构象型 7肽库 ,用间接ELISA、竞争ELISA和细胞增殖活性试验鉴定噬菌体克隆。结果 :经过 3轮亲和筛选 ,噬菌体的回收率增加 ,阳性克隆得到富集。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制BLyS刺激细胞增殖的活性。结论 :获得了噬菌体呈现的能够抑制BLyS的两个短肽。     

应用噬菌体肽库技术获得与猪鼻支原体蛋白P37结合的多肽序列

本研究以猪鼻支原体P37蛋白作为筛选分子,对噬菌体展示随机肽库进行亲和淘选。利用ELISA法鉴定亲和力高的阳性噬菌体克隆,对其进行DNA测序和分析,据此推导随机多肽的氨基酸序列,然后构建、表达GST-多肽重组蛋白,经GST-pull down进一步鉴定该多肽与P37的结合力。经过4轮筛选和单克隆检测,获得18个有较强特异反应的阳性克隆,18个克隆包括了5种不同的小肽序列,它们分别为ACAPKPPWLC(12/18)、RPLSIDP-WSPHL(3/18)、RPLSNDPWSPHL(1/18)、QNMMSPIEGVRI(1/18)和WAPEKDYMQLMK(1/18)。用ACAPK-PPWLC、RPLSIDPWSPHL与GST重组的融合蛋白进行GST-pull down实验表明,RPLSIDPWSPHL多肽能与P37相互作用。本研究为进一步筛选与P37相互作用的蛋白提供了实验依据和结构基础。     

用噬菌体肽库筛选IBDV单克隆抗体的模拟表位

目的:筛选法氏囊病毒(IBDV)单克隆抗体所针对的模拟抗原表位。方法:以纯化的3株IBDV单克隆抗体为靶分子用噬菌体12肽库筛选相应抗原模拟表位;应用间接和竞争ELISA鉴定所筛选的阳性样品;最后对与抗体高亲和结合的噬菌体进行测序分析。结果:经过四轮淘洗,随机挑取30个克隆经间接ELISA鉴定,发现其中22个克隆结合活性较高。进一步应用竞争ELISA,获得14个噬菌体克隆,其抑制率高达50%以上。对这些噬菌体进行DNA测序,并分析比对了IBDV相应序列,确定了3个抗原模拟表位。结论:通过噬菌体随机肽库成功筛选出3个IBDV模拟表位,为进一步研究IBDV抗原性质奠定了基础。     

用噬菌体随机肽库筛选刺激细胞生长的活性小肽

目的 筛选刺激NFS－60细胞生长的活性小肽。方法 以G－CSF依赖细胞系NFS－60为靶细胞，筛选随机6和15肽库，经3轮筛选后，随机挑取60个噬菌体克隆进行生物学活性和结合活性鉴定。结果 得到6个刺激NFS－60细胞生长的阳性噬菌体克隆。经细胞ELISA检测，这6个小肽都可与NFS－60细胞结合，并且这6个小肽与细胞结合的量，都与所加入的噬菌体的量成正比，经测序未找到共同序列。结论 从随机噬菌体肽库中筛到的活性小肽，可以模拟某些生长因子的活性部位，来刺激靶细胞的生长。     

Identification of mimotopes of platelet autoantigens associated with autoimmune thrombocytopenic purpura

GPIIb/IIIa, the human platelet glycoprotein complex, is the autoantigen most commonly recognized by autoantibodies in autoimmune thrombocytopenic purpura (AITP). Two murine monoclonal antibodies (mAbs), namely Y2/51 and 5B12, directed against gpIIIa and gpIIb/IIIa, respectively, and rabbit anti-human platelet polyclonal antibodies have been used to select AITP-related epitopes from a phage display peptide library expressing random dodecapeptides in the pIII coat protein of M13 phage. The selected phage clones were tested by ELISA for binding to rabbit anti-human platelet antibodies as well as to sera from AITP patients. Seven clones reacted strongly with rabbit anti-human platelet antibodies, and four clones reacted with sera from AITP patients. Some homology between peptide inserts sequences of selected clones and human platelet gpIIIa and gpIb were found.     

利用噬菌体肽库筛选HeLa细胞表面与人CD59结合的活性短肽

目的寻找HeLa细胞表面与人CD59特异性结合的短肽序列。方法分别用非转基因HeLa细胞和转染CD59基因的HeLa细胞的裂解蛋白进行5轮亲和筛选,并通过竞争结合实验,然后用ELISA方法筛选噬菌体阳性克隆。提取单克隆DNA测序,并对其进行DNA序列分析推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对HeLa细胞有特异性结合力,经测序得到一条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞蛋白筛选,得到了噬菌体多肽能高特异性与肿瘤细胞结合的短肽序列,为下一步设计肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供了参考依据。     

日本血吸虫病患者血清对噬菌体随机7肽库的免疫筛选

目的 从噬菌体随机多肽文库中,筛选出能与慢性血吸虫病患者血清特异性结合的短肽分子。方法 采用慢性血吸虫病患者血清球蛋白作为配基,免疫筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体Ｍ１３外壳蛋白Ⅲ表达的随机７肽文库。按吸附－洗脱－扩增的淘筛过程,经３轮免疫淘筛后,随机挑取菌体克隆用ＥＬＩＳＡ检测其牧场 划性,并用斑点ＥＬＩＳＡ分析其诊断血吸虫病的价值。结果 经３轮免疫淘筛后,特异性结合的噬菌体富集增加近１００倍,有     

噬菌体呈现抗体库的构建及抗Fas—Fab抗体的研究

目的构建噬菌体抗体库,获得具有功能的抗Fas-Fab噬菌体抗体。方法以Fas重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠。取其脾细胞提取mRNA,采用RT-PCR方法扩增抗体基因,构建重链和κ链基因库,用重组Fas抗原对所构建的抗体库进行4轮筛选,并以ELISA法鉴定其功能。结果获得抗体重链Fd基因和κ链基因长度约700bp。构建的重链Fd基因为3.5×106的抗体重链基因库。构建的重链和κ链基因库的容量均为3.1×106。经VCSM13感染得到噬菌体的滴度为8.9×1016cFu/L的噬菌体抗体库,含有抗体重链和κ链基因的噬菌体占27％。用重组人Fas抗原进行4轮筛选,得到100％的富集,说明Fas重组抗原富集了抗Fas-Fab噬菌体抗体,经ELISA检测均有抗Fas抗体的特异性。结论制备的可溶性抗Fas-Fab抗体具有抗Fas抗体的特异性,为进一步的研究奠定了基础。